Nekrotrofisk livsstil hos Rhizoctonia solani AG3-PT under interaktion med værtsplanten kartoffel, som afsløret ved transkriptomanalyse

Transkriptomanalyse

Den interspecifikke interaktion mellem R. solani AG3-PT isolat Ben3 med den medium resistente kartoffelsort ‘Arkula’ blev analyseret på transkriptomniveau ved hjælp af RNA-sekventering. For at finde faktorer, der er vigtige for etableringen af interaktionen og den videre interaktionsprogression, anvendte vi tre forskellige prøvetagninger: rent mycelium af R. solani AG3-PT isolat Ben3 dyrket uden at blive tiltrukket af en voksende kartoffelplante (Ben3); kartoffelspirer ved 3 dpi af knolde med R. solani (tidligt) og 8 dpi (sent). På begge prøvetagningsdatoer for R. solani i interaktion med kartoffelspirerne blev alle spirer, der var ved at komme frem, høstet og anvendt i analysen. Nekrotiske læsioner på spirer blev først synlige ved 8 dpi. Derefter blev der foretaget RNA-ekstraktion, RNA-sekventering (RNAseq) og kortlægning af læsningerne til isolat Ben334’s genom for at beregne værdierne for læsninger pr. kilobase pr. million kortlagte læsninger (RPKM). Generelt blev mellem 1 og 23 % af hvert datasæt for de inokulerede prøver kortlagt på Ben3-genomudkastet. For kontrolprøverne kunne mellem 70 og 75 % af disse datasæt kortlægges på Ben3-genomet.

I alle tre prøveudtagninger kunne et sammenligneligt antal gener påvises som værende udtrykt (tabel 1). I rent mycelium blev 11 206 gener ud af de identificerede 12 567 gener på R. solani AG3-PT isolat Ben3-genomet udtrykt, mens læsninger kunne kortlægges på 10 181 og 9 9 939 gener ved henholdsvis 3 dpi og 8 dpi. Sammenfattende blev 11 287 gener ud af de identificerede 12 567 gener på R. solani AG3-PT isolat Ben3-genomet i alle transkriptomer i dette forsøg udtrykt i nogen af de analyserede prøver.

Som det fremgår af tabel 1, varierede mængderne af de samlede kortlagte reads betydeligt. Dette skyldes, at i Ben3-prøvetagningen er transkriptomet af det rene mycelium af R. solani AG3-PT isolat Ben3 blevet sekventeret, mens der i de tidlige og sene prøvetagninger (3 og 8 dpi) er anvendt en dobbelt RNAseq-tilgang for at få adgang til transkriptomerne af begge interagerende organismer samtidig30. Da biblioteksstørrelserne og mængden af sekvenser, der blev produceret fra hvert bibliotek, var sammenlignelige, kunne næsten alle læsninger i Ben3-prøvetagningen kortlægges til isolat Ben3-genomet. I de dobbelte RNAseq-tilgange i prøveudtagningerne ved 3 og 8 dpi kunne kun en brøkdel af de producerede reads kortlægges til Ben3-genomet, mens de øvrige primært kortlagdes til kartoffelgenomet. På grund af disse forskellige mængder af samlede kortlagte læsninger til R. solani AG3-PT isolat Ben3-genomet pr. prøveudtagning skal følgende tages i betragtning: (1) gener med lav RPKM-værdi kun i Ben3 er ikke nødvendigvis ikke udtrykt, når svampen udfordrer planten, det kan blot skyldes bibliotekets størrelse; (2) gener, der er fundet udtrykt i alle tre prøveudtagninger, kan tildeles som værende almindeligt udtrykte; (3) gener, der kun er fundet udtrykt i de meget mindre biblioteker i 3 og 8 dpi-prøveudtagningerne, kan antages at være interaktionsspecifikke.

