Correctieve factoren en herkenningssignalen
Een modelsysteem voor enzymvervangingstherapie ontstond uit studies van gekweekte huidfibroblasten afkomstig van patiënten met mucopolysaccharide-opslagziekten (MPS). Dergelijke fibroblasten vertoonden een buitensporige accumulatie van glycosaminoglycanen, hetgeen werd geïnterpreteerd als het gevolg van een ontoereikende afbraak van deze macromoleculen. Men ontdekte bij toeval dat een mengsel van fibroblasten afkomstig van patiënten met MPS I (Hurler syndroom) en MPS II (Hunter syndroom) een normaal patroon van glycosaminoglycaan metabolisme vertoonden (Figuur 1) . De twee ziekten waren bekend als genetisch verschillend, MPS I wordt op een autosomaal recessieve manier overgeërfd en MPS II is een X-gebonden aandoening, wat Fratantoni et al. tot de hypothese bracht dat de fibroblasten van verschillende genotypen elkaar van het ontbrekende genproduct voorzagen. Verdere studies toonden aan dat het voor een dergelijke kruiscorrectie niet noodzakelijk was dat de genetisch verschillende cellen met elkaar in contact kwamen, aangezien het door de ene geconditioneerde medium de andere kon corrigeren. De strategie van kruiscorrectie zou kunnen worden uitgebreid tot verwante ziekten – cellen die elkaar corrigeren zouden een verschillend genotype hebben, terwijl cellen die niet kruiscorrigeren hetzelfde genotype zouden hebben (maar zie de belangrijke uitzondering hieronder).
Figuur 1
Wanneer Hurler- en Hunter-cellen in cultuur werden gemengd, werd een in wezen normaal patroon van mucopolysaccharide-accumulatie verkregen; dat wil zeggen dat cellen van de twee verschillende genotypen elkaar in cultuur hadden gecorrigeerd. Aangepast met toestemming van . (meer…)
Omdat het Hurler syndroom was verondersteld een lysosomale opslag ziekte te zijn, gebaseerd op de observatie van de dramatisch gezwollen lever lysosomen in getroffen patiënten, veronderstelden Fratantoni et al. dat de ‘corrigerende factoren’ in geconditioneerd medium lysosomale enzymen zouden kunnen zijn die werden uitgescheiden door de ene cellijn en endocytosed door de andere. De corrigerende factoren kwamen echter niet overeen met enig lysosomaal enzym dat op dat moment bekend was (deze situatie veranderde een paar jaar later, toen een β-glucuronidase deficiëntie MPS werd ontdekt). De correctiefactoren Hurler en Hunter werden gezuiverd, niet uit geconditioneerd medium maar uit urine, een lichaamsvloeistof die relatief rijk is aan lysosomale enzymen. Functie werd toegewezen aan de gezuiverde factoren met behulp van een verscheidenheid van biochemische methoden, wat resulteerde in de Hurler en Hunter corrigerende factoren worden genoemd α-l-iduronidase en iduronaat sulfatase respectievelijk.
Cellen die Hurler corrigerende factor nodig hadden om hun glycosaminoglycan metabolisme te normaliseren (van patiënten met het syndroom van Hurler en met het syndroom van Scheie ) waren ook deficiënt in α-l-iduronidase activiteit ). Correctie van Hurler-fibroblasten ging gepaard met opname van α-l-iduronidase. Als een goed voorteken voor enzymvervangingstherapie, was de opname opmerkelijk efficiënt en hoefde slechts een zeer kleine hoeveelheid α-l-iduronidase te worden geïnternaliseerd om een volledige correctie te bewerkstelligen.
Dit zou het einde van het verhaal kunnen zijn geweest, behalve voor een kleine discrepantie in het elutiepatroon van de enzymatische activiteit en de corrigerende activiteit van een hydroxyapatietkolom , wat suggereert dat de twee activiteiten van de Hurler correctiefactor niet precies identiek waren. Naar aanleiding van deze discrepantie scheidden Shapiro et al. α-l-iduronidase in correctieve en niet-correctieve fracties op een kolom van heparine-Sefarose, hetgeen erop wijst dat de correctieve factor een eigenschap heeft die niet nodig is voor de katalytische activiteit, maar wel voor de opname. Evenzo werden meerdere vormen van β-glucuronidase gevonden, verschillend in opname en corrigerende activiteit.
