Food-grade kationische antimicrobiële ε-polylysine verandert tijdelijk de darm microbiële gemeenschap en voorspelde metagenoom functie in CD-1 muizen

Een kationisch antimicrobieel biopolymeer beïnvloedt de diversiteit van de darmgemeenschap bij muizen

40 vrouwelijke en 40 mannelijke CD-1 muizen van 6 weken oud werden willekeurig verdeeld in vier groepen en gescheiden naar geslacht (d.w.z.d.w.z. 10 vrouwelijke en 10 mannelijke muizen per groep) en gevoederd met een 20% vetrijk dieet aangevuld met (i) alleen maltodextrine (MD) dat diende als controle, (ii) maltodextrine + ε-polylysine (PL), (iii) maltodextrine + pectine (P), en (iv) maltodextrine + ε-polylysine + pectine (PL-P). Eerdere studies toonden aan dat muizen die samen werden gehuisvest vergelijkbare darmmicrobiële gemeenschappen vertoonden.38, 39 Daarom werden gepoolde fecale pellets van elke kooi verzameld in 24-uurs metabolische kooien en geanalyseerd op drie momenten: week 1 (basislijn), week 5 (tussenfase), en week 9 (eindfase) (Fig. 1). Het lichaamsgewicht en de voedselconsumptie varieerden niet, ongeacht de behandelingsgroep en gedurende de gehele experimentele periode.

Om de fylogenetische diversiteit te karakteriseren, werd het 16S rRNA-gen V3/V4-fragment gesequeneerd om 15.739.734 kwaliteitslezingen op te leveren na filtering.40 Dit leverde een gemiddelde monsterdiepte van 327.911 sequencing-lezingen per bacteriegemeenschap op. Om de α-diversiteit binnen een bepaalde gemeenschap te beoordelen, werd het aantal waargenomen operationele taxonomische eenheden (OTU’s) berekend met behulp van gewogen UniFrac.41 Rarefactiecurven voor de waargenomen OTU’s (Fig. S1) benaderden een asymptoot onafhankelijk van dieet, monsterpunt en geslacht om aan te geven dat sequencingdiepte voldoende de OTU-diversiteit dekte die aanwezig was in de gemeenschappen uit fecale monsters.

Op fylumniveau vormde de optelsom van Actinobacteria, Bacteroidetes, Deferribacteres, Firmicutes, Proteobacteria, Verrucomicrobia meer dan 99% van de OTU’s die in alle geanalyseerde monsters werden geïdentificeerd. Zoals eerder gemeld,42, 43 de muizen darm microbioom bestaat uit relatief grote bijdragen geleverd door de fyla Bacteroidetes en Firmicutes (Fig. 2). Dit is consistent met andere zoogdieren darm gemeenschappen, waaronder mensen en niet-menselijke primaten.44, 45 Echter, de relatieve overvloed van Bacteriodetes (p < 0,05) en Firmicutes (p < 0,05) werden veranderd in reactie op de specifieke voeding biopolymeer (multi-way ANOVA) (Fig. 2). Interessant is dat muizen die werden gevoed met het ε-polylysine-pectine complex een toename vertoonden van Bacteriodetes met 8,82% (p < 0,05, multi-way ANOVA Tukey HSD post-hoc) met een overeenkomstige afname van OTU’s toegewezen aan Firmicutes met 11,13% (p < 0,05, multi-way ANOVA Tukey HSD post-hoc). Dit is relatief ten opzichte van de gemeenschapsstructuur die werd vastgesteld in de met maltodextrine gevoede controlegroep (Tabel S1). Bovendien vertoonden de met ε-polylysine (d.w.z. zonder pectinecomplex) gevoede muizen in de tussenfase (d.w.z. 5 weken) van de studie een relatief deficiënte gemeenschap voor Firmicutes. Opmerkelijk is dat de Firmicute OTU’s op het bemonsteringspunt van 9 weken weer hun oorspronkelijke concentratie hadden bereikt (basis: 55,24%, tussentijds: 34,71%, uiteindelijk: 59,01%, baseline vs. intermediate: p < 0,05, intermediate vs. final: p < 0,05, multi-way ANOVA Tukey HSD post-hoc) (Fig. 2 en Tabel S3). De relatieve fractie van Bacteriodetes OTU’s, die dezelfde adaptieve respons vertoonden, nam tijdelijk toe na 5 weken voeren en convergeerde naar de beginconcentraties op het eindtijdstip (basislijn: 35,40%, tussentijds: 51,18%, uiteindelijk: 28,82%, basislijn vs. tussentijds: p < 0,05, tussentijds vs. uiteindelijk: p < 0,05, meerweg ANOVA Tukey HSD post-hoc) (Fig. 2 en Tabel S3). Een soortgelijke tijdelijke toename van Verrucomicrobia trad op bij muizen die alleen met pectine werden gevoederd, om op het laatste bemonsteringspunt weer te dalen tot het oorspronkelijke niveau (basislijn: 0,59%, tussentijds: 5,46%, uiteindelijk: 1,01%, basislijn vs. tussenliggend: p < 0,05, tussenliggend vs. eindliggend: p < 0,05 multi-way ANOVA Tukey HSD post-hoc) (Fig. 2 en Tabel S4). In totaal, deze resultaten geven aan dat specifieke food grade biopolymeren tijdelijk fyla vertegenwoordiging binnen de muizen darm te sturen. Dit werd waargenomen wanneer zowel ε-polylysine en pectine individueel werden opgenomen. Echter, wanneer ε-polylysine werd gecomplexeerd met de anionische pectine, werd dit fenomeen niet waargenomen. Opmerkelijk is dat significante populatiestromen binnen de Actinobacteriën, Deferribacteres, en Proteobacteriën niet werden waargenomen, ongeacht het dieet (Tabel S5).

