Cellijnen
De cellijnen en hun bronnen zijn als volgt: 293T (ATCC CRL-11268), 786-O (ATCC CRL-1932), en HK-2 (ATCC CRL-2190). THP-1 cellen werden vriendelijk ter beschikking gesteld door de Stem Cell Bank, Chinese Academy of Sciences. De cellen werden gekweekt in DMEM (voor 293T en 786-O), MEM (voor HK-2) of RPMI 1640 (THP-1) medium met 10% foetaal runderserum en 2 mM l-glutamine, bij 37 °C in de aanwezigheid van 5% CO2. Vóór infectie door bacteriën, behandeling door eiwitten of chemotaxis analyse, werd medium veranderd in serumvrij medium.
Bacteriestammen en plasmiden
De bacteriestammen en plasmiden gebruikt in deze studie worden vermeld in de aanvullende tabel S3. E. coli stammen werden gekweekt bij 37 ° C in Luria-Bertani (LB) medium onder statische omstandigheden gedurende 12 uur met passende antibiotica indien nodig, in de volgende concentraties: Kanamycine bij 50 μg/ml, ampicilline bij 100 μg/ml, en chlooramfenicol bij 15 μg/ml. De ΔhlyA-stam werd gegenereerd door substitutie van hlyA door een kat-gen met behulp van λ-Red recombinase. Voor het genereren van de ∆hlyA p-hlyA-stam werd het hlyA-gen door PCR uit het chromosoom van UPEC-stam CFT073 geamplificeerd en op de KpnI- en XbaI-enzymplaatsen in pTRC99A geligeerd, waarna het plasmide door elektroporatie in ∆hlyA werd getransformeerd. De hlyC- en hlyA-genen van CFT073 of het complementair DNA (cDNA) dat codeert voor Nectine-2 werden door PCR geamplificeerd en in pET-28a ( + ) gekloond om actieve FLAG- of HA-gemerkte HlyA- of Nectine-2 recombinante eiwitten te produceren. Om inactief FLAG-getagged HlyA (pro-HlyA) te produceren, werd het hlyA-gen zonder hlyC van CFT073 in pET-28a ( + ) gekloond op XbaI- en XhoI-enzymplaatsen. Myc-getagged Nectin-2 werd geïntegreerd in de pLenti-Hygro vector voor transfectie.
HlyA, pro-HlyA, en humaan Nectin-2 recombinante eiwitexpressie en zuivering
Expressie van recombinant HlyA of pro-HlyA werd uitgevoerd in E. coli BL21 (DE3), en expressie van Nectin-2 werd uitgevoerd in Rosetta (DE3). Vóór inductie met 100 μM IPTG werden bacteriën gekweekt bij 37 °C tot ze een OD600 van 0,6 tot 0,8 bereikten. Gekweekte bacteriën werden verzameld door centrifugatie (8000 × g gedurende 5 min bij 4 ° C) na 12 uur van inductie bij 16 ° C in LB met IPTG. De bacteriën werden gelyseerd met lysozym en ultrageluid en het supernatans werd gecentrifugeerd om deeltjes te verwijderen (18.000 × g gedurende 30 min bij 4 °C). De eiwitten werden vervolgens gezuiverd met het Ni-NTA Purification System (GenScript, Nanjing, China). De eiwitten werden geëlueerd met 250 mM imidazool. Fracties met de HlyA-fragmenten werden gepoold, gedialyseerd in 150 mM imidazool, 50 mM imidazool en tweemaal met PBS. Vervolgens werden de fracties die het gewenste eiwit bevatten geconcentreerd tot 500 pi met behulp van Amicon Ultra-15 centrifugale filtereenheden (Millipore, Burlington, MA, USA). De laatste dialysebuffer die een soortgelijke ionische omgeving als de gezuiverde HlyA eiwit werd gebruikt als de controle voor het gezuiverde eiwit in experimenten. De uiteindelijke eiwitconcentratie werd spectrofotometrisch bepaald (Nanodrop-2000, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) met behulp van de BCA Protein Assay Kit (23225, Thermo Scientific).