De sammenfattede kortlægningsresultater (tabel 1) viste allerede, at der må være mange gener, der er almindeligt udtrykt i alle tre prøveudtagninger. Derfor blev der konstrueret et Venn-diagram for at sammenligne de tre prøveudtagninger og visualisere det beregnede antal gener, de har til fælles, i forhold til det antal gener, der adskiller de enkelte prøveudtagninger fra hinanden (fig. 1). Mere end 9.000 gener blev fundet udtrykt i alle tre prøveudtagninger, mens 871 gener udelukkende blev transskriberet i mycelium uden plantekontakt. Ekspressionen af 29 gener blev fundet fælles i 3 og 8 dpi-prøverne og repræsenterede gener, der kun udtrykkes i nærvær af den levende kartoffelplante. Desuden blev 27 gener udelukkende udtrykt ved 3 dpi, og sekvenslæsninger, der kortlægger et lille sæt på 21 gener, kunne udelukkende påvises ved 8 dpi. Lister over disse gener sammen med deres respektive RPKM-værdier og beskrivelser findes i de supplerende tabeller 1 – 4.

Af de 29 gener, der blev almindeligt udtrykt i tilstedeværelse af den levende kartoffelplante, er fire gener, der koder for proteiner, der er involveret i nedbrydning af plantecellevæggen. Dette passer til virulensstrategien for et nekrotrofisk patogen med sekretion af cellevægsnedbrydende enzymer for at fremkalde værtscellenekrose og udsivning af næringsstoffer21. Desuden er der et gen, der koder for et protein, der er involveret i proteinnedbrydning, som yderligere understøtter denne angrebsstrategi. Desuden er to gener, der koder for proteiner med DNA-bindende domæner og formodet funktion i transkriptionel regulering, også på denne liste og spiller sandsynligvis en rolle i den transkriptionelle regulering af angrebet (f.eks. Ben3g4553, se tabel 2). De fleste af de 27 gener, der udelukkende udtrykkes ved 3 dpi, koder for hypotetiske proteiner, hvor der ikke kan tildeles nogen formodet funktion. Af de 21 gener, der udelukkende blev udtrykt i de senere faser af interaktionen (8 dpi), er otte gener, der koder for proteiner, der er involveret i nedbrydning af plantecellevæggen, og to gener, der koder for proteaser. Dette viser igen den typiske strategi for et nekrotrofisk patogen.

Sammenfattende viste en første undersøgelse af transkriptomdata fra de tre prøveudtagninger tydelige og rimelige forskelle, hvilket viser potentialet i denne undersøgelse til at finde faktorer, der er vigtige for etableringen af interaktionen mellem R. solani AG3-PT isolat Ben 3 med en modtagelig kartoffelsort og yderligere interaktionsprogression.

