RESULTS
Biotypering van Shewanella-isolaten volgens twee afzonderlijke schema’s leverde vergelijkbare resultaten op (Tabel 1). De meeste klinische isolaten (74%) behoorden tot Gilardi biovar 2 (CDC biotype 2), en waren sucrose- en maltose-negatief bij groei op SS agar en op media met hoge NaCl-concentraties. Het enige grote verschil tussen het Gilardi-classificatieschema (6) en dat van Weyant et al. (22) was dat biovar 3 isolaten (sucrose-, maltose-, SS- en NaCl-negatief) door het CDC-biotypesysteem niet in groepen werden ingedeeld. In tegenstelling tot de menselijke isolaten, overheerste biovar 1 (CDC biotype 1) onder de niet-menselijke stammen (67%). Deze stammen produceerden typisch zuur uit maltose en/of sucrose en groeiden niet op agar met een hoog zoutgehalte of SS-agar. Gebaseerd op de recente taxonomische voorstellen van Nozue en anderen (15), zouden biovar 2 (CDC biotype 2) stammen geïdentificeerd worden als S. alga terwijl alle biovar 1 (CDC biotype 1) en 6 van 7 biovar 3 stammen zouden worden aangeduid als S. putrefaciens; de resterende biovar 3 stam werd vervolgens geïdentificeerd als S. alga. Klinisch bleek S. alga te overheersen (77%), terwijl de meerderheid van de niet-menselijke isolaten (89%) werd bevestigd als S. putrefaciens (tabel 1).
- View inline
- View popup
Biovar, biotype en soortaanduidingen van Shewanella-isolaten volgens verschillende schema’s
Alle tien Shewanella-isolaten werden, op één uitzondering na, geïdentificeerd alsS. putrefaciens, toen zij met het API 20E-, API NFT-, RapID NF Plus- en Vitek-systeem werden getest. Vier van de vijf S. putrefaciens-isolaten leverden onaanvaardbare profielnummers op het API 20E-systeem op (nrs. 0602026 en 0602006); de vijfde stam leverde een zeldzaam biotypenummer voor S. putrefaciens op. Alle S. alg-stammen leverden uitstekende identificatie als S. putrefaciens op met de API 20E. Het API NFT-systeem identificeerde alle 10Shewanella-isolaten als S. putrefaciens met goede tot uitstekende identificaties, met één uitzondering, ook een S. putrefaciens-stam (lage discriminerende waarde, 48 h). RapID NF Plus identificeerde alle 10 Shewanella-isolaten als S. putrefaciens, met een nauwkeurigheid van 99,9%. Op dezelfde manier werden alle stammen door Vitek (97 tot 99% nauwkeurigheid) geïdentificeerd als S. putrefaciens, hoewel drie S. putrefaciens-stammen 5 tot 9 uur incubatie nodig hadden voor de definitieve identificatie, in tegenstelling tot de 4 uur resultaten voor de andere 7 stammen. Koolhydraatreacties (arabinose en maltose) op de API 20E, API NFT, en Vitek systemen maken het echter mogelijk de meeste stammen correct toe te wijzen aan de relevante taxa (S. putrefaciens en S. alga) indien manueel afgelezen na definitieve identificaties als S. putrefaciens.
