Frontiers in Immunology

Dit overzicht is opgebouwd rond twee figuren in tabelvorm, waarvan de ene de NMDAR1 autoantilichaam (AB) bevindingen samenvat en integreert in een verklarend model (Figuur 1) en de andere duidelijke aanbevelingen tracht te geven voor het klinisch beslissingsproces over immunosuppressieve behandeling op basis van de huidige stand van de kennis (Figuur 2).

Let op dat de nieuwe nomenclatuur GluN1 voor NMDAR1/NR1 hier wordt genegeerd voor consistentie met de meeste van de respectieve reviewed literatuur.

NMDA Receptoren in Hersenen en Periferie

N-methyl-d-aspartaat receptoren (NMDAR) zijn glutamaat-gated ion kanalen, overvloedig tot expressie gebracht in zoogdieren hersenen (1). Zij vormen heteromeren van NR1, NR2, en NR3 subeenheden, waarbij NR1 de enige verplichte partner is. NMDAR zijn cruciaal voor het reguleren van neuronale/synapse functies en worden ook tot expressie gebracht door niet-neuronale celtypes in de hersenen zoals astrocyten, oligodendrocyten, of endotheelcellen (2-5). Bovendien is perifere expressie gerapporteerd, bijvoorbeeld in het maagdarmkanaal of in immuuncellen (6).

Anti-NMDAR Encefalitis

Autoantilichamen van de immunoglobuline G (IgG) klasse gericht tegen NMDAR1 zijn oorspronkelijk in verband gebracht met een aandoening met de naam “anti-NMDAR encefalitis” (7-10). In 2007 beschreven Dalmau en collega’s voor het eerst een paraneoplastisch syndroom, gebaseerd op 12 vrouwen met ovariumteratomen, die IgG AB tegen NMDAR NR1/2 subeenheden droegen. Het syndroom bestond variabel uit psychose, cognitieve achteruitgang, epileptische aanvallen, dyskinesie, verminderd bewustzijn, en autonome instabiliteit. De auteurs rapporteerden in vele latere publicaties, gebaseerd op toenemende aantallen individuen met anti-NMDAR encefalitis, hoge serum en cerebrospinale vloeistof (CSF) titers van NMDAR1-AB van de IgG klasse bij deze aandoening, alsmede vaak gunstige respons op immunosuppressieve therapie (7-10). Als pathofysiologisch mechanisme van het syndroom is een door NMDAR1-AB geïnduceerde afname van NMDAR-gemedieerde stromen gesuggereerd, als gevolg van een versterkte internalisatie van de receptor, en dus een verminderde expressie aan het oppervlak (11). Echter, gedurende meerdere jaren werden gezonde proefpersonen niet eens in noemenswaardige aantallen onderzocht op NMDAR1-AB seroprevalentie. Niettemin werd en wordt nog steeds beweerd dat de aanwezigheid van NMDAR1-AB van de IgG klasse in serum (niet alleen in CSF) ziektespecifiek is (7-10), hetgeen tot enige verwarring in de literatuur en helaas ook in de klinische praktijk leidt.

Syndromen die doen denken aan NMDAR1 Antagonisme

Omdat NMDAR hypofunctie werd verondersteld een centraal mechanisme te zijn in schizofrenie, als gevolg van inductie van psychotische symptomen door antagonisten (12, 13), rees enkele jaren geleden de vraag of een subpopulatie van schizofrene personen voorheen over het hoofd geziene anti-NMDAR encefalitis gevallen zouden kunnen zijn. Tot nu toe leverde de literatuur – meestal gebaseerd op kleine steekproeven en volgens de oorspronkelijke “ziektespecifieke claim van NMDAR1-AB van de IgG klasse” – tegenstrijdige resultaten op (14-20). Analoog werden andere pathologische condities, die eveneens doen denken aan NMDAR antagonisme, b.v. epilepsie of dementie, onderzocht op de aanwezigheid van NMDAR1-AB. Een stortvloed van publicaties verscheen – waarvan vele case reports – waarin associaties van NMDAR1-AB met een grote verscheidenheid van syndromen werden beschreven. Tenslotte werd ook gemeld dat NMDAR1-AB van andere immunoglobuline (Ig) klassen (IgM en IgA) geassocieerd waren met ziektebeelden (17, 21-23). Een interessante vraag die tot nu toe volledig open is gebleven is of NMDAR1-AB ook kan leiden tot “perifere fenotypen,” gezien de expressie van NMDAR in perifere organen en weefsels (6).

