Fluorescente proteïne tags

Inleiding

Fluorescente proteïnen (FPs) worden sinds het midden van de jaren negentig gebruikt als proteïne tags, voornamelijk voor celbiologie en fluorescentiemicroscopie. Deze tags hebben niet alleen een revolutie teweeggebracht in de celbiologie doordat zij de beeldvorming van bijna elk eiwit mogelijk maken, maar zij worden ook gebruikt in biochemische toepassingen. Een belangrijk voorbeeld is de immunoprecipitatie en de affiniteitszuivering van met FP gemerkte eiwitten, die mogelijk is gemaakt door de ontwikkeling van affiniteitsharsen met een hoge opbrengst, zuiverheid en affiniteit, zoals de Nano-Traps van ChromoTek (https://www.chromotek.com/products/detail/product-detail/nano-traps/).

In deze blog geven we een overzicht van

• groen fluorescerende eiwitten
• rood fluorescerende eiwitten
• zelf-labellerende eiwitten, die de covalente koppeling van een fluorescent molecule vereisen

Types van fluorescente proteïnen

De meeste onderzoekers gebruiken intrinsiek fluorescente proteïnen GFP, mNeonGreen, TurboGFP, RFP, of mCherry. Als alternatief zijn extrinsiek fluorescerende of zelf-labelende eiwitten geïntroduceerd die de covalente koppeling van een fluorescerend molecuul aan het niet-fluorescerende eiwit vereisen, b.v. de eiwitlabels SNAP, CLIP, en Halo. Deze zelf-labelende fluorescente proteïnen hebben bepaalde prestatievoordelen ten opzichte van intrinsiek FP’s wegens de eigenschappen van hun fluorescente kleurstoffen.

Figuur 1: Structuren van fluorescente proteïnen.

(A) Intrinsiek fluorescerende proteïnen (FP’s) zoals EGFP, GFP, RFP, mNeonGreen, turboGFP enz. delen slechts een klein aantal gemeenschappelijke residuen, maar vouwen zich alle in een geconserveerde β-barrelstructuur. Hun fluorescentie ontstaat door de cyclisatie van de ruggengraat en de oxidatie van drie aminozuurresiduen in het centrum van dit vat (rechts gemarkeerd), waardoor een chromofoor met twee ringen ontstaat. Dit chemische proces wordt beschreven als de rijping van de chromofoor, is inherent aan de eiwitvouwing, en hangt alleen af van omgevingsvariabelen zoals temperatuur en zuurstofconcentratie, maar niet van extra enzymen. De kleur, fotostabiliteit, kwantumopbrengst en andere spectrale eigenschappen van intrinsiek fluorescerende eiwitten zijn het resultaat van mutaties in de aminozuren waaruit de chromofoor is opgebouwd of die zich in de nabijheid van de chromofoor bevinden.

(B) Extrinsiek fluorescerende eiwitten zoals HaloTag zijn in hun basale apo-vorm niet fluorescerend. Alleen als een geschikte geactiveerde fluorofoor aan het HaloTag-eiwit wordt toegevoegd, wordt deze fluorofoor gevangen en covalent gebonden door het HaloTag-residu D106, waardoor HaloTag fluorescerend wordt. (PDB ID’s voor structuren: EGFP, 2y0g; apo-HaloTag, 5uy1; holo-HaloTag, 5uxz.)

Groene fluorescente proteïne (GFP) van kwallen en zijn derivaten zijn nog steeds de meest gebruikte fluorescente proteïnen in biomedisch onderzoek. Onlangs zijn andere groene fluorescente proteïnen geïntroduceerd die zijn afgeleid van andere organismen. Deze FPs bezitten dezelfde basisvouwing als GFP maar verschillen sterk op sequentie-niveau. Daarom vereisen zij nieuwe, specifieke onderzoeksmiddelen zoals antilichamen.

Het origineel: GFP

Green Fluorescent Protein werd voor het eerst geïsoleerd uit de kwal Aequorea victoria in 1962 door Osamu Shimomura. Het heeft een lange Stokes shift groene fluorescentie (ex 395nm; em 509 nm). 30 jaar later slaagde Douglas Prasher er uiteindelijk in de sequentie van GFP te klonen en Martin Chalfie bracht deze sequentie in vivo tot expressie. Later ontwikkelde het Roger Tsien-laboratorium GFP tot een reeks ware onderzoeksinstrumenten. Shimomura, Chalfie en Tsien ontvingen de Nobelprijs in 2008. Zie Roger Tsien’s Nobelprijs lezing hier: https://www.nobelprize.org/prizes/chemistry/2008/tsien/lecture/.

