Mikronukleus
MN stammer fra kromosomfragmenter eller hele kromosomer, der halter efter anafase under kernedelingen og ikke indgår i hovedkernerne.13,18,19 MN er små ekstranukleære legemer, der opstår i celler, der deler sig, fra acentriske kromosom-/kromatidfragmenter eller hele kromosomer/kromosomer, der halter bagefter i anafase og ikke er inkluderet i datterkerner i telofase.20 I telofase dannes en kernehinde omkring de forsinkede kromosomer og fragmenter, som derefter afvikles og gradvist antager morfologi som en interfasekerne, bortset fra at de er mindre end de vigtigste kerner i cellen (deraf udtrykket “mikronukleus”).19 MN med kromosomfragmenter kan skyldes direkte dobbeltstrengs-dna-brud, omdannelse af enkeltstrengsbrud til dobbeltstrengsbrud efter cellens replikation eller hæmning af DNA-syntese.20
MN kan dannes via forskellige veje: nemlig fra acentriske kromosom- eller kromatidfragmenter. En lille andel af acentriske kromosomfragmenter kan simpelthen opstå fra ureparerede dobbeltstrengede DNA-brud. Andre mekanismer, der kan føre til MN-dannelse fra acentriske fragmenter, omfatter samtidig excisionsreparation af beskadigede (f.eks. 8-oxo-deoxyguanosin) eller uhensigtsmæssige baser, der er inkorporeret i DNA (f.eks. uracil), som befinder sig i nærheden af og på modsatte komplementære DNA-strenge21 . En anden mekanisme, der kan føre til MN som følge af kromosomtab, er hypometylering af cytosin i centromeriske og pericentromeriske gentagelsessekvenser som f.eks. klassiske satellitrepeats i pericentromeriske regioner og satellit-DNA-repeats af højere orden i centromerisk DNA.21 På grund af kinetochore-proteinernes centrale rolle i forbindelse med kromosomernes kontakt med spindlen er det sandsynligt, at mutationer, der fører til defekter i kinetochore- og mikrotubulusinteraktionsdynamikken, kan forårsage MN-dannelse som følge af kromosomtab ved anafase. Andre variabler, der sandsynligvis kan øge MN fra kromosomtab, er defekter i mitotisk spindelmontering, defekter i mitosekontrolpunktet og unormal centrosomforstærkning.21
Den skæbne, som MN har efter dannelsen i den mikronukleerede celle, er dårligt forstået. Deres postmitotiske skæbne omfatter: (1) eliminering af den mikronukleerede celle som følge af apoptose; (2) udstødning fra cellen (når DNA’et i MN ikke forventes at være funktionelt eller i stand til at replikere på grund af fraværet af de nødvendige cytoplasmiske komponenter); (3) reinkorporering i hovedkernen (når det reinkorporerede kromosom kan være uadskilleligt fra hovedkernens kromosom og kan genoptage normal biologisk aktivitet) og 4) tilbageholdelse i cellens cytoplasma som en ekstranuklear enhed (når MN kan gennemføre en eller flere omgange af DNA/kromosomreplikation).20,22
Den vigtigste fordel ved CBMN-assayet ligger i dets evne til at påvise både clastogene og aneugeniske hændelser, der fører til henholdsvis strukturelle og numeriske kromosomale aberrationer.20 Klastogener inducerer MN ved at bryde DNA-dobbeltspiralen og danne acentriske fragmenter, der ikke er i stand til at klæbe til spindelfibrene og integrere sig i datterkernerne, og som derfor udelades under mitosen. Det samme sker med hele kromosomer med beskadigede kinetokorer; de kan ikke knytte sig til de mikrotubuli, der trækker kromatiderne mod dattercellerne under mitosen, og de forbliver derfor uden for de nye kerner. Denne skade kan opstå af kemikalier, der reagerer med de proteiner, der danner kinetokorerne.23,24
Aneugener er kemikalier, der forhindrer dannelsen af spindelapparatet under mitose. Disse midler genererer ikke kun hele kromatider, der bliver efterladt uden for kernerne og dermed danner MN, men også dannelsen af flerkernede celler, hvor hver kerne vil indeholde et andet antal kromosomer. Disse midler vil sandsynligvis også fremkalde en stigning i antallet af mitotiske figurer, som tydeligt ses på de samme objektglas. Med CBMN-assayet er det muligt at skelne mellem MN, der stammer fra hele kromosomer, og MN, der stammer fra acentriske fragmenter, samt at afgøre, om der forekommer malsegregering af kromosomer mellem kerner i en binukleeret celle, der måske ikke indeholder MN, ved hjælp af centromeriske prober.8,10,19