Gelijke verdeling van serum NMDAR1-AB over gezondheid en ziekte

Onverwacht, recent werk van ons en anderen op samen >5,000 individuen daagde de “ziekte-specifieke claim” van een NMDAR1-AB uit door het aantonen van leeftijdsafhankelijke tot >20% NMDAR1-AB seroprevalentie, inclusief IgM, IgA, en IgG, in zowel gezonde als zieke personen. Interessant is dat NMDAR1-AB van de IgE klasse werden gezocht maar nooit gedetecteerd (24). Ziekten die in deze studies werden onderzocht omvatten neuropsychiatrische aandoeningen (schizofrenie, affectieve stoornissen, ziekte van Parkinson, amyotrofische laterale sclerose, ziekte van Alzheimer, beroerte, multiple sclerose, en persoonlijkheidsstoornissen) alsook algemene medische aandoeningen, bv. diabetes of hypertensie (24-28). Ook NMDAR1-AB titerbereik in serum en de verdeling van Ig-klassen waren vergelijkbaar over alle onderzochte ziektegroepen als ook gezonde individuen (24-28). Elke 40-jarige persoon heeft een ~10% en elke 80-jarige persoon heeft een ~20% kans om NMDAR1-AB seropositiviteit te vertonen (24).

Functionaliteit van NMDAR1-AB

Deze verrassende ontdekking riep de vraag op of deze AB allemaal functioneel zijn. Aangezien biochip mozaïeken en een cel-gebaseerde assay, de klinische standaard procedure (HEK293T-cellen getransfecteerd met NMDAR1 en secundaire AB tegen humaan IgG, IgM, of IgA; Euroimmun, Lübeck, Duitsland), werden gebruikt voor al deze NMDAR1-AB bepalingen (zie ook hieronder), moesten aanvullende assays worden uitgevoerd om deze onverwachte bevindingen verder te consolideren door de AB functionaliteit aan te tonen. Deze in vitro testen (alle uitgevoerd met sera na ammoniumsulfaat neerslag van immunoglobulinen en dialyse) toonden vergelijkbare effecten van NMDAR1-AB-onafhankelijk van de Ig klasse op receptor internalisatie in menselijke IPSC-afgeleide neuronen en in primaire muis neuronen. Evenzo verminderde NMDAR1-AB van alle Ig klassen glutamaat-geactiveerde stromen in NR1-1b/NR2A expresserende Xenopus laevis oöcyten (26, 28, 29). In vivo studies in muis en mens suggereren vergelijkbare effecten van serum NMDAR1-AB van alle Ig-klassen met betrekking tot modulatie van hersenfuncties (zie meer details hieronder).

Methodes van AB-detectie – Nog ruimte voor verbetering

Een nog steeds niet opgelost probleem dat vraagt om standaardisatie is de diversiteit van methoden die worden toegepast voor AB-bepaling met verschillende specificiteit en gevoeligheid. Wat NMDAR1-AB betreft (waar we de meest solide eigen ervaring mee hebben), zijn cel-gebaseerde assays zeker de superieure methode om NMDAR1-AB te detecteren, aangezien epitopen op een natuurlijke manier worden blootgelegd zodat AB ze specifiek kan detecteren. Maar zelfs deze assays verschillen, waarbij sommige auteurs transiënt getransfecteerde levende cellen gebruiken, waarbij zij hun potentiële variabiliteit en batch-to-batch variatie problemen accepteren, tegenover anderen die gefixeerde en gepermeabiliseerde cellen gebruiken die de gehele NMDAR1 subeenheid tot expressie brengen, wat waarschijnlijk een betere standaardisatie mogelijk maakt (Euroimmun). Deze laatste test wordt momenteel in de hele wereld gebruikt om NMDAR1-AB encefalitis te diagnosticeren. Op basis van onze eigen ervaring met deze test in combinatie met parallel uitgevoerde functionaliteitsstudies (receptor internalisatie, elektrofysiologie, en in vivo studies), lijkt het op dit moment de meest betrouwbare methode te zijn. Het wordt echter sterk aanbevolen deze test te gebruiken in combinatie met secundaire AB die zeer specifiek zijn voor de verschillende Ig-klassen (anti-humaan IgG, anti-humaan IgA en anti-humaan IgM), aangezien kruisreagerende AB tot verkeerde conclusies kunnen leiden met betrekking tot, bijvoorbeeld, de prevalentie van IgG AB. Het gebruik van secties van ratten-, muizen-, mensen- of apenhersenen voor immunohistochemische detectie van specifieke AB kan een nuttige aanvulling zijn die ondersteunend bewijs levert. Daarentegen kan de typische ELISA op basis van peptiden niet worden aanbevolen als een detectiemethode voor NMDAR1-AB, aangezien veel vals-positieve en/of vals-negatieve resultaten kunnen worden verkregen als gevolg van de onnatuurlijke (van de positie in het celmembraan verwijderde) epitoopblootstelling. Deze assays lijken alleen geschikt voor follow-up analyses, bijvoorbeeld de bepaling van het AB titer verloop met behulp van een serie monsters van dezelfde donor, eerder duidelijk gediagnosticeerd als seropositief door cel-gebaseerde en functionele assays.