Naast de verstoring van de gemeenschap op fylum-niveau zijn verschillende bacteriële geslachten verschoven als reactie op de biopolymeren in het dieet. Hiertoe behoren leden van het geslacht Bacteroides, die het vaakst werden aangetroffen in de darmen van muizen (14,32 ± 9,58% in alle monsters). In totaal (over beide geslachten en monsterpunten) varieerde de vertegenwoordiging van Bacteroides naar gelang van de voedingsgroep van de biopolymeren. De respons van het fylum Bacteroidetes weerspiegelend, verhoogden ε-polylysine (p < 0.05, multi-way ANOVA Tukey HSD post-hoc) en ε-polylysine-pectine gecomplexeerde behandeling (p < 0.05, multi-way ANOVA Tukey HSD post-hoc) de Bacteroides spp. populaties met respectievelijk 7.95 en 7.46%, in vergelijking met de maltodextrine controlegroep (Fig. 3 en Tabel S6). Andere bacteriële populaties die werden gemoduleerd door de voederregimes waren Adlercreutzia, Lactobacillus, Turicibacter, en Ruminococcus (multi-way ANOVA, p < 0.05). Meer bepaald daalde de overvloed van Adlercreutzia, ongeacht het biopolymeer, in vergelijking met de met maltodextrine gevoede groep. Hun relatieve populaties daalden met respectievelijk 0,18%, 0,22% en 0,24% bij muizen die werden gevoed met ε-polylysine, pectine, en ε-polylysine-pectine complexen. Bovendien nam het genus Ruminococcus significant af met 1,39% in reactie op ε-polylysine en daalde met 1,44% in de pectinegroep. Bovendien daalde het gehalte aan Lactobacillus in het met ε-polylysine enpectine gecomplexeerde dieet significant met 4,95%, wat wijst op een algehele afname van Firmicutes in deze groep. Dit in tegenstelling tot het pectinedieet, dat in vergelijking met de andere drie diëten verrijkt was met Turicibacter. Een volledige catalogus van genera die verschillen in reactie op biopolymeren is te vinden in Tabel S6.

Maltodextrine wordt algemeen gebruikt als verdikkingsmiddel of vulstof in diverse voedingstoepassingen. Dit polysaccharide werd gebruikt in de samenstelling van alle behandelde diëten en diende dus als controle om te bepalen of maltodextrine alleen bacteriën zou verrijken die in staat zijn de α-1-4 glycosidebindingen tussen d-glucoseresiduen te hydrolyseren. De relatieve abundantie van Coprococcus in de darm van muizen werd verrijkt bij consumptie van maltodextrine in hun voedsel. Het reactietraject omvatte een significante toename tussen de basislijn en de tussenliggende bemonsteringspunten en tussen de basislijn en het eindtijdstip (basislijn: 0,56%, tussenliggende: 0,98%, laatste: 0,91%, basislijn vs. tussenliggend: p < 0,05, basislijn vs. eindliggend: p < 0,05) (Fig. 3 en Tabel S7).