De mest abundante R. solani AG3-PT transkriptioner i de tre prøveudtagninger

Den interspecifikke interaktion mellem R. solani AG3-PT isolat Ben 3 med den middelresistente kartoffelsort ‘Arkula’ blev indledningsvis evalueret ved at undersøge de mest abundante transkriptioner i de tre forskellige prøveudtagninger. I voksende mycelium dyrket i flydende kultur blev der fundet transkriptioner af 11 206 gener fra isolat Ben3-genomet. I alt blev der påvist 698 transkript af disse gener med RPKM-værdier på 100 og derover, 37 med RPKM-værdier på over 1 000 i median. I den tidlige interaktionsfase (3 dpi) af knoldspirer med patogenet blev der påvist transkriptioner af 10 181 gener, hvoraf 729 viste median RPKM-værdier på 100 og derover, 25 median RPKM-værdier på over 1 000. Der blev transskriberet 9 939 gener af R. solani AG3-PT, hvoraf 742 viste median RPKM-værdier på 100 og derover, 26 median RPKM-værdier større end 1 000 ved 8 dpi (Supplerende tabeller 5-7). I alt blev 9.679 gener fra isolat Ben3-genomet fundet udtrykt i alle tre prøvetagninger, blandt dem er de mest hyppige transskriptioner i hver af de individuelle prøvetagninger, der blev analyseret. Fem af disse højest udtrykte gener (Ben3g9573, Ben3g6448, Ben3g5323, Ben3g2326 og Ben3g675) koder for R. solani-specifikke hypotetiske proteiner med ukendte funktioner. Disse proteiner forventes derfor ikke at spille specifikke roller under interaktionen med planten, men kan snarere være vigtige for den generelle vækst og det cellulære stofskifte. Blandt de hyppigst forekommende transkripter i hver af de enkelte prøveudtagninger er også flere proteiner, der indeholder lektindomæner (Ben3g9146, Ben3g9350 og Ben3g8869). En række sådanne proteiner, der indeholder et ricin-type beta-trefoil lektin-domæne, er også tidligere blevet rapporteret som de mest hyppigt forekommende i R. solani AG1-IB-isolat 7/3/14 under interaktion med værtsplanten salat30. Selv om de specifikke roller for disse lektindomæneproteiner ikke er fastlagt, er det blevet foreslået, at R. solani-lektiner kan have en funktion som lagringsprotein i mycelium37. Derudover var to gener, der kodede for proteiner med thuringiensis-toksindomæne (Ben3g8806 og Ben3g11931), også stærkt transskriberet i alle tre analyserede prøver. Bacillus thuringiensis-toksiner er bakterieproteiner, der er kendt for deres biocidholdige aktivitet mod insekter38 , men en række andre organismer er også mål for dem39. Den stærke ekspression af sådanne toksindomænehomologer i R. solani tyder på, at disse toksiner kan være af generel betydning for R. solani AG3-PT isolat Ben3 snarere end at spille en specifik rolle i interaktionen mellem svampe og planter. Et gen, der koder for et septal pore cap-protein (Ben3g7115), var også blandt de hyppigst forekommende transskriptioner i alle tre prøveudtagninger, hvilket tyder på, at det bidrager til hyphal homeostase i basidiomycetersvampe40. Et transkript, der ligner septal pore cap-proteinet (RSOLAG1IB_6054), var også meget hyppigt forekommende i R. solani AG1-IB isolat 7/3/14 transkript fundet i den symptomløse zone af interaktion med salat30. Dette protein, der er specifikt for R. solani, er en del af det tilstopningsmateriale, der lukker perforeringerne i hyfecellers septalporer og forhindrer transport af cytoplasmavæske mellem naboceller. Desuden var et gen, der koder for et hæmopexin-domæneprotein (Ben3g6614), også blandt de højest udtrykte gener, som var fælles for alle tre prøveudtagninger. Dette domæne betegner zinkafhængige metalloproteinaser, som er almindeligt anerkendt for at spille en vigtig rolle i den homeostatiske regulering af det ekstracellulære miljø41 , men deres biologiske funktioner kan også strække sig ud over nedbrydning af den ekstracellulære matrix42. Da alle disse proteiner viste høj abundans i R. solani AG3-PT med og uden kontakt til værtsplanten, kan de være vigtige for den generelle vækst og metabolisme, men synes ikke at have en specifik relevans i svampens interaktion med planten.