Pancentromeriske DNA-sonder anvendes til at skelne mellem MN, der stammer fra et tab af hele kromosomer og MN, der indeholder acentriske kromosomfragmenter. Brugen af kromosomspecifikke centromeriske DNA-sonder gør det muligt både at bestemme specifikke kromosomtabshændelser, der resulterer i MN, og ulige segregering af specifikke kromosomer mellem datterkerner, selv i fravær af MN-dannelse.21 Pancentromeriske sonder bør kun anvendes til at skelne mellem MN, der stammer fra kromosombrud (centromer-negativ) og kromosomtab (centromer-positiv). Kromosomspecifikke centromersonder bør kun anvendes til at måle malsegregering (på grund af nondisjunktion eller kromosometab), der involverer unikke kromosomer.8,10,19,21,25 Evaluering af den mekanistiske oprindelse af individuelle MN ved hjælp af centromer- og kinetokoridentifikation bidrager til metodens høje sensitivitet og specificitet.20
Væsentlige faktorer påvirker MN-frekvensen på baseline i humane lymfocytter. Alder og køn er de vigtigste demografiske variabler, der påvirker MN-indekset; frekvenser hos kvinder er større end hos mænd med en faktor 1,2-1,6, afhængigt af aldersgruppen.26 MN-frekvensen var signifikant og positivt korreleret med alder hos mænd og kvinder og påvirkes af kostfaktorer som f.eks. folatmangel og plasmaniveauer af vitamin B12 og homocystein. Det blev også foreslået, at MN-indekset kan påvirkes af et individs cellers tilbøjelighed til at undergå apoptose og genetiske faktorer såsom genetiske polymorfismer.10,20,27
I en generel form tilskrives dannelsen af MN en række forskellige krænkelser af det genetiske materiale, som kan klassificeres som eksogene og endogene faktorer. Exogene faktorer omfatter stråling, kemiske agenser og invasion af mikroorganismer. Endogene faktorer omfatter genetiske defekter, patologiske ændringer, mangel på essentielle næringsstoffer (f.eks. folinsyre) og skader induceret af skadelige metaboliske produkter (f.eks. reaktive oxygenarter).28
Hypotesen om en prædiktiv sammenhæng mellem hyppigheden af MN i CBMN-analysen i lymfocytter og kræftudvikling understøttes af en række resultater: (1) en sammenhæng mellem MN-frekvens og kræftrisiko blev udledt af mekanistiske ligheder med kromosomale aberrationer, som viste sig at være prædiktive for kræft; (2) in vitro observeres en høj overensstemmelse mellem kromosomale aberrationer og MN; (3) en stigning i MN-frekvens observeres i lymfocytter hos kræftpatienter og hos patienter med syndromer, der gør dem kræftprædiktive, såsom Blooms syndrom og ataxia telangiectasia; (4) MN-frekvensen er signifikant forbundet med blodkoncentrationen af vitaminer som f.eks. folat, hvis mangel er forbundet med øget risiko for visse kræftformer; (5) der er en direkte forbindelse mellem MN-frekvenser og tidlige stadier af carcinogenese: Der er nemlig en signifikant sammenhæng mellem en øget MN-frekvens og lav- og højgrads diagnostiske kategorier af livmoderhalskræft hos kvinder.20
Dannelse af nukleare anomalier som MN, kromosomale rearrangementer og anafasebroer (der fører til brud-fusionsbro-cyklusser og dannelse af flere MN) er begivenheder, der almindeligvis ses i de tidlige stadier af carcinogenese. Forhøjede MN-niveauer tyder på fejl i DNA-reparation og kromosomsegregation, som kan resultere i dannelse af datterceller med ændret gendosering eller deregulering af genekspression, som kan føre til udvikling af den kromosominstabilitetsfænotype, der ofte ses i kræft. Disse overvejelser giver mekanistisk støtte til en mulig årsagssammenhæng mellem MN-frekvens og risikoen for kræft. En undersøgelse af Bonassi et al.29 observerede en sammenhæng mellem MN-frekvens og kræftrisiko i ikke-hæmatologiske maligniteter, hvilket tyder på, at genomskadende hændelser i lymfocytter kan være korreleret med kræftinitierende hændelser i andre væv via en fælles genetisk, diæt- eller miljømæssig faktor.