Wetenschappers ontwikkelden een overvloed aan GFP-varianten met uiteenlopende eigenschappen. Deze FP’s hebben verschillende functionele en spectrale eigenschappen. De eerste belangrijke verbetering van GFP was een mutatie (S65T) die de intensiteit en de stabiliteit van het fluorescentiesignaal verhoogde. De belangrijkste excitatiepiek is verschoven naar 488 nm (Heim et al., 1995). De gangbare variant EGFP is een gemanipuleerde versie van GFP, die het praktische gebruik van GFP in een verscheidenheid van verschillende organismen en cellen vergemakkelijkt.

Green Fluorescent Protein GFP is ook bekend als avGFP, wtGFP, en gfp10; EGFP als enhanced GFP en GFPmut1.

https://www.fpbase.org/protein/avgfp/

https://www.fpbase.org/protein/egfp/

TurboGFP

Geschat in 2004, TurboGFP is een snel rijpend en helder dimeerisch groen fluorescerend eiwit afgeleid van CopGFP van de copepode Pontellina plumata. Copepode TurboGFP is evolutionair ver verwijderd van kwallen-afgeleide fluorescente proteïnen zoals EGFP en deelt slechts ongeveer 20% sequentie-identiteit met de algemeen gebruikte GFP varianten. Daarom binden de meeste anti-GFP-antilichamen, waaronder de GFP-Nanobody die in GFP-Trap wordt gebruikt, niet aan TurboGFP.

https://www.fpbase.org/protein/turbogfp/

mNeonGreen

mNeonGreen is afgeleid van een multimeer geel fluorescentie-eiwit van de lancelet Branchiostoma lanceolatum. Daarom staat mNeonGreen evolutionair gezien ver af van kwallen-afgeleide FPs. mNeonGreen en gewone GFP-derivaten delen slechts ongeveer 20% sequentie-identiteit. Wegens de lage sequentie-overeenkomst wordt verwacht dat affiniteitstools (d.w.z. antilichamen) voor GFP-varianten niet zullen binden aan mNeonGreen. Zeker, dit is aangetoond voor ChromoTek’s affiniteitsreagentia (anti-GFP Nanobodies/ VHH’s en antilichamen).

Voor het eerst gepubliceerd in 2013, is mNeonGreen tot drie keer helderder dan GFP. Het is een opkomend, monomeer veelzijdig groen/geel fluorescerend eiwit voor beeldvormingstoepassingen, waaronder superresolutiemicroscopie. Bovendien fungeert mNeonGreen als acceptor voor cyaan fluorescerende eiwitten in fluorescentie resonantie energie overdracht (FRET) toepassingen. Het schijnt het helderste monomere groene fluorescerende eiwit te zijn dat tot dusver bekend is en het heeft een snelle rijpingssnelheid.

https://www.fpbase.org/protein/mneongreen/

Vergelijking van GFP, TurboGFP, en mNeonGreen

Eigenschap	EGFP (het meest gebruikte GFP-derivaat)	turboGFP	mNeonGreen
Ontdekking/ eerste publicatie
Oorsprong	GFP van kwal Aequorea victoria	CopGFP van roeipootkreeft Pontellina plumata	multimerisch geel fluorescerend eiwit van lancelet Branchiostoma lanceolatum
Maturatiesnelheid (bij 37°C)	25 min	25 min	10 min
Sequentie-identiteit met EGFP	(100%)	~20%	~20%
Afgeleid van GFP?	Ja	Nee	Nee
Structuur	Zwakke dimeer	Dimer	Monomeer
Gemeenschappelijke varianten	AcGFP, Clover, eGFP, Emerald, GFP, GFP5, GFP Envy, GFP S65T, mGFP, mPhluorin, PA-GFP, Superfolder GFP, TagGFP, TagGFP2, monomeer eGFP A206K, CFP, eCFP, mCerulean, YFP, Citrine, eCitrine, eYFP, Venus, Ypet, BFP	TurboGFP, CopGFP	mNeonGreen
Excitatie/emissiemaximum	488 nm/ 509 nm	482 nm/ 502 nm	506 nm/ 517 nm
Lengte/ molecuulgewicht (MW)	239 aminozuren, 26.9 kDa	2x 232 aminozuren, 2x 26 kDa	237 aminozuren, 26,6 kDa
Onderzoekshulpmiddelen aangeboden door ChromoTek	Immunoprecipitatie: GFP-Trap Immunofluorescentie: GFP-Booster, Konijn anti-GFP antilichaam PABG1 Western blot: Rat anti-GFP antilichaam Controle: gezuiverd EGFP eiwit	Immunoprecipitatie: TurboGFP-Trap	Immunoprecipitatie: mNeonGreen-Trap Immunofluorescentie: Muis anti-mNeonGreen antilichaam Western blot: Muis anti-mNeonGreen antilichaam