Interaktionen mellem R. solani AG3-PT og kartoffel

For at finde elementer med relevans for understøttelse af interaktion mellem R. solani AG3-PT isolat Ben3 og kartoffelspiren blev der udført differentiel genekspression som integreret i ReadXplorer-platformen (v2.2)43. Denne parvise sammenligning af transkriptomer af rent mycelium af isolat Ben3 med transkriptomer fra enten 3 dpi eller 8 dpi af interaktion med kartoffelspirer blev udført ved hjælp af DESeq2-programmet. Gener blev tildelt som differentielt udtrykte gener med en justeret P-værdi på mindre end 0,05 og en mindste foldændring på |2| eller mere. Ved hjælp af disse kriterier kunne 592 gener tildeles som differentielt inducerede ved 3 dpi (summen af 242 gener udelukkende tidligt inducerede og 350 gener inducerede ved 3 dpi og også ved 8 dpi; tidligt op), mens 520 gener er differentielt reducerede ved 3 dpi (summen af 412 gener udelukkende tidligt reducerede og 108 gener reducerede ved 3 dpi og også ved 8 dpi; tidligt ned). Ved 8 dpi blev 688 transkriptioner fundet differentielt induceret (summen af 338 gener udelukkende sent induceret og 350 gener induceret ved 8 dpi og også ved 3 dpi; sent op), og 233 er differentielt reduceret (summen af 125 gener udelukkende sent reduceret og 108 gener reduceret ved 8 dpi og også ved 3 dpi; sent ned). Venn-diagrammer blev konstrueret for at sammenligne og visualisere de differentielt opregulerede såvel som nedregulerede gener på begge tidspunkter under interaktionen (fig. 2). Lister over disse gener sammen med deres respektive værdier for foldændring findes i de supplerende tabeller 8-9.

Ekspressionsforskelle fundet med denne DESeq2-analyse blev valideret i eksperimenter ved hjælp af qRT-PCR. Der skal derfor etableres et passende kontrolgen med invariant ekspressionsmønster. Glyceraldehyd-3-fosfatdehydrogenase (Ben3g7151, GAPDH), ubiquitin-konjugerende enzym E2 (EUC63156, UBC), ubiquitin-proteinligase E3 (Ben3g494, UBI), elongationsfaktor 2 (Ben3g3364, EF-2) og beta-tubulin-gener (Ben3g4099; TUB1) og (Ben3g5288, TUB2) blev testet, og beta-tubulin-genet Ben3g5288 (TUB2) viste sig at være den mest hensigtsmæssige reference i vores eksperimenter. Relative transkriptniveauer af tre kandidatgener med forskellige ekspressionsmønstre blev normaliseret på grundlag af ekspressionen af denne invariante kontrol. ΔΔCq-værdier blev beregnet og sammenlignet med den respektive DESeq2-analyse (tabel 2).

For alle tre kandidatgener med meget forskellige ekspressionsmønstre var de beregnede ΔΔCq-værdier i overensstemmelse med de respektive log2fold-ændringsværdier beregnet i DESeq2-analysen, hvilket viser validering af ekspressionsforskelle.

Der blev desuden udført gene ontology (GO)-annotationer for at tildele de respektive funktioner til de pågældende gener. I den videre analyse blev der lagt særlig vægt på signifikant inducerede gener for fortrinsvis at fange molekylære kandidater, der kan være vigtige for initiering og etablering af interaktion med planten.

Differentielt udtrykte gener (DEG’er) i isolat Ben3 ved 3 dpi af kartoffelspirer

Differentielt inducerede gener i isolat Ben3 i interaktion med kartoffelspirer ved 3 dpi sammenlignet med isolatets rene mycelium blev udvalgt, idet de antog funktioner i forbindelse med igangsætning og understøttelse af interaktionsprocessen med kartoffelspirerne. De pågældende genprodukters formodede funktioner og deres fordeling på de fælles GO-aspekter for biologisk proces (BP), molekylær funktion (MF) og cellekomponent (CC) er angivet i figur 3.