In de ε-polylysine behandelingsgroep nam de relatieve abundantie van Bacteroides tijdelijk toe, consistent met de oscillatie op fylum niveau (basislijn: 8,85%, tussenliggend: 34,40%, uiteindelijk: 8,74%, basislijn vs. intermediair: p < 0,05, intermediair vs. finale: p < 0,05). Een soortgelijke respons werd waargenomen voor Oscillospira (uitgangswaarde: 4,96%, tussenwaarde: 2,51%, eindwaarde: 6,13%, basislijn vs. intermediair: p < 0,05, intermediair vs. definitief: p < 0,05). Dit staat in contrast met een voorbijgaande afname van OTU’s toegewezen aan Ruminococcus (basislijn: 2,17%, tussentijds: 0,97%, definitief: 2,10%, uitgangssituatie vs. tussentijds: p < 0,05, tussentijds vs. definitief: p < 0,05), en Adlercreutzia (uitgangssituatie: 0,49%, tussentijds: 0,24%, definitief: 0,34%, basislijn vs. intermediair: p < 0,05) (Fig. 3 en Tabel S8). Bovendien vertoonde Coprococcus spp. een aanhoudende verrijking tijdens de voeding, met significante toenames tussen basislijn en eindtijdstip (basislijn: 0,47%, tussentijds: 0,71%, laatste: 0,91%, basislijn vs. eindpunt: p < 0,05) (Fig. 3 en Tabel S8). Dit is consistent met dezelfde trend die werd waargenomen in de maltodextrine controlegroep. Coprococcus populaties blijven echter relatief statisch in muizen gevoed met pectine en ε-polylysine-pectine complexen.

Pectine tijdelijk verrijkt voor het genus Akkermansia (basislijn: 0,59%, intermediair: 5,46%, finale: 1,01%, basislijn vs. intermediair: p < 0,05, intermediair vs. definitief: p < 0,05) die bijdraagt tot de waargenomen intermediaire toename van Verrucomicrobia. De Adlercreutzia-populaties daarentegen namen af in het tussentijdse bemonsteringspunt en bleven laag in de laatste waarneming (Adlercreutzia basislijn: 0,48%, tussentijds: 0,23%, laatste: 0,26%, basislijn vs. tussenliggend: p < 0,05). De vertegenwoordiging van de kandidaat-genus rc4-4 OTU’s nam evenredig af, maar keerde niet volledig terug naar de uitgangstoestand (rc4-4 uitgangstoestand: 1,94%, tussenstand: 1,04%, definitief: 1,62%, uitgangstoestand vs. uitgangstoestand: p < 0,05) (Fig. 3 en Tabel S9). Interessant is dat Ruminococcus spp. gedurende de hele voederstudie een dalende trend vertoonde, met significante verschillen tussen de uitgangs- en eindtijdstippen (uitgangswaarde: 2,32%, tussenwaarde: 1,63%, finale: 1,14%: basislijn vs. eindpunt: p < 0,05) (Fig. 3 en Tabel S9).

Hoewel de meeste genera niet verschoven als reactie op ε-polylysine-pectine complexen, nam Ocscillospira tijdelijk toe alvorens tot onder het beginniveau te dalen (basislijn: 3,56%, tussentijds: 4,70%, uiteindelijk: 2,44%, gemiddeld vs. uiteindelijk: p < 0,05). De Parabacteroïdenpopulaties daarentegen werden in het algemeen geremd door alle dieetbehandelingen (uitgangswaarde: 3,44%, tussenwaarde: 0,79%, uiteindelijk: 0,55%, uitgangswaarde vs. tussenwaarde: p < 0,05, uitgangswaarde vs. eindwaarde: p < 0,05). Dit is vergelijkbaar met rc4-4 (uitgangswaarde: 2,82%, tussentijds: 0,77%, definitief: 0,48%, basislijn vs. intermediair: p < 0,05, basislijn vs. definitief: p < 0,05). In totaliteit reageren darmmicrobiota genera op levensmiddelenadditieven op genusniveau, in het bijzonder ε-polylysine (Fig. 3 en Tabel S10).

