GroEL/GroES fietsen: ATP bindt zich aan een open ring vóór het substraateiwit, wat eiwitbinding en productie van de natieve toestand bevordert

Results

Snelle ATP-binding aan GroEL zoals aangetoond door fluorescentie-intensiteitsveranderingen van GroEL F44C gelabeld met Oregon Green 488.

Om de binding van ATP door GroEL te controleren, hebben we ons gebaseerd op een eerder geproduceerde GroEL-variant, F44C, die een enkele cysteïne bevat in een anders “cysteïne-nul” versie van GroEL waarin alle 3 natuurlijke cysteïnen in de GroEL-subeenheid (aminozuren 138, 458 en 519) waren gesubstitueerd door alanine (21). Zoals geïllustreerd in fig. 1A, ligt F44 in een lus die omhoog wijst in de centrale GroEL-holte ter hoogte van het equatoriale domein, gepositioneerd tussen equatoriale antiparallelle β-strands aan de uiteinden waarvan zich residuen bevinden die waterstofbruggen vormen met het eindfosfaat van gebonden ATP via een watermolecuul en een kaliumion. De lus en residu 44 kunnen dus beïnvloed worden door de afwezigheid versus de aanwezigheid van ATP. Een eerdere studie meldde dat een F44W substitutie kon rapporteren over ATP binding (16). Hier hebben we de mutant F44C gebruikt, die eerder volledig functioneel bleek te zijn, zoals blijkt uit het vermogen van het coderende plasmide om de groei van een GroEL-deficiënte mutant te redden en uit het vermogen van het gezuiverde eiwit om efficiënte ATP/GroES-afhankelijke eiwit-omvouwing in vitro uit te voeren (21). F44C werd gelabeld met Oregon Green 488 (OG488)-maleimide tot een niveau van ≈70% bezetting. Het bleef volledig functioneel in het mediëren van hervouwing van malaat dehydrogenase (MDH) in vitro, vertonen kinetiek bijna identiek aan die van WT GroEL . De steady-state snelheid van ATP omzet door de gemodificeerde mutant, genaamd EL44-OG, leek ook op die van WT GroEL (Fig. S1B).

Fluorescentie-emissiespectra van EL44-OG (geëxciteerd bij 496 nm) toonde aan dat toevoeging van ATP produceerde een grote daling in steady-state fluorescentie-intensiteit (≈65% in 500 uM ATP), vergezeld van een kleine blauwe verschuiving van de emissie maximum (Fig. 1B). ADP daarentegen produceerde een kleinere daling van de intensiteit, wat ondersteunt dat het γ-fosfaat van ATP een specifiek effect heeft op de conformatie van de 44-bevattende lus.

Op stop-flow menging van 0,5 mM ATP met EL44-OG, werd een snelle daling van de emissie-intensiteit waargenomen, met een curve die kon worden gepast als de som van 2 exponentialen, een met een snelheidsconstante van ≈100 s-1 en een andere met een snelheidsconstante van 4 s-1 (Fig. 1C). De eerstgenoemde snelheid wijst op een snelle interactie van ATP met ongeligand GroEL en komt overeen met de eerder gerapporteerde snelheden voor zowel F44W (ref. 16; 80 ± 5 s-1) als voor 2 andere tryptofaan-gesubstitueerde versies van GroEL: Y485W, waarbij elders in het equatoriale domein een tryptofaan was gesubstitueerd (ref. 18; 123 ± 2 s-1), en R231W (ref. 17; 80 s-1), waar een tryptofaan was gesubstitueerd in het naar de holte gerichte aspect van het apicale domein (GroEL is verder verstoken van tryptofaan). Zoals verwacht was de snelheid van de interactie van ATP met EL44-OG afhankelijk van de ATP-concentratie (fig. 1D), en voor de snellere fase werd een bimoleculaire snelheidsconstante van 2 × 105 M-1 s-1 bepaald. De langzamere kinetische fase, eveneens afhankelijk van de ATP-concentratie, komt waarschijnlijk overeen met de derde fluorescente fase die werd waargenomen voor GroEL’s R231W en Y485W bij ATP-binding (17, 18). De mogelijkheid dat deze fase ATP-hydrolyse weerspiegelde, werd uitgesloten door een hydrolyse-defecte D398A/EL44-OG chaperonine te gebruiken.

Even snelle fluorescentieverandering bij ATP-binding aan open trans-ring van GroEL/GroES/ADP asymmetrisch complex.