Muis pyelonefritis model
Alle dierstudies werden beoordeeld en goedgekeurd door de Animal Care and Use Committee aan de Tianjin Medical University, Tianjin, China. We hebben alles in het werk gesteld om het lijden van de dieren tot een minimum te beperken en het aantal gebruikte dieren te verminderen. Vrouwelijke C57BL/6J muizen, leeftijd 6-8 weken, werden gekocht van de Academie van Militaire Medische Wetenschappen (Beijing, China). De acute pyelonefritis muis model werd vastgesteld zoals eerder beschreven.53 De bacteriën werden gekweekt ’s nachts in statische LB-medium bij 37 ° C. Gekweekte bacteriën werden gepelletiseerd door centrifugatie (5000 × g gedurende 5 min bij 4 ° C) en geresuspendeerd in PBS tot een dichtheid van 2 × 1010 CFU / ml te verkrijgen. Met een interval van 3 uur werden verdoofde vrouwelijke C57BL / 6J muizen intraurethraal geïnoculeerd met 50 ul UPEC stammen (109 CFU) tweemaal.54,55 Op 12, 24 en 48 hpi, muizen werden opgeofferd, en hun nieren werden aseptisch verwijderd en gehomogeniseerd in 1 ml PBS met 0,025% Triton X-100, en vervolgens serieel verdund voor de telling van bacteriën. Op 24 hpi, werden de nierweefsels ook gebruikt voor flowcytometrie, histologie, en pro-inflammatoire cytokine analyse.
Flowcytometrie analyse
Enkelcelsuspensies werden gegenereerd door digestie met 1,5 mg/ml collagenase IV (C5138, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) en 100 ng/ml DNase I in PBS gedurende 30 min bij 37 ° C onder zachtjes schudden. De verteerde celsuspensies werden vervolgens gefiltreerd door een 70-µm celzeef (352350, BD Biosciences, San Jose, CA, USA) om suspensies van één cel te verkrijgen. Fc-receptoren werden geblokkeerd met CD16/32 (101319, Biolegend, San Diego, CA, USA) en de eencellige suspensies werden vervolgens geïncubeerd met de volgende antilichamen anti-CD11b geconjugeerd aan APC (17-0112-82, Thermo Fisher Scientific), anti-Ly6G geconjugeerd aan PE (127608, Biolegend), anti-F4/80 geconjugeerd aan FITC (11-4801-82, Thermo Fisher Scientific), anti-CD11c geconjugeerd aan PE (127608, Biolegend), anti-CD206 geconjugeerd aan PerCP/Cy5.5 (141716, Biolegend). De cellen werden geanalyseerd op een FACSCanto II Flow Cytometer (BD Biosciences) met behulp van de Flow Jo software (FlowJo, Ashland, OR, USA).
H&E kleuring en immunohistochemie
De nieren werden gedurende ten minste 24 uur gefixeerd in 10% fosfaatgebufferde formaline. Het gefixeerde weefsel werd vervolgens ingebed in paraffine en in coupes van 5 μm gesneden. De coupes werden gekleurd met hematoxyline en eosine. De histopathologische veranderingen in de nieren werden beoordeeld aan de hand van een 6-puntenschaal, waarbij 0, 1, 2 en 3 normaal, licht, matig en ernstig histologisch letsel aangaven (de pathologische schade bevond zich voornamelijk in de medulla en de corticale-medullaire junctie); 4, 5 en 6 wezen op licht, matig en ernstig histologisch letsel (de pathologische schade bevond zich voornamelijk in meer delen van de nier). Histologische onderzoeken werden geanalyseerd door twee personen die blind waren voor de experimentele groepen.56,57 Voor immunohistochemische analyse werden coupes gekleurd met anti-Nectin-2 antilichaam (27171-I-AP, 1:200, Proteintech, Chicago, IL, USA). Beelden werden verkregen onder een microscoop (BX46, Olympus, Tokyo, Japan).
Immunofluorescentie-analyse van weefsels en cellen
De nieren werden ingebed in OCT compound met vloeibare stikstof. Bevroren blokken werden gesneden in 5-µm secties, en aan de lucht gedroogd bij kamertemperatuur gedurende 1 uur, en gefixeerd met koude aceton gedurende 10 minuten. De bevroren secties werden vervolgens onmiddellijk ondergedompeld in methanol gedurende 20 min en vervolgens in methanol met 3% waterstofperoxide gedurende 10 min. De weefsels werden geblokkeerd met 5% boviene serumalbumine (BSA) gedurende 1 uur, geïncubeerd met anti-F4/80 antilichaam (ab6640, Abcam, 1:200), anti-Ly6G antilichaam (ab210402, Abcam, 1:200), Nectin-2 antilichaam, (ab135246, Abcam, 1:200) in blokkeerbuffer overnacht bij 4 ° C wanneer nodig. Glaasjes werden vervolgens vijf keer gewassen met PBS, en geïncubeerd met Alexa Fluor 488/549 gelabeld secundair antilichaam (Proteintech, 1:200) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Voor kernen visualisatie werden weefselsecties tegengekleurd met DAPI. Beelden werden verkregen onder een fluorescentiemicroscoop (IX73, Olympus). De 293T-cellen getransfecteerd met pLenti-Hygro-Myc-Nectin-2 werden gekweekt op een Lab-Tek dekglaasje met kamer en behandeld met 75 nM HlyA gedurende 6 uur, gefixeerd met 4% paraformaldehyde gedurende 15 min en onderworpen aan immunofluorescentiekleuring met anti-MYC-Tag antilichaam (66003-2-Ig, 1:25, Proteintech) en HA-Tag antilichaam (2367S, 1:200, CST) bij 4 ° C gedurende de nacht. Alexa Fluor 488/594-gelabeld tweede antilichaam (Proteintech) werden gebruikt door incubatie bij kamertemperatuur gedurende 1 h. Cellen werden afgebeeld met behulp van een confocale fluorescentiemicroscoop (FV1000-D, Olympus).