Rood fluorescerende eiwitten (RFP’s) zijn FP’s die rood-oranje fluorescentielicht uitzenden. De eerste RFP die commercieel beschikbaar kwam was DsRed. Het werd afgeleid van Discosoma sp. zeeanemonen in 1999.

DsRed heeft een aantal immanente praktische problemen: (i) Het heeft een rijpingstijd van ongeveer 24 uur, waardoor het onbruikbaar is voor experimenten op korte(re) termijn. (ii) De tetramerische vorm van DsRed kan de functie van de eiwitten waaraan het is gehecht in gevaar brengen. (iii) De fotostabiliteit is vrij laag.

Dientengevolge werd DsRed onderworpen aan gerichte mutagenese om algemeen toepasbaar te worden als een genetisch gecodeerde fusietag. Uiteindelijk werden monomere RFP-derivaten met betere fluorescentieprestaties (in termen van helderheid en fotostabiliteit) en een hogere rijpingsefficiëntie gecreëerd. Bovendien werden er derivaten gegenereerd met oranje, rode en ver rode fluorescentie. Deze gemonomiseerde versies van RFP werden de waardevolle onderzoeksinstrumenten mCherry, mOrange, mRaspberry, mPlum (ook bekend als de “mFruits”), mKO, mRFP (a.k.a. mRFP1), mRFPruby, mRuby, tagRFP, mKate2, en DsRed-Express enz.

Overige RFP’s werden geïdentificeerd in andere anthozoën (d.w.z. anemonen en koralen), maar ook deze eiwitten waren meestal tetrameren. Ze zijn dus nog niet verder geoptimaliseerd voor gebruik in onderzoek.

mRFP (ook bekend als mRFP1)

De eerste monomere variant van dsRed, genetisch gemanipuleerd in het lab van Roger Tsien, werd eenvoudigweg mRFP (of mRFP1) genoemd, d.w.z. monomeer rood fluorescerend eiwit. In vergelijking met dsRed wordt mRFP1 gekenmerkt door iets lagere niveaus van absorptie, quantumopbrengst en fotostabiliteit. De rijpingssnelheid is echter ongeveer 10 keer sneller dan die van dsRed, wat resulteert in een vergelijkbare effectieve helderheid wanneer uitgedrukt in levende cellen.

https://www.fpbase.org/protein/mrfp1/

mCherry

mCherry is waarschijnlijk de meest gebruikte RFP-variant. Het is een monomeer rood fluorescerend eiwit met een brede toepasbaarheid als fusie-eiwit in verschillende celtypes. Net als andere mFruit RFP’s, is mCherry afgeleid van de dsRed variant mRFP1 via gerichte evolutie door het lab van Roger Tsien. Vergeleken met andere mFruits heeft mCherry de hoogste fotostabiliteit, de snelste rijpingssnelheid en een uitstekende pH-bestendigheid. Het heeft echter een lagere kwantumopbrengst dan mRFP1.

https://www.fpbase.org/protein/mcherry/

mPlum

Het lab van Roger Tsien heeft ook een verrood monomeer derivaat van mRFP1/dsRed gegenereerd, genaamd mPlum. Verre rode FPs zijn gunstig voor het hele lichaam beeldvormingstoepassingen, omdat de belangrijkste weefsel absorbers zoals water, lipiden en hemoglobine zijn bijna transparant in het emissiegebied van 650-900 nm. Zoals de meeste roodverschoven RFP’s heeft mPlum een uitgebreide Stokes-verschuiving.