Naast de invloed van voedingsbiopolymeren op specifieke taxa, vertoonde de structurele samenstelling van de gemeenschap waarneembare en niet-willekeurige veranderingen in aggregaat. ANOSIM46 met 999 permutaties werd gebruikt om significante verschillen tussen monstergroepen te testen op basis van gewogen UniFrac.41 Zoals verwacht, verschoof maltodextrine de microbiële gemeenschap in de darm van muizen die deze controle kregen niet significant, noch bij vrouwelijke, noch bij mannelijke muizen (Fig. 4a, ANOSIM met 999 permutaties, p > 0,05). Dienovereenkomstig bevorderden pectine (Fig. 4c, ANOSIM met 999 permutaties, p > 0.05) en ε-polylysine-pectine complexen (Fig. 4d, ANOSIM met 999 permutaties, p > 0.05) geen significante verschuivingen binnen de gemeenschap. Dit is in opmerkelijk contrast met de darmmicrobiomen die van voorbijgaande aard werden veranderd door ε-polylysine alleen. Zoals waargenomen bij specifieke taxonomische groepen op fylum- en genusniveau, werd de gemeenschapsstructuur verstoord op het 5-wekenpunt om vervolgens te worden opgelost op het laatste bemonsteringstijdstip. Dit suggereert dat de samenstelling van de populatie werd gecorrigeerd tot de oorspronkelijke toestand door aanpassing aan het continu gevoerde biopolymeer (Fig. 4b, ANOSIM met 999 permutaties, p < 0.05). Dit werd niet waargenomen bij de met ε-polysine-pectinecomplex behandelde muizen, wat duidt op een afschermende interactie met de microbiële gemeenschap.

ε-polylysine verschuift voorspelde metagenoomfunctie

Het metagenomisch potentieel dat inherent is aan darmmicrobiomen werd afgeleid door Phylogenetic Investigation of Communities by Reconstruction of Unobserved States (PICRUSt) op basis van 16S rRNA fylogenetische gegevens. Een totaal van 6.854.103.780 waarnemingen werden voorspeld over 6909 Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) orthologie groepen (KO) binnen de 48 darmgemeenschappen die werden geprofileerd door PICRUSt. De resulterende gegevens werden gecategoriseerd in 254 functionele paden die alle van de 48 gemeenschappen omvatten.

In totaal waren er 44 paden waarvan werd voorspeld dat ze significant tijdelijk verschoven terwijl muizen ε-polylysine consumeerden (ANOVA met Bonferroni correctie, p < 0,05) (Fig. 5). Net als bij de veranderingen in de taxonomische structuur, vertoonden de tussenmonsters die na 5 weken werden genomen een significant ander profiel ten opzichte van de basislijn en de eindmonsters. Van deze 44 paden of netwerken zijn er 42 betrokken bij het metabolisme van bacteriën of worden op een andere manier gastheer-microbiële interacties voorspeld, met 18 paden aanwezig bij 0,5% relatieve abundantie, gebaseerd op het gemiddelde van de drie bemonsteringspunten (Fig. 5). Van acht van deze pathways werd voorspeld dat ze na 5 weken zouden afnemen en bij de laatste bemonstering weer op het basale niveau zouden komen. Daarentegen vertoonden 10 voorspelde pathways de tegenovergestelde trend en namen ze tijdelijk in abundantie toe. Zo werden genen en hun pathways gerelateerd aan algemeen solutentransport (basislijn: 7,53%, tussentijds: 5,88%, uiteindelijk: 7,68%, p < 0,05) en ABC-transporters (basislijn: 3,35%, tussentijds: 2,76%, uiteindelijk: 3,44%, p < 0,05) onderdrukt in de tussentijdse gemeenschapstoestand en keerden ze uiteindelijk terug naar de basislijnniveaus. Dit suggereert dat metabolische behoeften, en/of omgevingsconcentraties van gewenste oplosmiddelen, kortstondig kunnen afnemen voordat de microbioomstructuur zich herstelt. Bovendien gaan voorspelde centrale stofwisselingsprocessen die betrokken zijn bij de koolhydraat- en eiwitstofwisseling over in een omkeerbare toestand, terwijl de gastheer het met ε-polylysine verrijkte dieet consumeert. Dit wordt weerspiegeld in glycolytische/fermentatieve routes (basislijn: 1,05%, intermediair: 1,13%, uiteindelijk: 1,08%, p < 0,05), pyruvaatmetabolisme (basislijn: 1,01%, intermediair: 1,07%, uiteindelijk: 1,02%, p < 0,05), fructose- en mannanabole processen (basislijn: 1,05%, intermediair: 1,07%, uiteindelijk: 1,02%, p < 0,05).05), fructose- en mannosemetabolisme (basislijn: 0,085%, tussenliggend: 0,099%, uiteindelijk: 0,089%, p < 0,05), en genen geassocieerd met oxidatieve fosforylering (basislijn: 1,12%, tussenliggend: 1,23%, uiteindelijk: 1,08%, p < 0,05). De laatste KO zijn waarschijnlijk betrokken bij anaërobe ademhaling en tijdelijk verrijkt in het tussentijdse tijdstip. Naast het katabolisme van koolhydraten, werden paden geassocieerd met stikstof flux verschoven op 5 weken, waaronder amino suiker en nucleotide suiker metabolisme (basislijn: 1,47%, tussentijds: 1,60%, uiteindelijk: 1,50%, p < 0,05), en histidine metabolisme (basislijn: 0,062%, tussentijds: 0,067%, uiteindelijk: 0,061%, p < 0,05). We hadden aanvankelijk de hypothese dat kenmerken van lysine katabolisme verrijkt zouden zijn in de voorspelde metagenomen van muizen gevoed met ε-polylysine, hetzij in het PL of PL-P dieet. Dit signaal werd echter niet waargenomen in de PICRUSt-analyse, wat suggereert dat ε-polylysine geen bacteriepopulaties selecteerde die het lysinekatabool potentieel verhoogden.