Infectie van nierepitheelcellen met UPEC stammen
Menselijke nierepitheelcellen (786-O of HK-2) werden gezaaid in 24-well platen, 24 uur voor UPEC infecties. Voor ADAM10 remming werden de cellen vooraf geïncubeerd met de ADAM10 remmer GI254023X (Sigma-Aldrich) gedurende 20 uur vóór de infecties. Cellen werden geïnfecteerd met bacteriën met de aangegeven multipliciteit van infectie (MOI) gedurende 6 uur of gestimuleerd met de aangegeven concentraties gezuiverd HlyA of pro-HlyA gedurende 12 uur. In sommige experimenten werden cellen behandeld met ∆hlyA (MOI 0.Voor de invasietest werden de cellen na 6 uur infectie vijf keer gewassen met PBS en behandeld met 200 μg/ml gentamicine gedurende 1 uur om extracellulaire bacteriën te doden. De cellen werden vervolgens twee keer gewassen met PBS en gelyseerd met 500 μl 0,2% triton X-100 in PBS en uitgezet op LB-agarplaten om de intracellulaire bacteriën te tellen.
Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)
GM-CSF niveaus in het supernatant van geïnfecteerde 786-O cellen, HlyA/pro-HlyA-behandelde 786-O cellen, of gehomogeniseerde nieren na infectie werden gemeten met behulp van een ELISA-ontwikkelingskit (Neobioscience Technology Company, Shenzhen, China) volgens de instructies van de fabrikant. De nieren van muizen werden verwijderd en gehomogeniseerd in PBS met 1% Triton X-100 en volledige mini-EDTA-vrije proteaseremmerscocktailtabletten (11697498001, Roche, Indianapolis, IN). De homogenaten werden vervolgens gedurende 30 min. op ijs geïncubeerd en gedurende 10 min. bij 10.000 × g bij 4 °C gecentrifugeerd; de supernatanten werden verzameld en gebruikt voor ELISA-tests van GM-CSF, IL-1β, TNF-α, IL-6 en MIP-2 volgens de instructies van de fabrikant (Neobioscience Technology Company, Shenzhen, China).
Cytotoxiciteitstests
Celcultuursupernatanten van 786-O-cellen behandeld met gezuiverde eiwitten of dialysebuffer gedurende 12 uur werden verzameld, en gedetecteerd voor lactaatdehydrogenase (LDH) met behulp van een CytoTox-96 Niet-radioactieve Cytotoxiciteit Assay Kit (G1780, Promega, Madison, WI, USA).
Urinemonsters van patiënten
Uinemonsters werden verzameld van met UPEC-stammen geïnfecteerde patiënten die een behandeling ondergingen in het Tweede Ziekenhuis van de Tianjin Medical University, en de aanwezigheid van hlyA-gen in de UPEC-stam geïsoleerd uit urine van individuele patiënten werd bepaald door PCR (Supplementary Tables S2 en S4). Urine werd geconcentreerd tot 200 pi met behulp van Amicon Ultra-15 centrifugale filterunits (UFC901024, Millipore), en vervolgens geconcentreerde vloeistof werd gedetecteerd door ELISA ontwikkelingskit (Neobioscience Technology Company). De studies in verband met patiëntenmonsters werden goedgekeurd door de ethische commissie van de Tianjin Medical University, en de schriftelijke geïnformeerde toestemming werd verkregen van alle patiënten.
