Een kritische rol van CD29 en CD49f in het mediëren van metastasering voor kanker-initiërende cellen geïsoleerd uit een Brca1-geassocieerd muismodel van borstkanker

CSC’s in Brca1-mutante kankercellen mediëren celmigratie in vitro

Wij hebben eerder CD24+CD29+ cellen en CD24+CD49f+ cellen geïsoleerd die verrijkt zijn met kanker-initiërende cellen of CSC’s uit primaire mammatumoren ontwikkeld in Brca1-mutante muizen of uit een gekweekte cellijn, (W0069), die was afgeleid van een Brca1-mammatumor.39 Om de rol van deze cellen in metastase te testen, sorteerden we CD24 + CD29 + cellen (zullen worden genoemd CSC’s) en CD24-CD29- cellen (niet-CSC’s) van de W0069 cellijn die ongeveer 15% CD24 + CD29 + cellen bevatten, zoals eerder aangetoond,39 en we onderzochten migratie vermogen met behulp van zowel de wond-helende en transwell assays. Na 24 uur, CD24 / CD29 dubbel-positieve cellen vertoonden een betere migratie vermogen in vergelijking met de dubbel-negatieve cellen zoals blijkt uit de wondgrootte (figuur 1a). Transwell migratie assay toonde ook een significant verschil in het aantal gemigreerde cellen zowel aan het onderste oppervlak van het filter (175.6±19 vs 54.2±18.1, **P<0.01) en de onderste kamer van de transwell (82.3±5.5 vs 4.3±2.1 kolonies, **P<0.01) (figuur 1b). Vergelijkbare resultaten werden verkregen wanneer we verschillende subklonen afgeleid van dezelfde cellijn, positief of negatief voor de aanwezigheid van CSC’s (gegevens niet weergegeven) onderzocht. Om te bevestigen dat CSC’s hebben verhoogde beweeglijkheid, mengden we verschillende hoeveelheden van W0069 cellen met dubbel-negatieve cellen gesorteerd uit de W0069 cellijn. Zoals blijkt uit figuur 1c, migratie vermogen daalde als het aantal dubbel-positieve cellen werd verminderd, hoewel het totale aantal gebruikte cellen stabiel bleef door verhoging van het aantal CD24-CD29-cellen. Door te beginnen met 5 × 104 W0069 cellen, vonden we dat gemigreerde cellen 52.6±15.5 kolonies gevormd in de onderste kamer. Wanneer 4 × 104 W0069 cellen werden gemengd met 1 × 104 dubbel-negatieve cellen, werd het aantal kolonies teruggebracht tot 16±2.6. Het aantal kolonies verder afgenomen wanneer we bleven het aantal W0069-cellen en het verhogen van het aantal CD24-CD29-cellen (figuur 1c). Dezelfde resultaten werden verkregen wanneer W0069 cellen werden gemengd met een subkloon (W0069-202), die alleen CD24-CD29-cellen (Supplementary Figuur 1a en b) heeft. Omgekeerd hebben we aangetoond dat het aantal kolonies werd verhoogd wanneer het aantal CD24 + CD29 + cellen gebruikt werd geleidelijk verhoogd (Supplementary Figure S1c). Om verder te controleren de rol van CSC’s in migratie, W0069-groen fluorescent eiwit gelabelde cellen, positief voor de aanwezigheid van CSC’s, werden gebruikt en gemengd met gesorteerde niet-gelabelde CD24-CD29-cellen. Door verhoging van het aantal positieve cellen, merkten we een toename van het aantal kolonies gevormd door de gemigreerde cellen, en alle gevormde kolonies waren groen wanneer gecontroleerd onder een fluorescentie microscoop, wat impliceert dat migratie kan alleen worden gezien wanneer CD24 + CD29 + cellen aanwezig zijn in de celkweek (Figuur 1d en e). Samen suggereren deze gegevens dat CSC’s een verhoogde beweeglijkheid vertonen in Brca1-gemuteerde kankercellijnen.