Den differentielt inducerede gener er ved 3 dpi hovedsageligt tildelt som værende involveret i kulhydrat- og cellulære kvælstofforbindelsers metaboliske processer og i transport. Næsten 10 % (50 gener) af de differentielt opregulerede gener koder for forskellige peptidaseaktiviteter (f.eks. Ben3g2070, se tabel 2), mens 53 gener koder for enzymer, der nedbryder cellevæggen, herunder flere forskellige hydrolaser, der virker på glykosylbindinger, og pektatlyaser (f.eks. Ben3g3530, se tabel 2) eller xylanaser. For yderligere at specificere disse cellevægsnedbrydende enzymer blev alle DEG’er også annoteret i henhold til databasen Carbohydrate Active enZyme (CAZy) (Supplerende tabel 11). Udskillelse af et stort arsenal af hydrolytiske enzymer såsom proteaser og cellevægsnedbrydende enzymer under interaktionen44,45 er nødvendig for nekrotrofe svampesvampe som R. solani for at fremkalde cellenekrose ved nedbrydning af strukturelle protein- og kulhydratkomponenter i planternes cellevægge og for at forårsage udsivning af næringsstoffer9,30,46,47. Det er således en hypotese, at de inducerede cellevægsnedbrydende enzymer og flere af de inducerede peptidaser fungerer ved at støtte interaktionen mellem R. solani AG3-PT og kartoffelspirernes væv. Sekreterede peptidaser er imidlertid også blevet undersøgt indgående for deres rolle som effektorer af gramnegative bakterier48 og også svampe47,49. Patogene effektorer leveres normalt som virulensfaktorer til værtscellerne for at undertrykke de basale forsvarsreaktioner og skabe et passende miljø for patogenets udbredelse50,51,52. Posttranslationel modifikation af værtsproteiner gennem proteolytisk behandling er således en meget anvendt mekanisme til regulering af planternes forsvarsrespons. Med den nuværende viden kan det formodes, at en eller flere af disse inducerede proteaser har en formodet rolle som effektorer, der understøtter interaktionen mellem R. solani AG3-PT og kartoffelværten. Der er imidlertid behov for yderligere funktionelle analyser af de enkelte proteaser for klart at tildele dem en funktionel rolle i interaktionen mellem patogen og vært.

En anden stor gruppe bestående af 100 medlemmer af differentielt opregulerede gener i interaktionen ved 3 dpi er beskrevet som kodning for hypotetiske proteiner. De fleste af disse gener er R. solani-specifikke, og homologer kunne findes i de andre fem annoterede genomer af R. solani AG3 Rhs1AP, R. solani AG2-2IIIB, R. solani AG8, og R. solani AG1-IA og AG1-IB. Ud fra vores differentielle genekspressionsanalyse forventes det, at nogle af disse gener er involveret i den understøttende interaktion mellem R. solani AG3-PT og kartoffelspirerne. Det er allerede kendt, at sekreterede effektorer fra svampepatogener er målrettet mod værtsimmunitet ved hjælp af forskellige strategier, f.eks. ved at hydrolyserer en salicylsyreprækursor53 eller ved at binde sig til transkriptionsfaktorer og dermed hæmme deres aktivitet54. Der er behov for yderligere analyser for at afsløre putative funktioner af de hidtil hypotetiske proteiner for deres forskellige mulige roller i interaktionen mellem R. solani AG3-PT og kartoffel.

Interessant nok er det stærkest differentielt øgede gen (Ben3g6247) homologe med lipid-translokaliserende eksportør (LTE)-familieproteiner, som RTA1 fra Saccharomyces. RTA1-proteinet indeholder syv potentielle membranoverskridende segmenter55 og forudsiges at være et integralt membranprotein med funktion i cellens modstandsdygtighed over for xenobiotika56. Andre LTE-familiegener kan kodere for transportører eller sensorer, der enten direkte eller indirekte letter udskillelsen af biosyntetiske mellemprodukter56. Disse formodede funktioner for LTE-familiens proteiner gør genet Ben3g6247 til en favoritkandidat, der er involveret i sekretion af komponenter, der er vigtige for patogenangrebet.