RNA-extractie en qRT-PCR
786-O-cellen werden geïnfecteerd met CFT073, ∆hlyA of ∆hlyA p-hlyA (MOI 0,01) gedurende 4 uur. RNA werd geëxtraheerd met een Total RNA Extraction Kit (Solarbio, Beijing, China) volgens het protocol van de fabrikant en reverse getranscribeerd met de RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Fisher Scientific). qRT-PCR werd uitgevoerd met een FastStart Universal SYBR Green Master mix (Roche, Basel, Zwitserland) op een 7900 Fast Real-Time PCR System (Roche). De PCR fietscondities waren 95 ° C gedurende 5 min, gevolgd door 40 cycli van 95 ° C gedurende 20 s, 60 ° C gedurende 20 s, en 72 ° C gedurende 20 s. β-actine werd gebruikt als de endogene controle en de gegevens werden genormaliseerd op basis van het transcriptieniveau van β-actine in het wild-type en gekwantificeerd met behulp van de vergelijkende kritische drempel cyclus 2-∆∆Ct methode. De gebruikte primers worden vermeld in aanvullende tabel S4.
Chemotaxis assays
Celmigratie assays werden uitgevoerd met Transwell kamers (poriegrootte 5 urn, Costar, Corning 3421, Corning, NY, USA). THP-1-cellen (2 × 106 in 200 μl) werden geresuspendeerd in serumvrij RPMI 1640-medium en toegevoegd aan de bovenste kamer. Het supernatant van geïnfecteerde 786-O-cellen werd gemengd met 1 μg/ml neutraliserend antilichaam tegen menselijk GM-CSF (502203, BVD2-23B6, Biolegend) of controle IgG2a (400515, Rat IgG2a, Biolegend) en geïncubeerd gedurende 30 min. Vervolgens werd 600 ul medium met het supernatant toegevoegd aan de onderste kamer als de chemo-attractant. Na 3 uur of 6 uur incubatie bij 37 ° C in een 5% CO2 bevochtigde atmosfeer, werden de gemigreerde cellen in de onderste kamer geteld.
Clodronaat liposomen en anti-GM-CSF antilichaam behandeling
Om macrofagen te elimineren, werden 200 µl PBS of clodronaat liposomen toegediend aan muizen intraveneus 24 uur voor infectie.32,33 Om GM-CSF te neutraliseren, werden neutraliserende antilichamen tegen GM-CSF (505408, MP1-22E9, Biolegend, 250 µg) of controle-IgG2a (400533, Rat IgG2a, Biolegend, 250 µg) intraveneus bij muizen geïnjecteerd 1 uur vóór infectie.33,58
Antilichamen en western blotting
Antilichamen werden verkregen van de volgende bedrijven: monoklonaal anti-FLAG-antilichaam (F1804, Sigma-Aldrich), anti-MYC-Tag antilichaam (66004-I-I-Ig, Proteintech, Chicago, IL, USA), en anti-Nectine-2 antilichaam (ab135246, Abcam, Cambridge, UK). Hele cellysaten werden bereid met RIPA-lysebuffer (Millipore), met volledige proteaseremmers (Roche, Basel, Zwitserland). De BCA Protein Assay Kit (Thermo Fisher) werd gebruikt om de eiwitconcentratie te bepalen. De HRP-geconjugeerde anti-rabbit IgG (1:10000, Sigma-Aldrich) of anti-muis IgG (1:10000, Sigma-Aldrich) werden gebruikt om de antilichaambinding aan te tonen. Immunoreactieve complexen werden gedetecteerd met behulp van Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate (Millipore) en belicht met een GE Amersham Imager 600 machine.
Verre-westerse blotting en LC-MS/MS analyse
Het protocol voor ver-westerse blotting werd uitgevoerd zoals eerder beschreven.59 786-O cellen werden tweemaal gewassen met ijskoud PBS, en de celmembraan eiwitten werden geïsoleerd met behulp van een Membraan en Cytosol Eiwit Extractie Kit (Beyotime Biotechnology, Shanghai, China) volgens het protocol van de fabrikant. Oplosbare membraan-geassocieerde eiwitten werden geanalyseerd met natriumdodecylsulfaat-polyacrylamide gelelektroforese op 10% gels. De eiwitten werden vervolgens overgebracht op polyvinylideenfluoride (PVDF) membraan (Merck Millipore, Darmstadt, Duitsland). De overgebrachte eiwitten werden gerenatureerd met behulp van AC-buffer door geleidelijke vermindering van de guanidine-HCl concentratie.59 Vervolgens werd het membraan geblokkeerd met 5% magere melk in de TBST buffer gedurende 1 uur. Daarna werd het membraan geïncubeerd met 30 ug / ml gezuiverd FLAG-getagd HlyA of dialysebuffer overnacht bij 4 ° C. Na het wassen werd het membraan geïncubeerd met 1:1000 verdund anti-FLAG-antilichaam (Sigma-Aldrich) gedurende een nacht bij 4 °C in 5% magere melk in de TBST-buffer. Vervolgens werd het membraan grondig gewassen en geïncubeerd met HRP-geconjugeerd anti-muis IgG (1:1):10000, Sigma-Aldrich)
De differentiële banden tussen de dialysebuffergroep en de met FLAG gemerkte HlyA-groep werden geïdentificeerd met behulp van LC-MS/MS, uitgevoerd met een nanoLC-LTQ-Orbitrap XL massaspectrometer (Thermo, San Jose, CA, USA) gekoppeld aan een Eksigent nano LC 1D plus HPLC-systeem in Majorbio (Shanghai, China). Tryptische peptiden werden volledig enzymatisch verteerd en geïoniseerd met behulp van nano electrospray ionisatie.33 Gegevens werden geanalyseerd met behulp van een full-scan massaspectrum (300 tot 1800 m / z). Ten slotte werd Proteome Discoverer (versie 1.4.0.288, Thermo Scientific) gebruikt om de MS-gegevens te analyseren.