Onder fysiologische omstandigheden is de normale acceptortoestand voor ATP de open trans-ring van een GroEL/GroES/ADP asymmetrisch complex. Met gestopt-flow mengen, zagen we dat de snelheid van ATP-binding aan de trans-ring van EL44-OG/GroES/ADP-complexen vergelijkbaar was met die aan een niet-gespannen GroEL-ring (Fig. 1E, vergelijk met Fig. 1F). Ook hier was er een ATP-concentratie-afhankelijkheid die leek op die van ongeligand EL44-OG (Fig. 1D).

Substraatpolypeptide gebonden aan de trans-ring beïnvloedt de snelheid van ATP-binding niet.

In een aantal in vitro studies is niet-natief polypeptide eerst gecomplexeerd aan de open trans-ring van een asymmetrisch ADP GroEL/GroES complex vóór toevoeging van ATP en een overmaat GroES (8, 9). Onder deze omstandigheden is ATP-binding, gevolgd door binding van GroES, duidelijk in staat het niet-natieve polypeptide in te kapselen en productief te vouwen. Wordt de snelheid van ATP-binding in een dergelijke context beïnvloed door het gebonden substraateiwit? Om dit te testen werd nonnatief MDH gebonden aan de asymmetrische EL44-OG/GroES/ADP complexen, en ATP werd vervolgens toegevoegd met stop-flow mixing. Onder deze omstandigheden was de snelheid waarmee de fluorescentie-intensiteit veranderde vrijwel identiek aan die van het EL44-OG/GroES/ADP-complex in afwezigheid van polypeptide (vergelijk Fig. 1G met Fig. 1E). De aanwezigheid van een niet-natief substraat gebonden aan de apicale transringdomeinen heeft dus geen aantoonbaar effect op de snelle intrede van ATP in de equatoriale nucleotidebindingszakken van de transring.

Rapid Apical Domain Movement Accompanies ATP Binding.

Wanneer ATP snel aan GroEL bindt, veroorzaakt dit dan een significante aanpassing in de apicale polypeptide bindende domeinen op dezelfde snelle tijdschaal, of zijn de apicale veranderingen als reactie op ATP binding relatief traag, zodanig dat de effecten van ATP binding moeten worden beschouwd als optredend op een later tijdstip? Uit de eerdere studie van R231W was al gebleken dat apicale effecten snel optraden bij die mutant (17). Ook in de huidige studie vertoonde een fluorescente probe aan de buitenzijde van de apicale domeinen, ver verwijderd van de ATP-bindingsplaats aan de binnenzijde van de cilinder (GroEL E315C in een cysteïne-nul achtergrond gelabeld met OG), een snelle verandering in fluorescentie-intensiteit, op dezelfde tijdschaal als ATP-binding. Bijvoorbeeld, een snelheidsconstante van 20 s-1 werd waargenomen voor een GroEL315-OG/GroES/ADP asymmetrische complex bij een ATP concentratie van 150 uM (Fig. 1H, vergelijk met 25 s-1 in Fig. 1E). Dergelijke apicale veranderingen traden op in dezelfde ring waaraan ATP gebonden is, omdat analyse van een OG-gemodificeerde enkel-ring versie van E315C, SR315-OG, een vergelijkbare snelheid van fluorescentie-intensiteitsverandering liet zien (Fig. 1I). De snelheid van apicale beweging was ook ATP-concentratie-afhankelijk, waarbij de snelheden parallel liepen met die van ATP-binding (Fig. S2, vergelijk met Fig. 1D).

Ratief langzame binding van substraatpolypeptide zoals gemeten door FRET.

Om een vergelijking van de bindingssnelheid van niet-natief substraatpolypeptide met die van ATP-binding mogelijk te maken, maten we vervolgens de bindingssnelheid van substraateiwitten aan asymmetrische GroEL/GroES/ADP-complexen met behulp van FRET. Drie verschillende substraateiwitten werden bestudeerd: MDH (33 kDa), Rubisco (51 kDa), en een dubbel gemuteerde vorm van maltose bindend eiwit (DM-MBP; 41 kDa). Alle 3 eiwitten gedragen zich bij 25 °C als stringente substraateiwitten, die de aanwezigheid van GroEL, GroES en ATP nodig hebben om hun natieve vorm te bereiken (3). In hun afwezigheid, kwantitatieve aggregatie volgt. Voor het toezicht op binding, FRET werd gemeten tussen substraateiwit gelabeld met cumarine propyl maleïmide (CPM; donor) op een cysteïneresidu (zie Materials and Methods) en EL44-OG (acceptor). Exciteren bij de excitatie maximum voor CPM (384 nm), werden emissiespectra verzameld voor de CPM (donor)-gelabelde substraten terwijl gebonden aan ongelabelde GroEL (Fig. 2A, DM-MBP-CPM als voorbeeld, zwart spoor), voor EL44-OG gecomplexeerd met ongelabeld substraat (Fig. 2A, acceptor gelabeld, blauw spoor), of voor complexen met CPM-gelabeld substraat gebonden aan EL44-OG (Fig. 2A, rood spoor). Voor zowel DM-MBP-CPM als MDH-CPM was er sterke donordoving bij associatie met EL44-OG; tegelijkertijd was er het verschijnen van een aanzienlijk acceptorsignaal.

