Circadiane biologische klokken zijn biochemische oscillatoren die ongeveer elke 24 uur een cyclus doorlopen en die kunnen worden gereset (getrild) door blootstelling aan licht en andere omgevingssignalen. Bij dieren is er een centrale oscillator in de hersenen die het circadiane gedrag van het hele organisme controleert, alsmede perifere oscillatoren in sommige weefsels. De oscillatie is het gevolg van een terugkoppellus waarbij een aantal transcriptiefactoren van de klok betrokken zijn, waaronder tijdloos (Tim), periode (Per), klok (Clk) en Bmal1, alsmede cryptochromen. Cryptochromen komen alom tot expressie in de organen en weefsels van alle organismen, en het zijn over het algemeen nucleaire eiwitten die de genexpressie reguleren. De best bestudeerde dierlijke cryptochromen zijn Drosophila cryptochroom Cry en muis cryptochromen Cry1 en Cry2 , en de twee Arabidopsis cryptochromen CRY1 en CRY2 zijn ook uitvoerig bestudeerd.
Drosophilacryptochromen
Drosophila Cry is een overwegend nucleair eiwit dat de regulatie van de circadiane klok door licht medieert, hoewel het ook in het cytosol kan worden aangetroffen. Het reguleert de circadiane klok door een directe interactie met het eiwit Tim om de negatieve terugkoppellus van de klok te onderdrukken (Figuur 3a). Licht stimuleert de Cry-Tim interactie, die ubiquitinatie en proteosoom-afhankelijke degradatie van Tim bevordert en de vorming van het Per-Tim heterodimeer onderdrukt. De remming van een heterodimeer van de Klok- en Cyclus-eiwitten door het Per-Tim heterodimeer wordt aldus opgeheven en de fase van de circadiane oscillatie wordt gereset (figuur 3a). Cryptochroom is blijkbaar niet de enige fotoreceptor die de circadiane klok in Drosophila entraint, echter. De gedragsritmiek van de crybmutant vlieg, die Cry functie ontbreekt, kan niettemin worden getriggerd in reactie op licht, tenzij de signaaltransductie door het visueel pigment is ook uitgeschakeld. Naast zijn rol als fotoreceptor voor de entrainment van de centrale oscillator van Drosophila, heeft Cry ook een lichtonafhankelijke rol in de functie van de perifere circadiane oscillator .
Regulatie van de circadiane klok door dierlijke cryptochromen. (a) In Drosophila onderdrukt Cry de negatieve terugkoppelingslus van de circadiane klok door op een lichtafhankelijke manier aan Tim te binden; dit resulteert in de proteosoomafhankelijke ubiquitine-gemedieerde afbraak van Tim (Ubq, ubiquitinatie) en dus in remming van de werking van het Per-Tim heterodimeer. Zonder Cry zou het Per-Tim heterodimeer de kern binnendringen en de binding van de klokcycluseiwitten (Per, Clk en Bmal1) aan de E-box in de promotors van klokgenen afremmen, waardoor de expressie ervan wordt verhinderd. (b) Bij zoogdieren zijn cryptochromen integrale onderdelen van de negatieve terugkoppellus. Het Cry-eiwit interageert met Per om de activiteit van de transcriptiefactoren Clk en Bmal1 te onderdrukken en aldus de transcriptie te onderdrukken. Cryptochromen zijn mogelijk ook betrokken bij de fototraining van de circadiane klok van zoogdieren; het is bekend dat klokgenen worden gereguleerd in reactie op neurale signalen van het netvlies als reactie op licht, maar het is nog niet duidelijk of hierbij cryptochromen betrokken zijn.
Cryptochromen van zoogdieren
De twee functies van Drosophila Cry – als fotoreceptor voor de entrainering van de circadiane klok samen met visuele pigmenten en als integrale component van het circadiane-oscillator-eiwitcomplex – zijn ook kenmerkend voor de cryptochromen van zoogdieren. Cryptochromen van zoogdieren zijn voornamelijk nucleaire eiwitten, maar ze kunnen ook in het cytosol worden aangetroffen. Net als Drosophila Cry vervullen zoogdier-cryptochromen zowel lichtafhankelijke als lichtonafhankelijke functies bij de regeling van de circadiane klok. Verschillende waarnemingen tonen de licht-afhankelijke rol van zoogdier Cry-eiwitten aan. Knock-out muizen die één of beide Cry-genen missen, zijn niet of slechts in beperkte mate in staat de expressie van genen zoals Per en het protooncogen c-fos te induceren als reactie op licht. Bovendien hebben de pupillen van gemuteerde muizen die zowel Cry1 als Cry2 missen, een verminderde reflexrespons op licht.
