Abstract
Een uremische patiënt ontwikkelde hypercalciëmie na tuberculose-infectie, en zijn geïoniseerde calciumspiegels correleerden met 1,25-dihydroxyvitamine D3 (1,25(OH)2D3)-spiegels. Wij voerden verdere studies uit om te bepalen of monocyten alternatieve plaatsen van 1,25(OH)2D3 conversie zijn dan de renale tubulaire cellen. Met behulp van een ex vivo bioassay vonden we in deze studie dat 1-α hydroxylase (CYP27B1) activiteit in monocyten significant hoger is bij patiënten met actieve tuberculose (TB) dan bij patiënten met frequent TB contact. Wanneer monocyten van patiënten met actieve TB echter opnieuw werden gestimuleerd met antigeen afkomstig van Mycobacterium tuberculosis, werd er minder 1,25(OH)2D3 waargenomen. Daarentegen was het niveau van 1,25(OH)2D3 onveranderd bij degenen met frequent TB-contact. Wij concluderen dat monocyten een alternatieve bron kunnen zijn van 1-α hydroxylase dat 25-hydroxyvitamine D3 zou kunnen omzetten in het meer actieve 1,25(OH)2D3.
1. Inleiding
Tuberculose teistert de wereld al sinds de prehistorie. Volgens een recent rapport bezwijken jaarlijks een miljoen patiënten aan tuberculose en aanverwante comorbiditeiten. De laatste decennia zijn enorme inspanningen geleverd om het pathofysiologische proces van de ziekte te begrijpen. Diermodellen en studies bij de mens hebben de weg geëffend voor de opheldering van individuele immuunreacties op Mycobacterium tuberculosis (MTB) . Deze studies leveren het bewijs dat vitamine D een belangrijke rol speelt in de menselijke weerstand tegen tuberculose. vitamine D wordt al meer dan 200 jaar gebruikt om tuberculose te bestrijden. Levertraan en calciferol, belangrijke bronnen van vitamine D, worden al sinds de 17e eeuw gebruikt om patiënten met tuberculose te behandelen . In de normale fysiologie wordt na blootstelling aan de zon het in de huid opgeslagen 7-dehydrocholesterol omgezet in previtamine D3, gevolgd door thermische isomerisatie tot vitamine D3 . Vervolgens wordt vitamine D3 in de lever gehydroxyleerd tot 25-hydroxyvitamine D3 (25(OH)D3). Vervolgens wordt 25(OH)D3 verder gehydroxyleerd tot de meest actieve vorm van vitamine D3, 1,25(OH)2D3, door 1-hydroxylase (CYP27B1) . Nierbuisvormige epitheelcellen zijn een belangrijke bron van 1-hydroxylase en spelen een cruciale rol bij de bepaling van de concentratie van 1,25(OH)2D3 in het serum . De aanwezigheid van CYP27B1 in extrarenale weefsels wordt al tientallen jaren erkend . De invloed van extrarenaal CYP27B1 op de serumconcentratie van 1,25(OH)2D3 moet nog worden bepaald.
We troffen een 34-jarige patiënt met uremie aan die gedurende 2 jaar regelmatig hemodialyse had ondergaan. De patiënt ervoer spierzwakte met vermoeidheid gedurende 2 dagen voordat hij een huisarts bezocht. De bloedchemie toonde een verhoogd geïoniseerd calciumgehalte (5,44 mg/dL). Ondanks de hypercalcemie werden de symptomen van de patiënt verlicht door conventionele behandeling. Vier maanden later kreeg de patiënt progressieve spierzwakte die gepaard ging met koorts. Op de eerste hulp werd opnieuw een verhoogd geïoniseerd calciumgehalte vastgesteld (6,88 mg/dL). Bovendien toonde een EKG een abnormaal hartritme en een kort QT-interval met verbrede T-golf. Een röntgenfoto van de borst toonde infiltratie in de rechter bovenkwab van de longen, waarvan later werd vastgesteld dat het longtuberculose was. De patiënt kreeg vervolgens 9 maanden antituberculosebehandeling. Vier maanden na de behandeling werden de geïoniseerde calciumwaarden van de patiënt genormaliseerd (5,2 mg/dL), en de symptomen verdwenen volledig. Om de pathogenese van de hypercalcemie van deze patiënt op te helderen, maten wij 1,25(OH)2D3 niveaus in aanvulling op geïoniseerde calcium niveaus. Zoals blijkt uit figuur 1, waren de niveaus van 1,25(OH)2D3 sterk gecorreleerd met die van geïoniseerd calcium.