Op gestopt-flow mengen van 125 nM DM-MBP-CPM met 125 nM EL44-OG, werd een daling van de donor emissie-intensiteit waargenomen, met een curve die kon worden fit als de som van 2 exponentialen, een met een snelheidsconstante van 1,33 s-1 en de andere met een snelheidsconstante van 0,65 s-1 (Fig. 2B). De snellere snelheid (k1) was afhankelijk van de concentratie chaperonine (Fig. 2C), maar de langzamere niet. Bij een GroEL-concentratie van 125 nM (Fig. 2B) is de bindingssnelheid van het substraatpolypeptide (k1 = 1,33 s-1) 60-maal trager dan de bindingssnelheid van ATP (100 s-1 bij 500 μM ATP; Fig. 1C). Hoewel de bindingssnelheid van het substraat bij een fysiologische GroEL-concentratie van 1-2 μM (fig. 2C) naar verwachting een veelvoud zou bedragen, zou de ATP-bindingssnelheid waarschijnlijk ook iets groter zijn, aangezien de fysiologische ATP-concentratie enkele millimolair is (fig. 1D). Aldus is de snelheid van ATP aankomst onder fysiologische omstandigheden is waarschijnlijk ten minste 10-voudig groter dan substraat aankomst.

In een verdere test, de toevoeging van ATP op hetzelfde moment als fluorescent gelabeld DM-MBP had een reproduceerbaar effect van het verhogen van de snelheid van DM-MBP binding (Fig. 2D en tabel S2). Kortom, de fysiologische volgorde van toevoeging aan een trans-ring lijkt te bestaan uit een snelle aankomst van ATP, gevolgd door een langzamere aankomst van het substraat eiwit. Deze volgorde is tegengesteld aan die geprogrammeerd in recente studies, waar polypeptide werd in eerste instantie gebonden aan de trans-ring en ATP werd vervolgens toegevoegd (8, 9). Heeft de volgorde van toevoeging een meetbaar effect op de hervouwing van het substraateiwit? Om dit te testen, hebben wij volgorde-toevoegingsexperimenten uitgevoerd en het herstel van het natieve enzym gemeten onder hoofdzakelijk single-turnover-condities.

Extensiever herstel van de natieve toestand wanneer ATP eerst wordt toegevoegd, gevolgd door polypeptide, vergeleken met de omgekeerde volgorde.