Een beslissende rol van de Bloed-Hersen Barrière (BBB) voor Syndromale Relevantie

Wonderend waarom zoveel serum NMDAR1-AB dragers gezond blijven, stelden wij de hypothese dat een gecompromitteerde BBB zou kunnen beslissen over hun pathofysiologische significantie. Belangrijk is dat verhoogde BBB-permeabiliteit regionaal kan verschillen, wat individueel variabele symptomatische gevolgen kan verklaren (30). Als diermodel bestudeerden we ApoE-/- muizen met bekende BBB lekkage in vergelijking met wild-type nestgenoten (31). Intraveneuze injectie van gezuiverde Ig fracties van NMDAR-AB seropositieve (IgM, IgG, en IgA) menselijke proefpersonen leidde tot veranderingen in spontane open veld activiteit en hypersensitieve (psychose gerelateerde) respons op MK-801 in het open veld uitsluitend in ApoE-/- muizen (28). Toen we vervolgens ook bij mensen de rol van een gecompromitteerde BBB onderzochten, zagen we inderdaad ernstiger neurologische symptomen bij NMDAR1-AB dragers (van elke Ig klasse) met een geschiedenis van geboortecomplicaties of neurotrauma, condities met waarschijnlijk een chronisch lekkende BBB (28). In dezelfde lijn hebben wij APOE4 dragers onderzocht omdat het APOE4 haplotype geassocieerd is met een permeabele BBB (32, 33). Wij verkregen eerste aanwijzingen dat NMDAR-AB grootheidswaan en manie kan versterken bij neuropsychiatrisch zieke APOE4 dragers, die dan meer kans hebben op de diagnose schizoaffectief (29). Een modificerende rol van reeds bestaande circulerende NMDAR1-AB (opnieuw van alle klassen) werd ook gezien in menselijke ischemische beroerte. Bij patiënten met een intacte BBB voor het optreden van het letsel, waren NMDAR1-AB beschermend met betrekking tot de evolutie van de grootte van de laesie, terwijl bij APOE4 dragers, NMDAR1-AB geassocieerd waren met grotere insult volumes (24). Deze bevindingen benadrukken dat niet alleen de mate maar ook de duur van de BBB disfunctie, acuut versus chronisch, een cruciale rol kan spelen in de syndroomvorming door NMDAR1-AB.

De hersenen als immunoprecipitator van NMDAR1-AB

Circulerende NMDAR1-AB van alle Ig isotypen daalden tijdelijk na een beroerte (24). Dit leidde ons tot de hypothese dat hersenweefsel met zijn dicht tot expressie komend NMDAR1 (toegankelijk na BBB afbraak) kan fungeren als een val voor circulerend NMDAR1-AB (25). We onderzochten eerst de vraag of serum NMDAR1-AB detecteerbaar zou zijn in de CSF. Van N = 271 personen van middelbare leeftijd (gediagnosticeerd met multiple sclerose of ziekte controles) met CSF-serum paren beschikbaar, waren 26 NMDAR1-AB seropositief (wat in het verwachte bereik ligt) maar, opmerkelijk genoeg, was slechts 1 CSF positief. Daarentegen waren tetanus-AB (alomtegenwoordig door verplichte vaccinatie maar niet bindend aan hersenweefsel) aanwezig in serum en CSF van alle proefpersonen, waarbij de CSF niveaus hoger waren bij gecompromitteerde BBB. Translationele experimenten in muizen bewezen de hypothese dat de hersenen fungeren als “immunoprecipitator”: gelijktijdige injectie van NMDAR1-AB IgG en een niet-hersen-bindende “niet-sense-AB” (anti-GFP IgG) resulteerde in hoge detecteerbaarheid van de eerstgenoemde alleen in de hersenen (duidelijk meer uitgesproken bij BBB disfunctie) en de laatstgenoemde alleen in CSF (25). Deze gegevens kunnen helpen de mogelijke symptomatische gevolgen te verklaren van serum-AB gericht tegen hersenantigenen. Terwijl lekkage van de BBB een belangrijke rol speelt en moet worden geëvalueerd in gevallen waarin pathologische relevantie van circulerende NMDAR1-AB wordt vermoed, kunnen negatieve resultaten met betrekking tot AB titers in CSF niet automatisch herseneffecten uitsluiten.