Vergelijking van de biochemische en enzymatische eigenschappen van Shewanella species bracht een aantal verschillen aan het licht (Tabel 2). Hemolyse op schapenbloed agar, zoals gerapporteerd door Nozue et al. (15), werd waargenomen bij alle S. alga stammen maar slechts bij een paar S. putrefaciens isolaten. De meeste S. alga-stammen vertoonden dit fenotype pas na langdurige incubatie (48 tot 72 h), en het gebied van hemolyse was vaak onregelmatig en moeilijk te detecteren. Andere activiteiten die eerder werden gevonden om S. alga en S. putrefaciens te scheiden, zoals groei bij 42°C, groei op media met hoge zoutconcentraties (6,5%), en zuurproductie uit l-arabinose, sucrose en maltose, werden bevestigd. We vonden een aanzienlijk groter aantal S. putrefaciens stammen die op SS agar groeiden dan eerder gerapporteerd; de meeste hiervan waren afkomstig van niet-menselijke bronnen. Met uitzondering van ribose was de productie van zuur uit koolhydraatoxidatie uniek geassocieerd met S. putrefaciens. Suikerpatronen varieerden echter aanzienlijk tussen deze isolaten, waarbij sommige positief waren voor arabinose, maltose en sucrose, terwijl andere alleen positief waren voor maltose of asaccharolytisch waren (biovar 3 stammen). Bij geselecteerde Shewanella-isolaten werden verschillende nieuwe enzymatische activiteiten gedetecteerd die voor zover wij weten nog niet eerder zijn gerapporteerd. Deze omvatten tyrosinase, alkylsulfatase, chitinase, en elastase activiteiten (Tabel 2); de meeste van deze enzymen werden gevonden in niet-menselijke isolaten vanS. putrefaciens. De meeste S. alg- enS. putrefaciens-stammen produceerden een siderofoor, zoals bepaald door Chrome Azurol S-tests. Deze activiteit was zwak, en vijf isolaten (drie S. alg en twee S. putrefaciens isolaten) groeiden niet op dit medium.
- View inline
- View popup
Biochemische en enzymatische eigenschappen van S. alga en S. putrefaciens
Selecte Shewanella-isolaten die goed groeiden bij 35°C werden verder gekarakteriseerd voor enzymatische activiteit met behulp van API-ZYM (tabel 3) en voor cellulaire vetzuurprofielen met het MIDI-systeem. Van de negen substraten die door één of beide Shewanella-soorten met API-ZYM werden aangevallen, waren de hogere totale activiteiten voor zeven van deze enzymen geassocieerd met S. alg. De enige activiteit die sterker bleek te zijn in S. putrefaciens was valine arylamidase, hoewel deze activiteit zelfs in deze stammen uiterst zwak was. Beide soorten produceerden een uniform sterke alkalische fosfatase activiteit. Een bijkomende observatie was dat alle S. alg-stammen consequent acht van deze negen enzymen produceerden, met als enige uitzondering valine arylamidase. S. putrefaciens daarentegen was heterogener, waarbij vier van de negen gedetecteerde enzymen niet universeel aanwezig waren in alle isolaten. Analyse van 14 S. putrefaciens-stammen wees uit dat de voornaamste vetzuren i-15:0, 17:1ω8c en 16:0 waren; sommige stammen produceerden grote hoeveelheden 16:1ω7c (9 tot 18%), terwijl andere verwaarloosbare hoeveelheden produceerden. Hoewel de meeste vetzuurpieken vrij consistent waren tussen de geteste S. alga- en S. putrefaciens-stammen, werden verschillende verschillen genoteerd (Tabel 4). Hogere gemiddelde waarden van pentadecaanzuur en cis-9-heptadecenoëzuur (17:1ω8c) werden genoteerd voor S. alg, terwijl het omgekeerde gold voor S. putrefaciens wat hexadecaanzuur en dodecaanzuur betreft. Voor hexadecaanzuur werd geen overlapping in het totale vetzuurbereik tussen S. alg en S. putrefaciens waargenomen; voor pentadecaanzuur en 17:1ω8c produceerde slechts één S. putrefaciens- of S. alg-isolaat een waarde die binnen het bereik van de ander viel. Hoewel geen enkele piek diagnostisch was, scheidde het gebruik van alle vier de pieken samen de 14Shewanella-stammen duidelijk in twee groepen langs soortlijnen.