Den tidlige fase af nekrotrofisk interaktion er forbundet med celledød i planteværten og produktion af forskellige sekundære metabolitter og akkumulering af reaktive oxygenarter21. Det er blevet vist, at antioxidantprocesser og den respektive genekspression var korreleret med nekrotiske væv i flere R. solani patosystemer (kartoffelspirer – R. solani AG3; sojabønne hypokotyl – R. solani AG4 og sojabønneblade – R. solani AG1-IA)27. I den tidlige fase af interaktionen mellem kartoffelværten og isolat Ben3 (3 dpi) kunne der ikke observeres stærke tegn på induktion af antioxidantprocesser i patogenhyferne på transkriptionelt niveau, fordi der ikke var nogen stærk stigning i glutathion S-transferase-genekspression eller opregulering af andre gener, der er kendt for at være involveret i opfangning af reaktive oxygenarter. Derfor kan det postuleres, at i vores system til kolonisering af kartoffelspirerne med R. solani AG3-PT ligner vævsanalysen ved 3 dpi et tidligt stadium af plantepatogeninteraktionen, måske forud for infektion af spirevævet. Der blev ikke observeret synlige symptomer på dette tidspunkt.

Differentielt udtrykte gener i isolat Ben3 ved 8 dpi af kartoffelspirer

For at finde transkript, der er vigtige i et fremskredent stadium af interaktionen, blev differentielt inducerede gener mellem rent mycelium af isolat Ben3 og Ben3 tiltrukket af kartoffelspirer ved 8 dpi screenet. De respektive funktionelle annotationer af genprodukterne og deres fordeling på de fælles GO-elementer er vist i fig. 4. Ved 8 dpi er de differentielt inducerede gener hovedsageligt tildelt som værende involveret i kulhydrat- og makromolekylære metaboliske processer og i transport. På dette senere tidspunkt af interaktionen er de opregulerede 152 gener (> 22 %) kodet for forskellige cellevægsnedbrydende enzymer (f.eks. Ben3g3530, se tabel 2). Desuden blev alle DEG’erne også annoteret i henhold til databasen Carbohydrate Active enZyme (CAZy) (Supplerende tabel 11). Denne øgede ekspression af gener, der koder for hydrolytiske enzymer i cellevæggen, viser fint den stigende patogene aktivitet af isolat Ben3 samt betydningen af nedbrydning af cellevægkomponenter for at få adgang til næringsstoffer under interaktionen, hvilket bekræfter den beskrevne virulensstrategi for et nekrotrofisk patogen21,57. Denne destruktive taktik blev ledsaget af en induktion af ekspression af gener, der koder for integrale komponenter i membraner. Disse 154 for det meste ukarakteriserede integrale membranproteiner og formodede transportører var formodentlig involveret i optagelsen af næringsstoffer og nedbrydningsprodukter fra hydrolaseaktiviteterne. På dette stadium af interaktionen syntes den dominerende betydning af gener, der kodede for peptidaser, at være aftagende, men 33 gener, der kodede for peptidaser, var stadig differentielt opregulerede (f.eks. Ben3g2070, se tabel 2). Dette kan også forklares ved, at hele spirer blev høstet, herunder spirer med op til 8 dages interaktion med det udfordrende patogen og de efterfølgende spirer med en kortere interaktionsperiode. Generelt er dette også repræsenteret i de 350 gener, der i fællesskab var differentielt forøgede ved 3 og 8 dpi (fig. 2).

Dertil kommer, at en anden stor gruppe af DEG’er ved 8 dpi består af 98 gener med ukendt funktion. Da disse gener er Rhizoctonia-specifikke uden nogen områder med lighed med sekvenser med tildelte funktioner, kan man kun spekulere i deres rolle i forbindelse med understøttelse af interaktionen mellem patogen og plante. Yderligere funktionelle sammenligninger af disse gener og f.eks. deres differentielle ekspression i de respektive patosystemer kan give et fingerpeg om deres formodede funktion.