Epitopes Recognized by NMDAR1-AB

De volgende vraag was of deze blijkbaar algemeen functionele NMDAR1-AB dezelfde epitoop zouden herkennen en of dit mogelijk hun hoge seroprevalentie zou kunnen verklaren. Opnieuw onverwacht, onthulde epitope mapping met behulp van zeven verschillende NMDAR1 constructen herkenning door NMDAR1-AB-positieve sera van verschillende epitopen, gelokaliseerd in de extracellulaire ligand binding en het N-terminale domein (NTD) als ook het intracellulaire C-terminale en het extra grote pore domein. NMDAR1-AB seropositiviteit was polyklonaal/polyspecifiek in de helft van de onderzochte sera en waarschijnlijk mono- of oligoklonaal/oligospecifiek (hoofdzakelijk IgG) in de andere helft. Over het geheel genomen verscheen er geen specifiek ziektegerelateerd patroon: NMDAR1 epitopen waren vergelijkbaar over ziekte groepen (26). Gepubliceerd werk over NMDAR1-AB epitopen was schaars vóór dit systematische onderzoek en had zich gericht op IgG dat NTD en het NTD-G7 domein (N368/G369) herkende, waarschijnlijk omdat deze regio en Ig klasse voor het eerst werden beschouwd als pathognomonisch voor anti-NMDAR encephalitis (8, 34). Het lijkt er inderdaad op dat factoren die jonge vrouwen predisponeren voor neuropsychiatrische manifestaties van NMDAR1-geassocieerde auto-immuniteit, verband houden met NTD of NTD-G7 epitopen. De versterkte rol van IgG in deze context is nog steeds een kwestie van speculatie, maar houdt waarschijnlijk verband met ontsteking-geïnduceerde klasse-switch in de hersenen (36).

Predisponerende factoren om NMDAR1-AB te dragen of te versterken

Op basis van deze in vitro en in vivo bevindingen moeten we aannemen dat in principe alle natuurlijk voorkomende NMDAR1-AB pathogeen potentieel hebben, ongeacht de epitoop en Ig klasse. Dit betekent echter niet dat het type Ig-klasse geen verschillende cascades van secundaire gebeurtenissen in gang kan zetten en zo de uiteindelijke weefselrespons verder vorm kan geven. Maar nu rijzen er nog meer vragen: Hoe kunnen we de ziekte-onafhankelijke hoge seroprevalentie van NMDAR1-AB verklaren, die toeneemt met de leeftijd? Zijn er predisponerende factoren bekend, en zo ja, hoe kunnen we hun rol in het volledige plaatje integreren? NMDAR1-AB werden aanvankelijk in verband gebracht met oncologische aandoeningen (teratomen) (7). Later werd een predispositie voor het dragen van deze AB gezien bij influenza A en B seropositiviteit, een bevinding die werd gerepliceerd in een onafhankelijke steekproef (25, 28). Ook een genoom-breed significante genetische marker, rs524991, zelfs gerelateerd aan NMDAR biologie, werd geassocieerd gevonden met NMDAR1-AB (28). Of een lekkende BBB, die een verhoogde blootstelling van centraal NMDAR1 aan cellen van het immuunsysteem veroorzaakt, NMDAR1-AB vorming kan induceren en/of reeds bestaande specifieke B cel klonen kan stimuleren is momenteel onduidelijk en moet systematisch onderzocht worden. Een ander aantrekkelijk idee dat nog niet is onderzocht in het NMDAR1-AB veld is de mogelijke modulerende invloed van het microbioom op het stimuleren van NMDAR1-AB (37).