Waar de voorspelde metagenomen reageerden op het dieet van ε-polylysine, werden er geen significante verschillen gevonden in de andere drie voedingsgroepen. Dit geldt ook voor muizen die ε-polylysine krijgen toegediend dat is gecomplexeerd met pectine, wat verdere ondersteuning biedt voor elektrostatische afscherming om de antimicrobiële invloed van de ε-polylysine te verzachten. Pectine alleen verandert de gemeenschapsstructuur of de voorspelde functie niet.

Hostgeslacht beïnvloedt het basale microbioom maar niet het responstraject

Zowel mannelijke als vrouwelijke muizen werden geobserveerd om te bepalen of biopolymeeractiviteit binnen het microbioom geslachtsafhankelijk is. Verschillende bacteriële taxa koloniseerden mannelijke en vrouwelijke dieren asymmetrisch en op een niet-willekeurige manier. Dit omvat het fylum Verrucomicrobia dat in hogere concentraties werd aangetroffen bij vrouwelijke muizen dan bij mannelijke in totaal (vrouwelijk: 4,96% van 24 monsters, mannelijk: 2,63% van 24 monsters, p < 0,05, multi-way ANOVA) (Tabel S11). Een groot deel hiervan kan verklaard worden door verschillen in Akkermansia-populaties (vrouwtjes: 4,50%, mannetjes: 2,63% p < 0,05). Bovendien herbergden vrouwelijke muizen significant grotere populaties van de bacteriële geslachten Parabacteroides (vrouwtje: 2,47%, mannetje: 0,5%, p < 0,05) en Bilophila (vrouwtje: 2,13%, mannetje: 0,01%, p < 0,05). Mannelijke muizen daarentegen werden gekoloniseerd door grotere concentraties van Odoribacter (vrouwtje: 0%, mannetje: 0,92%, p < 0,05), Turicibacter (vrouwtje: 0,02%, mannetje: 0,21%, p < 0,05), Clostridium (vrouwtje: 0,01%, mannetje: 0,10%, p < 0,05), en kandidaat-genus rc4-4 (vrouwtje: 0,01%, mannetje: 2,46%, p < 0,05).16%, mannelijk: 2,46%, p < 0,05) (Tabel S12).

Naast taxonomische verschillen zijn er structurele verschillen in de gemeenschap die kunnen worden toegeschreven aan het geslacht van het dier, zoals blijkt uit UniFrac-afstand gevisualiseerd door principale coördinatenanalyse (PCoA) in Fig. 6a. Dienovereenkomstig, darm microbiota waargenomen in vrouwelijke en mannelijke muizen clusteren samen door geslacht, en op een manier meer vergelijkbaar binnen hun respectieve geslacht dan ze zijn met elkaar (Fig. 6a, ANOSIM met 999 permutaties, p < 0,05). Bovendien vertoonde hiërarchische clustering van microbiomen en bacteriegeslachten op basis van hun relatieve abundantie een vergelijkbaar patroon, in die zin dat bacteriegemeenschappen binnen hetzelfde geslacht de neiging vertonen te clusteren (Figs. S2 en S3). De gemiddelde binnen de groep fylogenetische diversiteit van vrouwelijke mannetjes is kleiner dan die van mannelijke muizen (Fig. 6b, t-test, p < 0,05), terwijl er geen verschillen werden waargenomen tussen vrouwelijke en mannelijke muizen in het totaal aantal waargenomen OTU’s en Chao 1 index (Fig. S4).