Anderzijds vertoont de cry1 cry2 dubbelmutantmuis een schijnbaar normale ritmiciteit in licht-donker cyclische omstandigheden, maar verliest hij deze ritmiciteit onmiddellijk en volledig in vrijlopende (altijd donkere) omstandigheden. Deze waarnemingen wijzen erop dat de Cry-eiwitten een essentiële en lichtonafhankelijke functie vervullen in de centrale circadiane oscillator van zoogdieren, en dat cryptochromen niet de enige fotoreceptoren zijn die lichtsturing van de klok bewerkstelligen. Het feit dat cryptochromen integrale onderdelen zijn van de centrale oscillator van de muis maakt het vrijwel onmogelijk hun rol in de lichtsturing van de klok rechtstreeks te testen. Niettemin is gebleken dat, enigszins analoog aan de situatie bij Drosophila, de cry-mutant van de muis zijn vermogen om lichtinput te mediëren behoudt, tenzij tegelijkertijd ook de functie van de visuele pigmenten wordt verstoord. Triple-mutantmuizen met mutaties van beide cryptochromen en een netvliesdegeneratieve mutatie zijn bijna aritmisch onder licht-donker cycli. Deze resultaten tonen aan dat de Cry-eiwitten van zoogdieren inderdaad betrokken zijn bij de regulatie van de circadiane klok door licht, maar dat hun rol in de licht-afstelling van de circadiane klok redundant wordt uitgevoerd door andere fotoreceptoren. Het lijkt nu duidelijk dat de extra fotoreceptoren die samen met cryptochromen de circadiane klok van zoogdieren regelen, visuele staafkegel opsines en het verwante melanopsine eiwit zijn. Net als Drosophila Cry, hebben zoogdieren cryptochromen een fysische interactie met klokeiwitten, waaronder de promotor-bindende transcriptieregulatoren Per, Clk en Bmal1 (figuur 3b). In tegenstelling tot Drosophila Cry, zoogdieren Cry-eiwitten zijn componenten van de negatieve-feedback-lus van de circadiane klok (figuur 3b). De fysische interactie van cryptochroom met andere klokcomponenten beïnvloedt hun activiteit, interactie, degradatie, of nucleaire trafficking, en verandert bijgevolg de transcriptionele regulatie van de klokgenen . Maar de interactie tussen cryptochromen en andere klokeiwitten zoals Per, Clk en Bmal1 blijkt niet te worden beïnvloed door licht, wat suggereert dat dergelijke interacties misschien niet het mechanisme zijn van foto-entrainment van de circadiane klok, zoals ze dat wel zijn in Drosophila. Naast de directe regulatie van de transcriptie via fysische interactie met promotor-bindende transcriptieregulatoren, kunnen cryptochromen ook de circadiane klok beïnvloeden door deel te nemen aan de regulatie van histonmodificaties, maar hoe dit werkt moet nog worden opgehelderd.
Arabidopsiscryptochromen
Arabidopsis CRY1 en CRY2 zijn hoofdzakelijk nucleaire eiwitten die de regulatie van genexpressie en de afstelling van de circadiane klok in reactie op licht mediëren. CRY1 en CRY2 spelen een belangrijke rol in de fotomorfogenese van planten, zoals remming van stengelverlenging door blauw licht, stimulering van bladuitzetting door blauw licht, en regulering van bloeminitiatie door daglengte . Het lijkt erop dat cryptochromen ontwikkelingsveranderingen in planten controleren via veranderingen van genexpressie in reactie op licht. CRY1 en CRY2 zijn samen verantwoordelijk voor blauw-licht-afhankelijke veranderingen in genexpressie van tot 10-20% van het Arabidopsis-genoom.