CSCs in Brca1-mutante kanker mediëren kanker metastase in vivo

Naar aanleiding van deze metastase hebben we de potentiële rol van CSCs in metastase in vivo beoordeeld. Vers gesorteerde CD24 + CD29 + en CD24-CD29- cellen en subklonen positief of negatief voor dezelfde markers van de W0069 cellijn werden geïmplanteerd in de borstklier van 6-8 weken oude maagdelijke athymische (nude) muizen. Ten eerste merkten we dat tumorgroei langzamer was wanneer gesorteerde CD24-CD29-cellen werden vergeleken met CD24 + CD29 + cellen (figuur 2a en b), die consistent is met een opvatting dat deze populatie verrijkt voor CSC’s.39 Vergelijkbare resultaten werden verkregen wanneer subklonen ofwel positief of negatief voor de aanwezigheid van CSC’s werden gebruikt (data niet weergegeven). Hoewel muizen geïnjecteerd met CD24+CD29+ cellen eerder gedood moesten worden (dag 49-54) dan muizen geïnjecteerd met CD24-CD29- cellen (dag 60-69) vanwege een grotere tumorlast, was er een significante toename in de aanwezigheid van metastasen in de groep muizen geïnjecteerd met CD24+CD29+ cellen. In het bijzonder hadden 3/15 muizen geïmplanteerd met negatieve cellijnen één kleine tumorknobbel in de long per muis (Figuur 2c en d). Daarentegen bleken 13/18 muizen geïmplanteerd met positieve cellijnen metastatische knobbeltjes in de longen te bezitten met een totaal van meer dan 100 knobbeltjes (dit aantal kan worden onderschat omdat de grootte van de meeste knobbeltjes veel groter was en knobbeltjes niet nauwkeurig konden worden geteld wanneer er te veel in één long waren) (figuur 2c en d). Omdat er ongeveer een zevenvoudig (5000mm3/700mm3) verschil in primaire tumorgrootte was tussen de positieve en negatieve tumoren, hadden wij de mogelijkheid overwogen dat het verschil in metastase kan worden toegeschreven aan het verschil in tumorgroei. Het is echter bekend dat tumormetastase begint in de beginfase wanneer de tumoren klein zijn, eerder dan in de late fase wanneer ze groot zijn,40 wat tegen deze mogelijkheid pleit. Bovendien is het verschil in aantal knobbeltjes ongeveer 33-voudig (100/3) en de meeste knobbeltjes afkomstig van dubbel-positieve cellen zijn veel groter dan die van dubbel-negatieve cellen, die de verschillende metastatische vermogen van de twee subpopulaties benadrukt. Wat de oorsprong van de drie metastatische knobbeltjes betreft, is het mogelijk dat de dubbel-negatieve populatie nog enkele cellen bevat die een lager kankerinitiërend en metastatisch vermogen hebben. Het is ook mogelijk dat sommige CD24-CD29-cellen deze capaciteiten verwerven door de-differentiatie. Dit zijn interessante vragen die verder onderzoek verdienen.

CD29 en CD49f spelen een cruciale rol bij het mediëren van kankermetastase

Intrigerend is dat profilering van deze metastatische tumoren door middel van fluorescentie-geactiveerde celsorteeranalyse met CD24- en CD29-markers aan het licht bracht dat die van de dubbel-positieve cellijnen een vergelijkbaar profiel hadden als de primaire tumoren of de oorspronkelijke kankercellijn (figuur 3a, links). Aangezien alleen CSC’s binnen de tumor kan recapituleren de oorspronkelijke tumor heterogeniteit, dit geeft aan dat CSC’s metastaseren en rijden de vorming van de metastatische tumoren. In tegenstelling, geen CD24 en CD29 dubbel-positieve cellen werden gedetecteerd in de tumoren afgeleid van de negatieve cellijnen, zelfs nadat ze metastaseren (figuur 3a, rechts), zoals blijkt uit de fluorescentie-geactiveerde cell sorting analyse. Bovendien waren we in staat om CD24 + CD29 + cellen te detecteren door immunofluorescentie kleuring in metastatische knobbeltjes in de long van tumoren geïnitieerd door implantatie met CD24 + CD29 + cellen (figuur 3b), maar niet van tumoren geïnitieerd door implantatie met CD24-CD29- cellen (data niet weergegeven). In overeenstemming met de waarneming dat CD24 + CD29 + cellen een hogere mobiliteit dan CD24-CD29-cellen hebben, kleuring met antilichamen tegen CD24 en CD29 ontdekte ook CD24 + CD29 + cellen in migrerende cellen tijdens wond-genezing assay (figuur 3c). Deze resultaten ondersteunen het idee dat CSC’s een verhoogde beweeglijkheid vertonen, zowel in vitro als in vivo, en een cruciale rol spelen in het aansturen van het metastatische vermogen van Brca1-gemuteerde mammatumoren.