RNA-interferentie en Nectin-2 overexpressie
Small-interfering RNA’s (siRNA’s) voor de gerichte genen en een gescrambelde controle siRNA (siScr) werden gesynthetiseerd door GenePharma (Shanghai, China). De siRNA’s werden getransfecteerd in 786-O of HK-2 cellen met behulp van Lipofectamine 3000 (Invitrogen). pLenti-Hygro-Myc-Nectin-2 werd getransfecteerd in 786-O of HK-2 cellen met behulp van Lipofectamine 3000 (Invitrogen) tot overexpressie van Nectin-2. Achtenveertig uur na de transfectie werden de cellen geanalyseerd op eiwitexpressie met behulp van western blotting. De sequenties van de siRNA’s zijn vermeld in de supplementaire tabel S4.
Immunoprecipitatie
293T cellen werden getransfecteerd met de pLenti-Hygro vector of pLenti-Hygro-Myc-Nectin-2, en vervolgens gekweekt gedurende 48 uur. De cellen werden vervolgens geïncubeerd met FLAG-getagged HlyA (75 nM) gedurende 6 uur na de transfectie en werden vers gelyseerd in lysisbuffer (50 mM Tris-HCl (pH 7,4), 1% NP-40, 0,2 mM EDTA, 150 mM NaCl) voor western blotting of immunoprecipitatie (IP) assays. 786-O cellen werden geïncubeerd met FLAG-getagged HlyA (75 nM) of dialysebuffer gedurende 6 uur en vervolgens gelyseerd met lysisbuffer voor eiwit IP assay. Het celsupernatants werd geïncubeerd met anti-FLAG M2 beads (A2220, Sigma-Aldrich) of anti-Myc M2 beads (A7470, Sigma-Aldrich) gedurende 12 uur bij 4 °C voor FLAG-getagd of Myc-getagd eiwit IP. Voor Nectin-2-eiwit-IP werden de celsupernatanten geïncubeerd met anti-Nectin-2-antilichaam (ab135246, Abcam) gedurende 12 uur bij 4 °C en vervolgens geïncubeerd met Eiwit A/G-agarose (20241, Thermo Fisher) gedurende 2 uur bij 4 °C. Normaal konijn IgG (2729S, CST) werd gebruikt als controle. Na incubatie werden de precipitaten verzameld door middel van centrifugatie, vijfmaal gewassen met de lysis-buffer, en geanalyseerd door immunoblotting met monoklonaal anti-FLAG-antilichaam, anti-MYC-Tag-antilichaam, of anti-Nectin-2-antilichaam.
Bacterieel tot expressie gebracht, gezuiverd recombinant FLAG-getagd HlyA (1 µg) werd geïncubeerd met 1 μg bacterieel tot expressie gebracht, gezuiverd recombinant Nectin-2 in bindingsbuffer (20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 0,1% Triton-X 100, 100 mM NaCl, 20% glycerine, 1% BSA) gedurende 12 uur. De complexen werden vervolgens onderworpen aan FLAG-getagd eiwit IP of Nectin-2 eiwit IP. Tenslotte werden de gecomplexeerde eiwitten geanalyseerd met behulp van immunoblotting.
Statistische analyse
De statistische significantie van de verschillen tussen de groepen werd getest met behulp van analyse van variantie (ANOVA) analyse. De niet-parametrische Mann-Whitney test werd gebruikt om de statistische significantie in de in vivo experimenten te berekenen.