Verschuivingen in geïoniseerd calcium en 1,25(OH)2D3 concentraties in het serum van een patiënt met actieve TB en uremie.
Naast renale CYP27B1-expressie worden macrofagen en monocyten beschouwd als belangrijke extrarenale locaties van CYP27B1-expressie. In deze studie evalueerden wij de rol van monocyten in het metabolisme van vitamine D3 met behulp van een ex vivo bioassay. Bovendien stimuleerden we monocyten met antigenen afgeleid van MTB om verder inzicht te verkrijgen in hoe monocyten het vitamine D3 metabolisme moduleren in reactie op bacteriële uitdaging.
2. Materialen en Methoden
2.1. Subject Population
Deze studie werd uitgevoerd aan de Kaohsiung Medical University. De deelnemers werden gestratificeerd in twee groepen: (1) actieve TB en (2) frequent TB-contact. Degenen met actieve longtuberculose bevestigd door een sputumkweek en borstfilm werden toegewezen aan de actieve tbc-groep (). Frequente TB-contacten () omvatten de volgende personen (1) medisch personeel dat gedurende ten minste 10 jaar in het TB-centrum had gewerkt en nooit besmet was geweest en (2) familieleden van TB-patiënten, clinici en verpleegkundigen die langdurig contact hadden met TB-patiënten en nooit besmet waren geweest. Alle frequente TB contacten waren gevaccineerd met BCG en ondergingen jaarlijks een röntgenfoto van de borst; wanneer de borstfoto’s abnormaal waren, werd een Mantoux test uitgevoerd. Wij sloten personen uit met diabetes, maligniteit, of enige andere ziekte die immunodeficiëntie zou kunnen veroorzaken. De twee groepen waren gematched op geslacht en leeftijd (Tabel 1).
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Duur van de ziekte werd gedefinieerd als het interval tussen de diagnose en de bloedafname. Duur van de blootstelling werd gedefinieerd als het interval tussen het begin van het werk in een tbc-centrum en de bloedafname. |
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||
2.2. Celvoorbereiding
Perifere bloedmononucleaire cellen (PBMC’s) werden geïsoleerd uit met heparine behandeld bloed dat was afgenomen bij de 2 groepen donoren met behulp van een standaard Ficoll-Paque (Pharmacia, Uppsala, Zweden) gradiënt. PBMC’s (cellen/mL) werden geresuspendeerd in RPMI 1640-medium, aangevuld met L-glutamine en 10% foetaal kalfsserum. Na incubatie gedurende 1 uur in een kolf van 75 cm2 in een vochtige 37°C, 5% CO2 incubator, werd het medium met niet-klevende cellen overgegoten in een conische buis, en werd de kolf tweemaal gewassen met serumvrij medium om alle resterende niet-klevende cellen te verwijderen. Adherente monocyten werden verwijderd door ze voorzichtig af te schrapen met een plastic celschraper. De cellen werden overgebracht naar een conisch buisje, gecentrifugeerd om de wasoplossing te verwijderen, en opnieuw gesuspendeerd tot cellen/ml in aangevuld medium. De adherente celpopulatie bevatte meer dan 85% CD14+ cellen.
2.3. Antigen
MTB geïsoleerd uit patiënten met tuberculose werd geresuspendeerd in fosfaatgebufferde zoutoplossing en gedurende 70 minuten in een waterbad bij 70°C verhit. De bacteriën werden vervolgens met een sonicator van New Highway (Farmingdale, NY, VS) gesoniceerd. De eiwitconcentratie van het bacterieel homogenaat werd bepaald met de Pierce BCA protein assay kit (IL, USA) en bewaard bij -20°C.
2.4. Cytofluorometrische analyse
Cytometrische analyse werd uitgevoerd met een FACS-cytometer (Becton Dickinson). Een totaal van cellen werden geïncubeerd met elk monoklonaal antilichaam in verzadigde hoeveelheden in 50 pi kleuring buffer (evenwichtige zoutoplossing Hank’s: 1% BSA en 0,1% natriumazide) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur en vervolgens driemaal gewassen met PBS. De cellen werden voorbereid voor analyse door suspensie in 500 pi van 1% paraformaldehyde in PBS. De monocyt bevolking was gated voor analyse op basis van een side-scatter en forward-scatter dot plot. Een totaal van 5.000 gated cellen werden gebruikt voor elke analyse. Gated cellen werden verder geanalyseerd door fluorescentiekleuring met fluoresceïne-isothiocyanaat-(FITC-) geconjugeerde anti-CD14 (Ancell).