Er zijn ten minste twee mechanismen waarmee cryptochromen nucleaire genexpressieveranderingen in reactie op licht kunnen beïnvloeden. Ten eerste kan een cryptochrome molecuul in wisselwerking staan met eiwitten die geassocieerd zijn met transcriptiemachines om de transcriptie rechtstreeks te beïnvloeden. Arabidopsis CRY2 bindt aan chromatine op een DNA-sequentie-onafhankelijke manier (en M. Maymon en C.L., ongepubliceerde waarnemingen), maar het is onduidelijk hoe een sequentie-onafhankelijk chromatine-interagerend eiwit genexpressie kan reguleren. In tegenstelling tot de dierlijke cryptochromen waarvan is aangetoond dat ze transcriptie reguleren via fysische interacties met promotor-bindende transcriptieregulatoren, is een dergelijke interactie niet gerapporteerd voor plantaardige cryptochromen. Een alternatief model is dat plantaardige cryptochromen kunnen interageren met eiwitten die andere cellulaire functies uitoefenen om de stabiliteit, modificatie en cellulaire trafiek van de transcriptieregulatoren te reguleren. Zo is bijvoorbeeld gebleken dat plantaardige cryptochromen interageren met een E3 ubiquitin ligase, COP1, hetgeen suggereert dat plantaardige cryptochromen kunnen werken op een wijze die nog niet is ontdekt voor de dierlijke cryptochromen. In overeenstemming met dit standpunt is onlangs ook ontdekt dat Arabidopsis cryptochromen de proteasoomafhankelijke afbraak van een belangrijke bloemregulator, CONSTANS, door blauw licht onderdrukken. Hoe cryptochromen dit precies doen moet verder worden onderzocht.
Mechanisme
Het katalytische mechanisme van cryptochromen is niet volledig opgehelderd, maar enige aanwijzingen kunnen worden gevonden in het mechanisme van CPD fotolyasen, waar FAD de belangrijkste katalytische rol speelt . In een DNA-reparatiereactie bindt CPD-fotolyase aan het pyrimidinedimeer van het DNA en “flipt” het uit het DNA-duplex in de FAD-toegangsholte van het enzym, om een stabiel complex te vormen. De andere chromofoor (pterine of deazaflavine), die ook wel de “antenne”-chromofoor wordt genoemd, absorbeert fotonen van blauw of UV-A-licht, en geeft de excitatie-energie door aan de flavine van FAD. Flavin in de aangeslagen toestand doneert een elektron aan het pyrimidine-dimeer om de cyclobutaanring te splitsen. Het elektron wordt tijdens dit proces weer aan flavine overgedragen, wat resulteert in regeneratie van flavine in de grondtoestand. Het gerepareerde dinucleotide past niet meer in de FAD-toegangsholte, zodat het losraakt van het fotolyase. De precieze rol van FAD en de FAD-access cavity in de functie van cryptochromen blijft onduidelijk, maar het is denkbaar dat het ook betrokken is bij elektron-transfer reacties.
Hoewel de PHR regio die de chromofoor(s) bevat het meest geconserveerde deel van de eiwitten is, is van het carboxy-terminale domein aangetoond dat het een rol speelt in de functie of regulatie van zowel dierlijke als plantaardige cryptochromen. Expressie van de carboxy-terminale domeinen van Arabidopsis cryptochromen gefuseerd met het markerenzym b-glucuronidase geeft een constitutieve groeireactie op licht, zelfs in duisternis, in afwezigheid van de PHR-regio. De PHR-regio’s van de cryptochromen van Drosophila en Xenopus zijn daarentegen fysiologisch actief in afwezigheid van het carboxy-terminale domein. Het carboxy-terminale domein van Drosophila Cry is belangrijk voor de stabiliteit van het eiwit, de interactie met Tim, en de gevoeligheid van de fotoreceptor voor circadiane lichtsignalen , terwijl het carboxy-terminale domein van Xenopus Cry nodig is voor de nucleaire lokalisatie .