- View inline
- View popup
Enzymatische eigenschappen van Shewanellaspecies zoals bepaald met de API-ZYM test
- View inline
- View popup
Scheiding van S. alg en S. putrefaciens door vetzuuranalyse
De 23 stammen van S. putrefaciens bleken op basis van verschillende fenotypische kenmerken in drie afzonderlijke groepen te kunnen worden verdeeld (tabel 5). Groep 1, die bestond uit acht stammen, waaronder ATCC 8073, produceerde zuur uit maltose, sucrose en arabinose en gebruikte urocaanzuur. De stammen van groep 1 waren gelijk verdeeld over klinische en niet-menselijke isolaten. Stammen van groep 2 (n = 6), waartoe ATCC 8071 behoorde, onderscheidden zich voornamelijk van stammen van groep 1 door het onvermogen om sucrose en maltose te oxideren. Ook hier was de helft van deze stammen afkomstig van klinisch materiaal. Groep 3-stammen (n = 9), alle van milieu-oorsprong (gebied rond het Michiganmeer), verschilden dramatisch van groep 1 en 2. Zij groeiden slecht of niet. Ze groeiden slecht of niet bij 35°C, produceerden chitinase, en waren niet gepigmenteerd op l-tryptofaan agar. Alle negen stammen van groep 3 produceerden aanvankelijk α-glucosidase, maar na een nieuwe test waren slechts drie stammen consequent positief. Maltose werd geoxideerd, maar sucrose of arabinose niet. In tegenstelling tot de groepen 1 en 2 werd urocaanzuur niet als energiebron gebruikt.
- View inline
- View popup
Biogroepen van S. putrefaciens
Nu hebben Vogel en collega’s (21) verschillen geconstateerd tussen S. alga en S. putrefaciens in hun gevoeligheid voor bepaalde antimicrobiële stoffen, waaronder penicilline, ampicilline, en tetracycline. Dit, in combinatie met het rapport dat hemolytische activiteit in verband brengt met S. alga en de klaarblijkelijke associatie ervan met ziekte bij de mens, suggereert mogelijke verschillen in pathogeniciteit tussen deze twee soorten (Tabel6). Daarom selecteerden wij 10 stammen (5 van elke soort) voor verdere analyse. Hoewel we geen grote verschillen in gevoeligheid voor penicilline, ampicilline en tetracycline tussen deze twee groepen waarnamen op basis van de vatbaarheidscategorie (vatbaar, intermediair of resistent), stelden we vast dat de gemiddelde MIC’s voor S. alg van penicilline, ampicilline en tetracycline (respectievelijk ∼200, 56 en 5.2 μg/ml, respectievelijk) groter waren dan de overeenkomstige MIC’s voor S. putrefaciens (respectievelijk 3, 1,3 en 1,1 μg/ml).
- View inline
- View popup
Virulentie-eigenschappen van Shewanella-soorten
Vier van de vijf S. putrefaciens-stammen hechtten zwak (+) tot sterk (+++) (tabel 6) aan HEp-2-cellen in hechtingstests; daarentegen vertoonde geen enkele S. alg-stam soortgelijke hechteigenschappen, hoewel vier stammen zich sterk hechtten aan de achtergrond van het glasplaatje. Invasieve activiteiten werden bij geen enkele Shewanella-stam waargenomen. Hoewel een vertraagde hemolytische reactie werd waargenomen op schapenbloedagar voor alle vijf S. alg-stammen (tabel 2), werd bèta-hemolyse niet gedetecteerd met de agar-overlaytechniek of bouillontests (tabel 6); controle-E. tarda-stammen waren in beide tests na 1 uur positief. Voor alle vijf S. alg-stammen (en één S. putrefaciens-isolaat) werd tijdens adhesie- en invasiestudies soms een zwakke cytotoxische reactie waargenomen. Deze cytotoxische reactie manifesteerde zich door het verschijnen van HEp-2-cellen met abnormale celmorfologie, waaronder celresten (ghosts). Er werden echter verschillen in pathogeniteit in muizen tussen deze twee soorten gevonden, aangezien de gemiddelde LD50 in Zwitserse Webster-muizen voor S. algawas 1,9 × 108 CFU bedroeg, terwijl die voor S. putrefaciens 8,4 × 108 CFU was (P < 0,02).