Het bestaan van een specifiek signaal voor de opname van een lysosomaal enzym was gesuggereerd door de resultaten van een studie naar een nieuw ontdekte aandoening die lijkt op MPS – inclusion-cell disease (I-cell disease) genoemd vanwege de prominente fase-dense insluitsels in gekweekte fibroblasten. Hoewel deze fibroblasten meerdere lysosomale enzymdeficiënties vertoonden, bevatte het medium dat hen omringde een grote overmaat aan lysosomale enzymen . Echter, de enzymen gesecreteerd door I-cel ziekte fibroblasten werden niet endocytosed door andere cellen en waren niet correctief; vermoedelijk ontbrak het hen aan het signaal voor opname in lysosomen . Omdat een aantal lysosomale enzymen werden aangetast door dit defect in één gen (I-celziekte wordt op een autosomaal recessieve manier overgeërfd), werd verondersteld dat het signaal een post-translationele modificatie van de enzymproteïnen was. Voorts werd aangenomen dat het om een koolhydraat ging, aangezien het met een milde periodaatbehandeling kon worden vernietigd. Het concept van een op koolhydraten gebaseerd herkenningssysteem werd sterk beïnvloed door de ontdekkingen van Ashwell en collega’s betreffende de rol van koolhydraten in de opname van circulerende glycoproteïnen door de lever.
De aanwezigheid van een specifiek herkenbaar signaal impliceerde een verzadigbaar, receptormedieerd proces, en suggereerde dat de opname van lysosomale enzymen de Michaelis-Menten kinetiek zou volgen. Er werd verwacht dat analogen van de herkenningssignalen zich zouden gedragen als competitieve inhibitoren van de opname. Deze verwachting werd onderzocht via de opname van α-l-iduronidase en van β-glucuronidase door de overeenkomstige deficiënte fibroblasten. De ontdekking door Kaplan et al. dat de beste remmer van β-glucuronidase-opname mannose-6-fosfaat (M6P) was, en hun suggestie dat M6P het langgezochte herkenningssignaal was (of er deel van uitmaakte), was opzienbarend, aangezien er voordien geen gefosforyleerd koolhydraat op glycoproteïnen van zoogdieren was gerapporteerd. Het werd onmiddellijk bevestigd voor de opname van α-l-iduronidase en andere lysosomale enzymen, met behulp van een verscheidenheid van biochemische methoden ; het uiteindelijke bewijs kwam van structurele analyse van de gefosforyleerde koolhydraatgroepen . Het via endocytose ontdekte signaal bleek ook het signaal te zijn voor het richten van nascente hydrolasen naar lysosomen.
Het defect in I-celziekte, waardoor de cellen het M6P herkenningssignaal niet kunnen synthetiseren, bleek een tekort te zijn aan het eerste van de twee enzymen die betrokken zijn bij de synthese van het M6P-signaal. Twee receptoren voor M6P werden ontdekt; de chemie en biologie van de M6P-receptoren en hun rol in de celtransmissie werden een breed en zeer actief gebied van de celbiologie. Deze onderwerpen zijn het onderwerp van vele overzichtsartikelen, waaronder de hoofdstukken 3 en 5 van dit boekdeel. De betekenis van het M6P systeem voor enzymvervangingstherapie zal hieronder worden besproken.
Gelijktijdig met deze studies in gekweekte fibroblasten, leidde een in-vivo systeem tot de ontdekking van een ander signaal voor de opname van lysosomale enzymen. Verschillende lysosomale enzymen die intraveneus bij ratten werden geïnjecteerd, bleken snel uit de circulatie te worden verwijderd; zij bleven echter veel langer aanwezig als zij werden voorbehandeld met periodaat of als zij werden geïnjecteerd met een agalactoglycoproteïne. Ook hier werden koolhydraten verondersteld signalen te geven voor specifieke herkenning. In dit geval was mannose de belangrijkste suiker voor herkenning, en de opname vond plaats in reticulo-endotheliale cellen van de lever. Er werd aangetoond dat de mannose-receptor, die zowel N-acetylglucosamine en l-fucose als mannose herkent, voorkomt op het oppervlak van macrofagen. Het is van enig historisch belang dat de invertase-opname-experimenten, die een prominente plaats innamen in het oorspronkelijke voorstel voor enzymvervangingstherapie (zie boven), succesvol waren omdat invertase een glycoproteïne is met mannan-ketens die worden herkend door de mannose-receptor .