In tegenstelling tot de structurele verschillen tussen microbiomen gehost in vrouwelijke muizen en microbiomen gehost in mannelijke muizen, verschilden slechts drie voorspelde metagenomische paden significant. Dit omvat transcriptie-gerelateerde activiteiten (vrouw: 0,0092%, man: 0,0051%, p < 0,05), aminoglycoside antibioticum biosynthese (vrouw: 0,087%, man: 0,080%, p < 0,05) en glycerofosfolipide metabolisme (vrouw: 0,55%, man: 0,52%, p < 0,05). Het is onduidelijk of deze ten grondslag liggen aan uitgesproken metabolische verschillen tussen de twee gastheergeslachten. Behoud van functie ondanks taxonomische variatie is consistent met redundantie in genetisch potentieel eerder waargenomen binnen andere microbiële gemeenschappen.46, 47

Ondanks geslachtsafhankelijke kenmerken, blijft het specifieke effect van biopolymeerbehandelingen onafhankelijk van het geslacht, zoals aangegeven door PCoA-analyse (Fig. 3). Specifiek, ε-polylysine verandert tijdelijk het muizenmicrobioom op het tussenliggende bemonsteringspunt, ongeacht het geslacht. Terwijl pectine of pectine gecomplexeerd met ε-polylysine niet verandert vrouwelijke en mannelijke muizen geharboreerde microbiota. Een soortgelijk reactiepad is duidelijk in de fluxen op fylumniveau, aangezien de vertegenwoordiging van Bacteriodes en Firmictues tijdelijk verschuift in reactie op ε-polylysine in beide geslachten (Fig. S5). Bovendien vertoonden de darmmicrobiomen van beide geslachten dezelfde verandering in Verrucomicrobia wanneer ze met pectine werden gevoederd (Fig. S5). In vergelijking met de maltodextrine-gevoede groep, verhoogde het ε-polylysine-pectine-gecomplexeerde dieet de Bacteriodetes en verminderde het aantal Firmicutes, onafhankelijk van het geslacht. Deze resultaten geven aan dat geslachtsafhankelijke eigenschappen (b.v. hormonen) niet synergistisch of antagonistisch werkten met voedingsbiopolymeren om de gemeenschapsstructuur in het algemeen en binnen de belangrijkste fyla’s te veranderen.

Intrigerend is dat voedingsbiopolymeren de genusrepresentatie kunnen veranderen die enigszins afhankelijk is van het geslacht. De relatieve overvloed van Parabacteroides (geslacht*behandeling p < 0.05, multiway ANOVA), Clostridium (geslacht*behandeling p < 0.05, multiway ANOVA), Coprococcus (geslacht*behandeling, p < 0.05, multiway ANOVA), en Bilophila (geslacht*behandeling p < 0.05, multiway ANOVA) vertoonde een bescheiden afhankelijkheid van het gastheergeslacht (Fig. S6). Bij vrouwelijke muizen was het Coprococcus-gehalte hoger in de pectinegroep dan in de andere drie groepen (MD: 0,69%, PL: 0,63%, P: 0,98%, PL+P: 0,65%, MD vs. P: p < 0,05, PL vs. P: p < 0,05, P vs. PL+P: p < 0,05). Bij mannelijke muizen waren de Coprococcus OTU’s van de pectinegroep echter verminderd in de microbiomen in vergelijking met de andere drie groepen (MD: 0,94%, PL: 0,77%, P: 0,45%, PL+P: 0,78%, MD vs. P: p < 0,05, PL vs. P: p < 0,05, P vs. PL+P: p < 0,05). Ook was Bilophila verminderd bij vrouwelijke muizen die ε-polysine kregen in vergelijking met ε-polylysine-pectine-gecomplexeerd dieet (MD: 0,51%, PL+P: 1,63%, p < 0,05), terwijl het microbioom van mannelijke muizen deze geslachtsgebonden populatie-flux niet vertoonde. Bovendien beïnvloedden de interacties van geslacht, bemonsteringspunten en biopolymeer de waargenomen relatieve abundantie van het genus Turicibacter (p < 0,05), Clostridium (p < 0,05), Coprococcus (p < 0,05), en het kandidaat-genus rc4-4 (p < 0,05).