https://www.fpbase.org/protein/mplum/

Vergelijking van mCherry, mRFP (mRFP1), and mPlum

Property	mCherry	mRFP (mRFP1)	mPlum
Discovery/eerste publicatie
Oorsprong	DsRed uit zeeanemoon Discosoma sp.	DsRood van zeeanemoon Discosoma sp.	DsRood van zeeanemoon Discosoma sp.
Maturatiesnelheid (bij 37°C)	15 min	60 min	100 min
Structuur	Monomeer	Monomeer	Monomeer
Samenvoeging	geen	geen
Excitatie/emissiemaximum	587 nm/ 610 nm	584 nm/ 607 nm	590 nm/ 649 nm
Lengte/ molecuulgewicht (MW)	236 aminozuren, 26.7 kDa	228 aminozuren, 25,4 kDa	229 aminozuren, 25,6 kDa
Onderzoeksinstrumenten geleverd door ChromoTek	Immunoprecipitatie: RFP-Trap Immunofluorescentie: RFP-Booster, ratten anti-RFP-antilichaam Western blotting: Muis anti-RFP-antilichaam	Immunoprecipitatie: RFP-Trap Immunofluorescentie: RFP-Booster, ratten anti-RFP-antilichaam Western blotting: Muis anti-RFP-antilichaam	Immunoprecipitatie: RFP-Trap Immunofluorescentie: RFP-Booster, ratten anti-RFP-antilichaam Western blotting: Muis anti-RFP antilichaam

De extrinsiek fluorescerende eiwitlabels Halo, SNAP, en CLIP vereisen de covalente vangst van een klein fluorescerend ligand om in een fluorescerend eiwit te veranderen. Daartoe zijn deze zelf-labelende eiwit tags afgeleid van enzymen die de vorming van chemische bindingen katalyseren: De SNAP- en CLIP-tags zijn varianten van O6-alkylguanine-DNA alkyltransferase die respectievelijk reageren met benzylguanine- en benzylcytosinederivaten. De HaloTag is afgeleid van een haloalkaan dehalogenase en reageert met alkylhalogeniden (figuur 1).

In het algemeen worden zowel intrinsiek als extrinsiek fluorescerende eiwitten gefuseerd met een belangwekkend eiwit om de cellulaire beeldvorming en detectie mogelijk te maken. Extrinsiek fluorescerende proteïnen vereisen echter de toevoeging van een reactieve fluorofoor, hetgeen verschillende voordelen heeft:

• Hogere kwantumopbrengst en fotostabiliteit
• Sterke fluorescentie in zowel levende als gefixeerde cellen
• Een bredere selectie van fluorescerende kleurstoffen
• Een enkel genetisch construct laat de keuze toe van verschillende fluoroforen voor multicolor beeldvorming/multiplexing
• Fluorescentie alleen gestart bij toevoeging van het label

De beschikbaarheid van drie extrinsiek fluorescerende eiwitten met verschillende substraat/ligand-specificiteiten maakt hun orthogonale gebruik in multiplexed experimenten mogelijk, ook in combinatie met intrinsiek FPs.

Afhankelijk van de experimentele behoeften, kan men gebruik maken cel permeant liganden op basis van tetramethylrhodamine (TMR), Oregon Green, diAcFAM, of Coumarin, die gemakkelijk de celmembraan voor het labelen van intracellulaire eiwitten passeren. Als alternatief kunnen celondoorlatende liganden op basis van ondoorlatende fluoroforen zoals Alexa Fluor® 488 en 660 worden gebruikt voor snelle etikettering van het celoppervlak.