2.5. Kwantificering van 1,25(OH)2D3
Gezuiverde monocyten werden gekweekt bij een dichtheid van cellen/mL in 100 μL in elk putje van een 96-wells weefselkweekplaat met 200 nM 25(OH)D3 opgelost in een eindconcentratie van 1% ethanol. Na 3 uur incubatie werd 1 ml acetonitril toegevoegd om de reactie te stoppen. De cellen en het medium werden geoogst en gecombineerd met een gelijk volume methanol om de lipiden te verwijderen. De hoeveelheid 1,25 (OH)2D3 werd bepaald met behulp van de 1,25-dihydroxyvitamine D 125I RIA kit (INCSTAR, Stillwater, MN, USA). In het kort werden 2 mL water en 5 mL methanol/water (70 : 30) aan een C18OH-patroon toegevoegd om zouten, polaire lipiden en pigmenten onder vacuüm te verwijderen. Vervolgens werd 5 mL hexaan / methyleenchloride (90 : 10) toegevoegd aan de C18OH cartridge om 25 (OH)D3 te verwijderen, en 5 mL hexaan / isopropanol (99 : 1) werd toegevoegd om 24,25 (OH)2D3/25,25 (OH)2D3 te verwijderen. Elke C18OH-patroon werd stevig vastgezet in een silica-patroon. Na toevoeging van hexaan/isopropanol (92 : 8) onder vacuüm werd de C18OH-patroon verwijderd. Ten slotte werd gezuiverd 1,25(OH)2D3 geëlueerd uit de silica cartridge in 5 mL hexaan/isopropanol (80 : 20). De niveaus van 1,25(OH)2D3 werden gekwantificeerd door competitieve radio-immunoassay (RIA) met gebruikmaking van 125I-gelabelde anti-1,25(OH)2D3 en anti-1,25(OH)2D3 antilichamen.
2.6. Behandeling met MTB-antigenen
Monocyten (cellen/mL) werden geïncubeerd met 10 μg/mL MTB en 200 ng/mL 25(OH)D3. Na 3 uur incubatie werd 1 ml acetonitril toegevoegd om de reactie te stoppen. De resulterende 1,25 (OH) 2D3 werd gezuiverd uit de cellen en het medium en gekwantificeerd door RIA. De rest van de procedure was dezelfde als voor de vorige assay.
2.7. Statistische analyse
Alle gegevens werden geanalyseerd met behulp van de Student’s -test.
3. Resultaten
3.1. Geïoniseerd Calcium en 1,25 Dihydroxyvitamine D3 Concentraties bij een patiënt met actieve TB en Uremie
Geïoniseerd calcium en 1,25(OH)2D3 in het serum werden bepaald op verschillende tijdstippen vanaf het eerste bezoek tot één jaar na de voltooiing van de antituberculosebehandeling. Zoals getoond in Figuur 1, correleerden de niveaus van geïoniseerd calcium met de concentratie van 1,25(OH)2D3 (Figuur 1).
3.2. Studie Populatie
Vijfentwintig personen werden gerekruteerd in de groep van frequent TB-contact en 25 patiënten in de actieve TB-groep. De gemiddelde leeftijd en de geslachtsverhouding verschilden niet significant tussen de groepen. De karakteristieken van de dataset zijn weergegeven in Tabel 1.
3.3. 1,25(OH)2D3 Kwantificering
Monocyten werden gedurende 3 uur gekweekt met 25(OH)D3. Vervolgens werd 1,25(OH)2D3 gezuiverd uit de cellen en het medium en gemeten door RIA. Zoals te zien is in Figuur 2, was de hoeveelheid 1,25(OH)2D3 in de actieve TB-groep pg/mL (gemiddelde ± SD), wat significant hoger was dan die in de groep met frequent TB-contact () (). Wanneer monocyten gelijktijdig werden geïncubeerd met MTB en 25(OH)D3 gedurende 3 uur, daalde de hoeveelheid 1,25(OH)2D3 in de actieve TB-groep aanzienlijk in vergelijking met die zonder MTB ( en , resp.) () (zie figuur 3). Er was geen verschil tussen monocyten met of zonder blootstelling aan MTB in de groep met frequent TB-contact ( en , resp.).
Kwantificering van 1,25(OH)2D3 bij patiënten met actieve TB en frequente TB-contacten. RIA-meting van 1,25(OH)2D3 gezuiverd uit monocytensuspensies gekweekt met 25(OH)D3 gedurende 3 uur. De hoeveelheid 1,25(OH)2D3 in de actieve TB-groep was significant hoger dan die in de groep met frequente TB-contacten. Elke kolom vertegenwoordigt het gemiddelde van 1,25 (OH)2D3 kwantificering. De foutbalkjes vertegenwoordigen de standaardafwijking. *.