Zowel CD29 (β1 integrine) als CD49f (α6 integrine) zijn integrinesubeenheden, die dienen als extracellulaire matrixreceptoren.41 Omdat extracellulaire matrix betrokken is bij celmobiliteit en kankermetastase,41 waren wij geïnteresseerd om te bepalen of CD29 en CD49f alleen dienen als merkers voor CSCs of dat zij daadwerkelijk een kritieke rol spelen bij het bemiddelen van kankermetastase. We eerst knock-out CD29 in W0069 en CD24 + CD29 + cellen met behulp van een individuele small interfering RNA (siRNA) gericht op de open reading frame van CD29, en onze gegevens bleek een opmerkelijke, maar niet statistisch verminderde cel migratie van siCD29 cellen in vergelijking met controle cellen (Figuur 4a en b). Omdat CD29 en CD49f heterodimeren vormen, vermoedden wij dat CD49f sommige functies zou kunnen compenseren wanneer CD29 expressie was verstoord. Om dit te onderzoeken, hebben we vervolgens CD49f uitgeschakeld door siRNA in deze cellen (figuur 4a). Onze gegevens toonden aan dat knockdown van CD49f alleen ook lichtjes het vermogen van celmigratie verminderde tot vergelijkbare niveaus waargenomen in siCD29-behandelde cellen (figuur 4b). Echter, een duidelijke vermindering van de cel migratie, maar niet levensvatbaarheid van de cellen, werd waargenomen wanneer beide werden neergehaald op hetzelfde moment (figuur 4a-d). Dezelfde resultaten werden verkregen door gebruik te maken van een pool van siRNAs tegen vier verschillende regio’s in het open leesraam van deze genen (supplementaire figuur 2a-c). We hebben ook gecontroleerd expressie van vier verwante integrines (integrines α5 en 7 en integrines β2 en 3) na knocking down CD29 en CD49f, en gegevens wijzen erop dat deze siRNAs niet expressie van andere integrins exclusief cross-inhibitory activiteit van deze siRNAs aan andere integrins (Supplementary Figuur 2d) veranderen. Al met al impliceren deze bevindingen dat integrines α6 en β1 een overlappende, maar kritische functionele rol in de migratie van CSCs kunnen hebben. Door de cellen te sorteren met integrines α6 en β1 als markers, verrijken we dus de cellen waarin deze eiwitten een functionele rol kunnen spelen bij het mediëren van celmigratie in vitro en kankermetastase in vivo.

CSC’s vertoonden epitheliale naar mesenchymale overgang signatuur genexpressie

Om het mechanisme dat ten grondslag ligt aan de verhoogde metastatisch vermogen van de CSC’s te begrijpen, voerden we morfologische en moleculaire analyses op zowel CD24 + CD29 + en CD24-CD29- cellen. Uit onze analyse bleek dat de CD24-CD29- cellen prominenter membraangebonden E-cadherine vertoonden, een marker voor epitheliale cellen, dan CD24+CD29+ cellen (figuur 4e). qRT-PCR analyse ontdekte ook hogere expressieniveaus van E-cadherine in CD24-CD29- cellen dan CD24+CD29+ cellen (figuur 4f). In overeenstemming met de verminderde expressie niveaus van E-cadherine, CD24 + CD29 + cellen vertoonden ook hogere expressie niveaus van verschillende marker genen voor mesenchymale cellen zoals blijkt uit qRT-PCR (figuur 4f), en western blot analyse (Supplementary Figuur 2e). Omdat beide celtypen afkomstig waren van een mammacarcinoom, suggereert het versterkte mesenchymale kenmerk van CD24+CD29+ cellen dat zij een epitheliale naar mesenchymale transitie hebben ondergaan, wat een moleculaire basis biedt voor hun verhoogde beweeglijkheid in vitro en kankermetastase in vivo.

Samenvattend hebben we het metastatisch potentieel bestudeerd van CSC’s verrijkt in CD24+CD29+ celpopulatie geïsoleerd uit een Brca1-mutant muismodel van borstkanker, en onze gegevens gaven aan dat CSC’s een veel hoger migratievermogen vertoonden dan niet-CSC’s in weefselkweek en een verhoogd metastatisch potentieel in allograft-naakte muizen. We toonden aan dat CD24+CD29+ cellen in staat blijven te differentiëren en heterogeniteit te reconstitueren in de metastatische tumoren, terwijl CD24-CD29- cellen dit niet kunnen. Een zeer intrigerende bevinding is echter dat CD29 en CD49f, die zijn gebruikt als markers voor het isoleren van CSCs van mammatumoren bij muizen,39, 42, 43 een overlappende, maar kritische rol hebben in het bemiddelen van migratie van CSCs. Bij muizen is β1-integrine de meest tot expressie komende integrine in mamma-epitheelcellen en speelt een cruciale rol in de progressie van kanker.44 Terwijl bij humane borstkankers α6-integrine in hoge mate tot expressie komt en een onafhankelijke prognostische factor is, zoals blijkt uit een studie met een tijdsafhankelijk effect, beperkt tot de eerste 2 jaar van follow-up.45 Toch blijft de potentiële rol van beide genen in CSC’s van borstkankers ongrijpbaar. Onze gegevens toonden aan dat een verminderde functie van β1 integrine of α6 integrine alleen tot een veel milder effect leidt dan het gelijktijdig uitschakelen van beide genen. Deze bevinding is consistent met het feit dat beide integrines met elkaar kunnen paren om heterodimeren te vormen voor extracellulaire matrix componenten zoals fibronectine en laminine.41, 46, 47, 48, 49 Er is gesuggereerd dat een kwaadaardig sociaal netwerk cel-cel adhesie en communicatie tussen CSCs en hun micro-omgeving medieert.20, 21 Onze studie impliceert een belangrijke rol van β1/α6 integrines in het mediëren van dit netwerk. Specifiek kunnen β1/α6 integrines de CSCs-stroma interactie bemiddelen, waarbij extracellulaire matrix signalering wordt doorgegeven aan cellulaire machines en leidt tot de verhoogde activiteit van CSCs in termen van levensvatbaarheid, differentiatie en metastase.