Vergelijking van HaloTag, SNAP-Tag, en CLIP-Tag

Property	HaloTag	SNAP-Tag	CLIP-Tag
Ontdekking/eerste publicatie
Oorsprong	Haloalkaandehalogenase uit Rhodococcus rhodochrous	humaan O6-alkylguanine-DNA-alkyltransferase	humaan O6-alkylguanine-DNA-alkyltransferase
Structuur	Monomeer	Monomeer	Monomeer
Reactiviteit	Chloroalkaanderivaten	O6-benzylguaninederivaten	Benzylcytosinederivaten
Liganden	Celpermeabele of niet-permeabele kleurstoffen, fluoroforen, biotine, en beads	Celpermeabele of niet-permeabele kleurstoffen, fluoroforen, biotine, en beads	Celpermeabele of niet-permeabele kleurstoffen, fluoroforen, biotine, en korrels
Excitatie/emissiemaximum	Afhankelijk van gekoppelde fluorofoor	Afhankelijk van gekoppelde fluorofoor	Afhankelijk van gekoppelde fluorofoor
Lengte/ molecuulgewicht (MW)	297 aminozuren, 33.6 kDa	182 aminozuren, 19,4 kDa	182 aminozuren, 19,4 kDa
Onderzoeksinstrumenten aangeboden door ChromoTek	Immunoprecipitatie: Halo-Trap Western blotting: muis anti-HaloTag antilichaam	Immunoprecipitatie: SNAP/CLIP-tag-Trap Western blotting: rat anti-SNAP/CLIP-tag® antilichaam	Immunoprecipitatie: SNAP/CLIP-tag-Trap Western blotting: rat anti-SNAP/CLIP-tag® antilichaam

HaloTag

Het zelflabellerende HaloTag is afgeleid van het haloalkaan dehalogenase enzym DhaA uit Rhodococcus rhodochrous. Zijn actieve site is genetisch gemodificeerd om onomkeerbaar chloroalkaan linkersubstraten te binden. Door dit type zelfmoordremming is regeneratie van zijn katalytische site voor verdere dehalogenering niet meer mogelijk. Afhankelijk van het gekozen substraat verandert de HaloTag in een fluorescerend eiwit-tag of kan hij bijvoorbeeld aan agarose-korrels worden geïmmobiliseerd.

Aangezien haloalkaan-dehalogenasen afwezig zijn in eukaryote cellen en de meeste prokaryoten, met inbegrip van E. coli, zal er geen achtergrondlabeling zijn.

SNAP-tag

De zelflabelende eiwit-tag SNAP-tag is afgeleid van het menselijke O6-alkylguanine-DNA-alkyltransferase (hATG), dat als wildtype eiwit alkyleringsschade uit DNA verwijdert. De resulterende hAGT-variant die als SNAP-tag wordt gebruikt, reageert covalent met O6-benzylguaninederivaten (d.w.z. een fluorescerend label geconjugeerd aan guanine- of chloropyrimidine-verlaatgroepen via een benzyl-linker) op een onomkeerbare en zeer specifieke wijze. Bij de labelingreactie wordt de gesubstitueerde benzylgroep van het substraat covalent aan de SNAP-tag gebonden.

CLIP-tag

CLIP-tag is een gemodificeerde versie van SNAP-tag, ontworpen om te reageren met benzylcytosine in plaats van benzylguaninederivaten. Bij gebruik in combinatie met SNAP-tag maakt CLIP-tag de orthogonale en complementaire etikettering van twee eiwitten tegelijk in dezelfde cel mogelijk.

Een gids voor de keuze van fluorescente eiwitten
Shaner N.C., Steinbach P.A. and Tsien R.Y. (2005)
Nature Methods 2(12), 905-909 doi: 10.1038/nmeth819
http://www.tsienlab.ucsd.edu/Publications/Shaner%202005%20Nature%20Methods%20-%20Choosing%20fluorescent%20proteins.pdf

Groene fluorescente eiwitten:
Het groene fluorescente eiwit
Tsien R.Y. (1998)
Annual Review of Biochemistry, 67(1), 509-544. doi: 10.1146/annurev.biochem.67.1.509.

Betere groene fluorescentie
Heim, R., Cubitt A.B. and Tsien R.Y. (1995)
Nature, 373, 663-664. doi: 10.1038/373663b0

Structurele basis voor de snelle rijping van Arthropoda groen fluorescent eiwit
Evdokimov A.G., Pokross M.E., Egorov N.S., Zaraisky A.G., Yampolsky I.V., Merzlyak E.M., Shkoporov A.N., Sander I, Lukyanov K.A. and Chudakov D.M. (2006)
EMBO reports, 7(10), 1006-1012. doi: 10.1038/sj.embor.7400787.