I det her beskrevne eksperimentelle system til kolonisering af kartoffelspirer med R. solani AG3-PT isolat Ben3 bliver læsioner først synlige ved 8 dpi. Det er blevet vist i andre forsøg25,27 , at nekrotrofisk interaktion og celledød i planteværten var korreleret med respektive genekspression i planten og i svampen. Samsatly og medarbejdere27 påviste ved hjælp af kvantitativ RT-PCR, at ekspressionen af antioxidantgener, der kodede for glutathion S-transferase og katalase, var signifikant forøget i R. solani AG3 fem dage efter inokulation af løsrevne kartoffelspirer. Men en sådan stærkt øget ekspression af disse antioxidantgener kunne ikke konstateres i de her beskrevne forsøg. Årsagerne til disse forskelle kan skyldes inokulation med isolater af R. solani AG3, der udviser forskelle i patogenicitet. En anden forskel er imidlertid, at Samsatly og medarbejdere27 udførte forsøg med løsrevne spirer i et begrænset in vitro-system, mens vores forsøgsopstilling fuldt ud afspejler forholdene i in vivo-miljøet med spirer i vækst på dyrkede frøknolde. Yderligere undersøgelser sammen med den samtidige transkriptomanalyse i kartoffelværten vil endelig øge forståelsen af et gensidigt forhold i interaktionen mellem værtspatogener i et miljø, der ligner den naturlige situation.

Differentielt udtrykte gener i isolat Ben3 ved sammenligning af 3 og 8 dpi af kartoffelspirer

For at differentiere mellem R. solani AG3-PT-transskriptioner, der primært var relevante på et tidligt tidspunkt, og dem, der blev vigtigere på avancerede stadier af interaktionen, blev differentielt udtrykte gener mellem 3 og 8 dpi af interaktionen også analyseret med DESeq2. Ved hjælp af ovennævnte kriterier med justerede P-værdier på mindre end 0,05 og en mindste foldændring på |2| eller mere kunne 173 gener tildeles som differentielt reduceret udtrykt mellem 3 og 8 dpi, mens 400 gener er differentielt øget udtrykt på det senere tidspunkt. Komplette lister over disse gener sammen med deres respektive baseMean-værdier og værdier for foldændring findes i den supplerende tabel 10, og lister over de 20 mest differentielt udtrykte gener mellem 3 og 8 dpi findes i tabel 3 og 4. Mens 10 ud af de 20 mest differentielt reduceret udtrykte gener mellem 3 og 8 dpi koder for proteiner, der er involveret i proteinnedbrydning og kvælstofoptagelse og -assimilation (tabel 3), er størstedelen af de gener, der er differentielt øget udtrykt mellem 3 og 8 dpi, involveret i polysaccharidnedbrydning med fokus på kobberafhængige lytiske polysaccharidmonooxygenaser til spaltning af cellulosekæder med oxidation af forskellige kulstofatomer (tabel 4).

Det er kendt, at kvælstofmetabolisme og kvælstofreguleret genekspression i plantepatogene svampe er af stor betydning for etableringen af sygdommen i værtsplanten58. Nitrat er imidlertid den mindre foretrukne kvælstofkilde sammenlignet med ammonium og L-glutamin med hensyn til næringsstofudnyttelse i svampe, i hvert fald under infektion af blade59. I svampe reguleres denne foretrukne næringsstofudnyttelse via kvælstofmetabolitrepression og sikrer transkriptionen af ammonium- og urinstof-aktive permease-kodende gener. Ud over den stærke forbigående ekspression af gener, der koder for ammonium- og kvælstofforbindelser transporterende permeaser (Ben3g6147, Ben3g6767, Ben3g4369 og Ben3g7775) i det tidlige interaktionsstadium ved 3 dpi, udøvede R. solani AG3-PT isolat Ben3 også en høj induktion og ekspression af gener, der var involveret i nitratoptagelse og -assimilation (Ben3g6360, Ben3g6359 og Ben3g6361). Om dette er et karakteristisk træk ved isolat Ben3 eller en egenskab ved jordbårne plantepatogene svampe kræver yderligere undersøgelser.

De fleste gener med differentielt øget ekspression mellem 3 og 8 dpi er involveret i nedbrydning af cellevæggen og koder for hydrolaser, der virker på glykosylbindinger, og pektatlyaser. Dette var forventet og viser igen den stigende betydning af nedbrydning af cellevægskomponenter, der er bestemmende for virulensstrategien hos et nekrotrofisk patogen21.