Andere hersenantigeen-geleide AB

Waarom zien we NMDAR1-AB zo overvloedig in gezondheid en ziekte? Geldt dit ook voor andere AB gericht tegen hersenantigenen? Om deze vragen te beantwoorden, bestudeerden wij op analoge wijze 24 andere serum AB’s gericht tegen hersenantigenen, die eerder in verband werden gebracht met pathologische aandoeningen. Opnieuw tot enige verrassing, onthulde dit werk vergelijkbare frequenties, titers, en Ig klasse verdeling in gezonde en zieke proefpersonen. De seroprevalentie van al deze 24 AB was echter duidelijk lager (<2%) in tegenstelling tot NMDAR1-AB (tot >20%) (27). Opvallend was dat de overheersende Ig-klasse ook niet afhing van de gezondheids- of ziektetoestand, maar van de antigeenlocatie, waarbij intracellulaire epitopen IgG predisponeerden (27). De gelijke verdeling van deze 24 andere AB in gezondheid en ziekte is minder verbazingwekkend wanneer men bedenkt dat meerdere hersen-gerichte AB zijn gerapporteerd in serum van gezonde mensen en van verschillende andere zoogdiersoorten (38, 39) evenals overvloedig in CSF van encefalitis gevallen (40), ook al waren de respectievelijke hersenantigenen niet gespecificeerd. Kortom, hersenantigeen-gerichte AB in het algemeen en NMDAR1-AB in het bijzonder lijken deel uit te maken van een reeds bestaand autoimmuunrepertoire (37, 41-44) dat (patho)fysiologische betekenis krijgt in omstandigheden van intrathecale synthese of gecompromitteerde BBB, bijvoorbeeld bij verwonding, infectie, hersenontsteking, of genetische predispositie voor BBB lekkage (APOE4 haplotype).

Conclusies en aanbevelingen

Alle natuurlijk voorkomende serum NMDAR1-AB hebben duidelijk pathogeen potentieel. Om nog grotendeels onopgehelderde redenen komen zij zeer frequent voor (meer dan andere tot dusver geïdentificeerde hersengestuurde AB), en hun prevalentie neemt duidelijk toe met de leeftijd. NMDAR-AB seropositiviteit alleen rechtvaardigt zeker geen immunosuppressieve behandeling. De syndromale relevantie van serum NMDAR1-AB hangt af van de toegankelijkheid tot de hersenen, d.w.z. BBB-permeabiliteit. Bovendien speelt hersenontsteking waarschijnlijk een cruciale rol in het bepalen van de ernst van het syndroom zoals bijgedragen door circulerend NMDAR1-AB en nog meer uitgesproken door respectievelijke plasmacellen die verblijven in of mogelijk migreren naar de hersenen in ontstekingsomstandigheden om AB intrathecaal te produceren (40). In het ontstekingsmilieu worden zij gestimuleerd bij blootstelling aan epitopen en ondergaan zij een klasseswitch naar IgG (36). Bevindingen bij personen met herpes encefalitis kunnen deze zienswijze verder ondersteunen (22, 45).

Een onderliggende encefalitis, zij het besmettelijk, laesie geïnduceerd, genetisch, of “idiopathisch”, kan een prominent syndroom vormen door de aanwezigheid van NMDAR1-AB in de zin van “Dalmau’s encefalitis” (7-10), die dan immunosuppressieve therapie vereist bovenop de behandeling van de oorzakelijke encefalitis (indien beschikbaar). Of intrathecaal geproduceerde NMDAR1-AB alleen, zonder enige onderliggende reeds bestaande ontsteking, “Dalmau’s encephalitis” kan veroorzaken, moet nog worden vastgesteld. In elk geval van anderszins vermoede symptomatische gevolgen van serum AB gericht tegen hersenantigenen in afwezigheid van openlijke encefalitis, moet de lekkage van de BBB worden geëvalueerd. Aangezien het albuminequotiënt (gebruikt als klinische benadering voor de diagnose van BBB-afbraak) eerder wijst op een verstoring van de bloed-CSF-barrière en niet altijd pathologisch is in milde gevallen van BBB-lekkage (46-48), kan aanvullende bepaling van BBB-afbraak (globaal of lokaal) door een nieuwe MRI-methode (47), die kan worden vastgesteld als aanvulling op routinematige MRI met contrastversterking, nuttig blijken voor het inschatten van noodzaak en voordeel, vooral van uitgebreide immunosuppressieve therapeutische interventies.

Bijdragen van de auteur

De auteur bevestigt de enige bijdrager van dit werk te zijn en heeft het goedgekeurd voor publicatie.

Conflict of Interest Statement

De auteur verklaart dat het onderzoek werd uitgevoerd in afwezigheid van enige commerciële of financiële relaties die zouden kunnen worden opgevat als een potentieel belangenconflict.

Financiering

Dit werk werd ondersteund door de Max Planck Society, de Max Planck Förderstiftung, de DFG (CNMPB), EXTRABRAIN EU-FP7, en het Niedersachsen-Research Network on Neuroinfectiology (N-RENNT).