Kwantificering van 1,25(OH)2D3 bij patiënten met actieve TB en frequente TB-contacten met of zonder M. tuberculosis (MTB) antigeen. Monocyten werden gepulst met 25(OH)D3 met of zonder MTB. De hoeveelheid 1,25(OH)2D3 met MTB-blootstelling daalde significant vergeleken met die zonder MTB in de actieve TB-groep. Elke kolom vertegenwoordigt het gemiddelde van 1,25 (OH)2D3 kwantificering. De foutbalkjes vertegenwoordigen de standaardafwijking.
4. Discussie
Wij stelden vast dat 1,25(OH)2D3 niveaus correleerden met geïoniseerde calciumniveaus bij een uremische patiënt met longtuberculose. Bij actieve longtuberculose waren de serumspiegels van 1,25(OH)2D3 bij deze patiënt hoog, wat op zijn beurt hoge niveaus van geïoniseerd calcium induceerde. Na behandeling daalden zowel de 1,25(OH)2D3 als de geïoniseerde calciumspiegels. Theoretisch is bij een uremische patiënt de renale CYP27B1-activiteit triviaal. Lage serum 1,25(OH)2D3 niveaus worden vaak waargenomen bij uremische patiënten. In overeenstemming met wat is waargenomen bij de mens, worden in een anefrisch muismodel ook lage 1,25(OH)2D3 niveaus waargenomen. Echter, een extrarenale bron van CYP27B1 is beschreven voor meer dan 6 decennia. Harrell en Fisher waren een van de eersten om extrarenale synthese van 1,25(OH)2D3 onder pathologische omstandigheden te vinden. Deze auteurs stelden het verband vast tussen ontregelde calcium homeostase en sarcoïdose. Weefsel macrofagen werden later aangetoond als een extrarenale bron van 1,25(OH)2D3 productie in deze patiëntengroepen . Steeds meer weefsels bleken CYP27B1 tot expressie te brengen door verschillende studiegroepen, zoals huidmelanocyten, weefselmacrofagen, en restcellen van de placenta . Verrassend genoeg bezit niet elke cel die CYP27B1 tot expressie brengt enzymatische activiteit . Om het potentieel van circulerende monocyten om bij te dragen aan hoge 1,25(OH)2D3 niveaus te verduidelijken, gebruikten wij een ex vivo bioassay met 25(OH)D3 als substraat om de activiteit van CYP27B1 te bepalen. Onze resultaten tonen aan dat de CYP27B1 activiteit in monocyten van patiënten met actieve TB significant hoger is dan die in monocyten van personen met frequent TB contact. Circulerende monocyten dragen bij aan de omzetting van 25(OH)D3 in het actievere 1,25(OH)2D3. Intrigerend genoeg werd vitamine D3 traditioneel beschouwd als een endocriene factor; 1,25(OH)2D3 geproduceerd op lokale plaatsen (renale tubuli) wordt door het bloed vervoerd om andere weefsels of organen te beïnvloeden, bijvoorbeeld bot. De laatste decennia is echter aangetoond dat vitamine D3 ook andere dan endocriene functies vervult. Het door ontstekingscellen geproduceerde 1,25(OH)2D3 kan de vitamine D-receptorexpressie in zowel naburige cellen als in de ontstekingscellen zelf stimuleren. Door binding aan de vitamine D-receptor en de retinoïde-receptor kan het ligand-receptor complex zich binden aan de promotors van vele ontstekingsgenen. Vanwege deze effecten werd vitamine D3 geacht zowel paracriene als autocriene functies te hebben. In tegenstelling tot de endocriene functie van vitamine D3 als calciumregulator, zetten de paracriene en autocriene functies ontstekingscellen aan tot de productie van antibacteriële peptiden en bevorderen zij het autofagieproces. Omdat 1,25(OH)2D3 lokaal geproduceerd wordt en niet naar doelplaatsen gebracht wordt voor de regulatie van de calcium homeostase, heeft zijn productie geen invloed op het serum calciumgehalte. Interessant is dat we in deze studie ontdekten dat 1,25(OH)2D3 geproduceerd door monocyten een speciaal geval was. Hoewel 1,25(OH)2D3 geproduceerd door monocyten plaatselijk kan werken, worden deze cellen door het bloed naar weefsels in het hele lichaam vervoerd. Het door monocyten geproduceerde 1,25(OH)2D3 gedraagt zich ook als een endocriene factor. Monocyten zijn wellicht de enige cellen in ons lichaam die de endocriene, paracriene en autocriene functies van vitamine D3 kunnen orkestreren. Een interessante vraag is wat de relatieve bijdrage is van monocyte bron van 1,25(OH)2D3 aan het totale 1,25(OH)2D3 niveau. Dusso et al. stelden vast dat de maximale productie van 1,25(OH)2D3 uit monocyten triviaal is (in fmole/uur/microgram DNA) vergeleken met de 1,25(OH)2D3 concentratie in normaal (in pmol/mL) . Maar de gegevens zijn van een ex vivo experiment, we weten niet hoeveel monocyten in het lichaam gestimuleerd worden om 1,25(OH)2D3 te produceren. Wij speculeren dat de relatieve bijdrage van monocyten als bron van 1,25(OH)2D3 aan het totale 1,25(OH)2D3 niveau klein is in de meeste omstandigheden. Zelfs bij patiënten met granulomateuze ziekte, hebben slechts weinigen van hen klinische symptomen van hypercalciëmie als gevolg van een hoge 1,25(OH)2D3-spiegel. Ons indicatorgeval is één van hen.