Een volgorde-toevoegingsexperiment werd uitgevoerd met de single-ring-versie van GroEL, SR1, waardoor “single-ronde” analyse mogelijk werd. Polypeptide gevangen door SR1 is bijna kwantitatief gevouwen tot natieve vorm, na binding van GroES, binnen de langlevende cis holte van het stabiele SR1/GroES complex (10, 11). Dus, SR1 kan worden geïncubeerd met ATP en niet-natief polypeptide in beide volgorde, gevolgd door toevoeging van GroES, en de mate van herstel van natief eiwit kan worden gemeten in relatie tot zowel de volgorde van toevoeging en het interval tussen de toevoegingen (Fig. 3A). Voor deze tests werd GroES toegevoegd 2 sec na ATP / polypeptide om de voltooiing van de eerste interacties mogelijk te maken. In een eerste experiment, we reproduceerbaar waargenomen dat wanneer niet-native Rubisco werd eerst toegevoegd, gevolgd 2 sec later door ATP, de mate van Rubisco herstel in natieve vorm was slechts ≈30%. Dit in vergelijking met >60% herstel wanneer ATP eerst werd toegevoegd en met de ≈70% herstel waargenomen wanneer ATP en GroES werden toegevoegd aan een voorgevormd binair Rubisco-SR1-complex (geproduceerd door een 10-minuten incubatie van nonnatieve Rubisco met SR1). Dit suggereert dat in de context van een cyclische reactie waarbij de trans-ring van een acceptor GroEL/GroES/ADP-complex slechts ≈1-2 s open en beschikbaar is voor binding van polypeptide voordat GroES bindt, de mobilisatie van zijn apicale domeinen door snelle ATP-binding de binding van nonnatief polypeptide bevordert. De omgekeerde volgorde, toevoeging van polypeptide 2 s voor ATP, bleek minder gunstig voor binding, ook al ATP gemobiliseerde apicale domeinen waren vervolgens beschikbaar voor 2 s voor GroES toevoeging. Met name wanneer het interval tussen de toevoeging van Rubisco en ATP werd vergroot tot 4 s (Fig. 3A), werd het effect van de volgorde van toevoeging opgeheven, waarbij de kinetiek en de mate van herstel nu gelijk waren aan die van de eerste toevoeging van ATP, vermoedelijk een functie van een uitgebreidere binding van het polypeptide in het interval vóór de ATP-toevoeging. Hoewel de mate van herstel van Rubisco in de volgorde-van-toevoeging studies met een 2-s interval aanzienlijk werd beïnvloed, was de kinetiek van herstel van de natieve toestand binnen de stabiele SR1/GroES complexen vergelijkbaar, consistent met een effect op substraat eiwit binding en niet op de vouwsnelheid in de ingekapselde kamer.

Versterkte binding van Rubisco wanneer eerst ATP wordt toegevoegd.

Om het effect van de volgorde van toevoeging op substraateiwitbinding te onderzoeken, gebruikten we 35S-gelabelde Rubisco en maten we de hoeveelheid die door SR1 werd gebonden tijdens de volgorde van toevoeging incubaties met behulp van gelfiltratie van de eindproductmengsels om de stabiele SR1/GroES/Rubisco complexen te scheiden van ongebonden polypeptide. Hieruit bleek dat ≈10.000 cpm 35S-Rubisco had gebonden wanneer 40.000 cpm 35S-Rubisco (125 nM) werd toegevoegd 2 sec voor ATP en dat ≈30.000 cpm had gebonden wanneer ATP werd toegevoegd 2 sec voor Rubisco (Fig. 3B). De laatste mate van binding werd ook bereikt wanneer SR1-Rubisco binaire complexen gevormd over een periode van 10 min werden vervolgens geïncubeerd met ATP en GroES samen (Fig. 3B). Deze metingen van de mate van substraatbinding dus parallel de mate van herstel van enzymatische activiteit (vergelijk Fig. 3B met Fig. 3A) en ondersteunen de conclusie dat in de context van een 2-s interval tussen de toevoeging van ATP / polypeptide, de toevoeging van ATP in eerste instantie efficiënter substraat eiwit binding bevordert.

Grote snelheid van binding van Rubisco aan een ATP-blootgestelde chaperonine-ring.

De voorgaande waarneming van een grotere mate van binding van Rubisco in een volgorde-experiment waarbij ATP aanvankelijk wordt toegevoegd, suggereert dat de snelheid van associatie van Rubisco met ATP-mobiliserende apicale domeinen groter zou kunnen zijn. Om dit te testen werd een ATP-hydrolyse-defecte D398A versie van SR1 met OG bevestigd aan een cysteïne gesubstitueerd op positie 44 (in een C138A achtergrond) gebruikt om door FRET te rapporteren over de bindingssnelheid van CPM-gelabelde Rubisco (Fig. 3 C-E). Wij hebben waargenomen dat de bindsnelheid van Rubisco, uitgevoerd onder dezelfde omstandigheden als de voorgaande volgorde-experimenten, 2-voudig hoger was in aanwezigheid versus afwezigheid van ATP (vergelijk Fig. 3D met Fig. 3C). Wanneer ATP en niet-natieve Rubisco gelijktijdig werden toegevoegd, wat overeenkomt met de fysiologische situatie, leek de snelheid van Rubisco-binding op die wanneer ATP vóór Rubisco was toegevoegd (Fig. 3E, vergelijk met Fig. 3D). Deze gegevens ondersteunen dat Rubisco sneller associeert met een ring waarvan de apicale domeinen ATP gemobiliseerd zijn en dat, onder fysiologische omstandigheden waarin zowel ATP als niet-natief substraat aanwezig zijn, het de ATP gemobiliseerde apicale domeinen zijn die actief zijn bij de substraatbinding.