Cryptochromen worden gereguleerd door fosforylering. Aangetoond is dat Arabidopsis cryptochromen worden gefosforyleerd in reactie op blauw licht en dat dit verband houdt met de functie en regulering van de fotoreceptoren. Wanneer Arabidopsis CRY1 tot expressie werd gebracht in insectencellen, bleek het bovendien ATP-afhankelijke en blauwlicht-afhankelijke autofosforylering te ondergaan. Het is niet bekend of dierlijke cryptochromen zich ook binden aan ATP, hoewel is aangetoond dat muis cryptochromen worden gefosforyleerd .
De interactie tussen de Arabidopsis CRY1 PHR regio en ATP heeft een paar interessante kenmerken die doen denken aan de interactie tussen pyrimidine dimeer en fotolyase : de fosfaatgroepen van ATP zijn blootgesteld aan oplosmiddel; de adenine en ribose groepjes zijn diep begraven in de FAD-toegangsholte; en ATP kan een water-gemedieerd contact hebben met FAD . De interactie van de Arabidopsis CRY1 pHR regio met ATP mist ook een aantal kenmerken die vaak gevonden worden in eiwit-ATP interacties, zoals eiwit-fosfaat interactie, eiwit-Mg2+ contact, en een nabijgelegen serine residu voor fosfotransfer . Een onderzoek van de topologie van de CRY1 PHR regio structuur toont echter aan dat al deze kenmerken mogelijkerwijs kunnen worden geleverd door het carboxy-terminale domein van het cryptochroom (figuur 4). De waarneming dat de serinerijke carboxy-terminale domeinen van Arabidopsis cryptochromen gefuseerd met β-glucuronidase constitutief gefosforyleerd zijn in vivo (, suggereert dat een fosfotransfer kan optreden van ATP gebonden aan de FAD-access holte naar het nabijgelegen carboxy-terminale domein (figuur 4a). Het is ook denkbaar dat foton-excited FAD elektron transfer naar de nucleotide en fosfotransfer van ATP naar serine residuen op het carboxy-terminale domein kan triggeren. Omdat het oppervlak van het PHR-gebied overwegend negatief geladen is, vooral op de plaats waar het carboxy-terminale domein waarschijnlijk zal interageren, zou het gefosforyleerde carboxy-terminale domein dan worden afgestoten van het PHR-gebiedsoppervlak, wat zou resulteren in een verandering van conformatie van cryptochroom. Door deze conformatieverandering zou het kunnen interageren met andere signaleringseiwitten en het lichtsignaal kunnen verspreiden (figuur 4a). Als alternatief kan een ander molecuul cryptochroom binden aan de FAD-toegangsholte ook de ontbrekende kenmerken leveren die nodig zijn voor een productieve ATP-cryptochroom interactie. Zowel CRY2-CRY2-interactie als CRY1-CRY2-interacties kunnen in Arabidopsis worden waargenomen (D. Shalitin, X. Yu, en C.L., ongepubliceerde waarnemingen). Vorming van een homo-oligomeer of een hetero-oligomeer van cryptochromen zou een mechanisme opleveren voor intermoleculaire fosfotransfer, waardoor de structuur van de cryptochromen kan veranderen (figuur 4b, c).
Mogelijke modellen van de fosforylatie-afhankelijke structuurveranderingen van plantencryptochromen in reactie op blauw licht. De PHR-regio is overwegend negatief geladen (-), en het carboxy-terminale domein (C) kan negatief geladen worden gemaakt door fosforylering (waarvoor ATP nodig is en anorganisch fosfaat, Pi, vrijkomt). In alle modellen leidt fosforylering tot binding van onbekende signaalpartners (X, Y, Z) en tot regulering van de ontwikkeling van de plant. (a) Eén model is dat fosforylering van het carboxy-terminale domein in reactie op licht wordt uitgevoerd door ATP dat aan het PHR-gebied is gebonden; dit leidt tot dissociatie van de twee domeinen. (b) Een tweede mogelijkheid is dat bij fosfotransfer als reactie op licht de interactie optreedt van twee cryptochromen die door hetzelfde gen worden gecodeerd. (c) Een andere mogelijkheid is dat bij intermoleculaire fosfotransfer de interactie tussen verschillende cryptochromen betrokken is. Alle drie scenario’s kunnen in plantencellen voorkomen, en de activiteit van een cryptochroom kan worden bepaald door de kinetiek van de verschillende reacties.