Wij vonden ook dat wanneer monocyten van patiënten met actieve TB worden gekweekt met MTB-antigeen, de 1,25(OH)2D3-conversie significant lager is dan wanneer geen antigeen wordt toegevoegd. In de groep met frequent TB-contact was er geen verschil tussen met of zonder MTB-antigeen. Er zijn twee mogelijke verklaringen voor deze waarneming. Ten eerste kunnen geprimede monocyten van patiënten met actieve TB meer 24(OH) hydroxylase (CPY24) activiteit induceren dan hun tegenhangers, die 1,25(OH)2D3 actief hydroxyleren tot calcitroïnezuur, wanneer zij verder gestimuleerd worden met MTB-antigeen. vitamine D3 induceert niet alleen ontstekingsgenproducten maar ook de expressie van CPY24 . CPY24 is een belangrijk katabool enzym van vitamine D3. De CYP27B1- en CYP24-activiteiten worden diametraal tegenovergesteld gemoduleerd om de serumniveaus van 1,25(OH)2D3 te controleren. Als gevolg van deze gecoördineerde actie wordt hypercalciëmie zelden bij patiënten waargenomen. De groep die frequent in contact kwam met TB vertoonde een nog beter gecoördineerde actie, wat de reden is waarom er geen verandering was in de omzetting van 1,25(OH)2D3 na stimulatie met MTB-antigeen. Een tweede verklaring is dat de CPY27B1-activiteit uitgeput raakt wanneer monocyten opnieuw worden gestimuleerd met MTB-antigeen.
mRNA-expressie werd in deze studie niet bepaald om de volgende redenen. Ten eerste was voor de ex vivo bioassay een groot aantal monocyten van deelnemers nodig. Als we zowel kwantitatieve mRNA-expressie als de ex vivo bioassay hadden uitgevoerd, hadden we van elke deelnemer meer dan 30 ml bloed moeten afnemen. De inzameling van deze hoeveelheid bloed werd door onze ethische commissie afgekeurd. Ten tweede, zoals eerder aangegeven, kunnen sommige weefsels CYP27B1 tot expressie brengen zonder aantoonbare enzymatische activiteit. mRNA niveaus zijn niet altijd gecorreleerd met enzymatische activiteit. Hoewel CYP27B1 in sommige weefsels tot expressie komt, werd er geen enzymactiviteit gedetecteerd. In toekomstige studies moeten de niveaus van CYP27B1 en CYP24 en de metabolieten van vitamine D3, zoals calcitroenzuur en 24,25(OH)2D3, worden gekwantificeerd om het vitamine D3-metabolisme in het pathofysiologische proces van tuberculose te verduidelijken.
5. Conclusie
In conclusie, calcium niveaus correleerden met 1,25(OH)2D3 niveaus in een uremische patiënt besmet met tuberculose. Verder vonden we dat de CYP27B1 activiteit in monocyten hoger is bij patiënten met actieve tuberculose dan bij patiënten met frequent tuberculosecontact.
Ethische goedkeuring
Dit studieproject werd goedgekeurd door de Institutional Review Board van het Kaohsiung Medical University Hospital. Het goedkeuringsnummer is KMUH-IRB-20130103.
Belangenconflict
De auteurs verklaren dat er geen belangenconflict is voor dit paper.
Bijdrage van de auteurs
Yi-Ching Tung en Wen-Chan Tsai voerden de experimenten uit en schreven het paper. Tsan-Teng Ou en Wen-Chan Tsai ontwierpen de studie en verzamelden de specimens. Alle auteurs hebben het einddocument gelezen en goedgekeurd.