Een helder monomeer groen fluorescerend eiwit afkomstig van Branchiostoma lanceolatum
Shaner N.C., Lambert G.G., Chammas A., Ni Y., Cranfill P.J. Baird M.A., Sell B.R., Allen J.R., Day R.N., Israelsson M, Davidson M.W. and Wang J. (2013)
Nature Methods, 10(5), 407-409. doi: 10.1038/nmeth.2413

Rood Fluorescerende Eiwitten:

Verbeterd monomere rode, oranje en gele fluorescerende eiwitten afgeleid van Discosoma sp. rood fluorescerend eiwit
Shaner N.C., Campbell R.E., Steinbach P.A., Giepmans B.N.G., Palmer A.E. and Tsien R.Y. (2004)
Nature Biotechnology, 22(12), 1567-1572. doi: 10.1038/nbt1037

Een monomeer rood fluorescerend eiwit
Campbell R.E., Tour O., Palmer A.E., Steinbach P.A., Baird G.S., Zacharias D.A. and Tsien R.Y. (2002)
PNAS, 99(12), 7877-7882. doi: 10.1073/pnas.082243699

Evolutie van nieuwe niet-antilichaam eiwitten via iteratieve somatische hypermutatie
Wang L., Jackson W.C., Steinbach P.A. and Tsien R.Y. (2004)
PNAS, 101(48), 16745-16749. doi: 10.1073/pnas.0407752101.

Recovery of Red Fluorescent Protein Chromophore Maturation Deficiency through Rational Design
Moore M.M., Oteng-Pabi S.K., Pandelieva A.T., Mayo S.L. and Chica R.A. (2012)
Plos ONE, 7(12), e52463. doi: 10.1371/journal.pone.0052463.

Halo, SNAP, and CLIP:

Releasable SNAP-tag Probes for Studying Endocytosis and Recycling
Cole N.B. and Donaldson J.G. (2012)
ACS Chemical Biology,7(3): 464-469, doi: 10.1021/cb2004252

Site-Specific Protein Labeling with SNAP-Tags
Cole N.B. (2013)
Current protocols in protein science / editorial board, Coligan J.E. et al., 73: 30.1.1-30.1.16., doi: 10.1002/0471140864.ps3001s73

An engineered protein tag for multiprotein labeling in living cells
Gautier A., Juillerat A., Heinis C., Corrêa I.R., Kindermann M., Beaufils F. and Johnsson K. (2008)
Chemistry and Biology 15 (2): 128-136, doi: 10.1016/j.chembiol.2008.01.007

HaloTag: A Novel Protein Labeling Technology for Cell Imaging and Protein Analysis
Los G.V., Encell L.P., McDougall M.G., Hartzell D.D., Karassina N., Zimprich C, Wood M.G., Learish R, Friedman-Ohana R, Urh M., Simpson D., Mendez J., Zimmerman K., Otto P., Vidugiris G., Zhu J., Darzins A., Klaubert D.H., Bulleit R.F. and Wood K.V. (2008)
ACS Chem. Biol. 3(6): 373-382 doi: 10.1021/cb800025k

Een algemene methode voor de covalente labeling van fusie-eiwitten met kleine moleculen in vivo.
Keppler A., Gendreizig S., Gronemeyer T., Pick H., Vogel H. and Johnsson K (2003)
Nat. Biotechnol. 21: 86-89, doi: 10.1038/nbt765

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging
Provost C.R. and Sun L. (2010)
Visualized Exp. 39: 1876, doi: 10.3791/1876

For research use only.

ChromoTek’s producten en technologie worden gedekt door verleende octrooien en lopende aanvragen in eigendom van of beschikbaar voor ChromoTek GmbH door exclusieve licentie.

ChromoTek, Chromobody, F2H, GFP-Trap, Myc-Trap, RFP-Trap, Spot-Tag, Spot-Label, en Spot-Trap zijn gedeponeerde handelsmerken van ChromoTek GmbH. SNAP-tag is een gedeponeerd handelsmerk en CLIP-tag is een handelsmerk van New England Biolabs, Inc. Nanobody is een gedeponeerd handelsmerk van Ablynx, een onderneming van Sanofi. De producten van andere leveranciers kunnen handelsmerken of gedeponeerde handelsmerken van de desbetreffende leverancier zijn. Verklaringen over producten van andere leveranciers worden gegeven naar ons beste weten.