Mikrobiologi & Eksperimenter

I denne undersøgelse blev der foretaget isolering og karakterisering af bakteriestammer fra Barrackpore Kommune og Dhapa affaldsdeponi. Bakterievækst afhænger af forskellige fysisk-kemiske forhold som f.eks. medie, pH, temperatur, inkubationstid, kulstofkilde osv. Så de forskellige betingelser, som bakterierne voksede under i naturlige omgivelser, bør undersøges, inden de anvendes til massiv formering med henblik på anvendelse som nedbrydningsmiddel. Følgende parametre blev således taget i betragtning:

Fysiske og kemiske egenskaber ved fast husholdningsaffald

Bakterier kan vokse i et bredt spektrum af fugtighedsniveauer. I denne undersøgelse blev det konstateret, at vandindholdet i den indsamlede prøve fra Barrackpore Kommune og Dhapa affaldsdepot var henholdsvis ca. 65,32 % og 66,45 %. Bakteriepopulationen i forskellige jordtyper er tæt korreleret med deres fugtighedsindhold. Den maksimale bakterietæthed findes i områder med et forholdsvis højt vandindhold, og det optimale niveau for aerobe bakteriers aktivitet er ofte 50-75 % af jordens fugtighedsopbevaringskapacitet.1 Slægterne Pseudomonas, Achromobacter og Bacillus findes i de fleste aerobe jordtyper; hvor forholdene er anaerobe og fugtige, forekommer Clostridium. Actinomyceter viste en lignende kvantitativ stigning under sådanne forhold.15

I denne undersøgelse blev pH-værdien af de to udvalgte medier (BCDA og NA) optimeret til dyrkning af bakteriestammer. Ph-værdien i den indsamlede prøve var 7,79 i begge prøver. pH er en nøglefaktor for dyrkning af bakterier i kunstige medier. Optimering af pH-værdien blev udført i to udvalgte medier, nemlig Nutrient Agar (NA) og Basic czapek dox agar (BCDA). NA og BCDA ved pH 7,2 og 7,6 viste sig at være velegnede til den maksimale vækst af bakteriestammerne. Ud fra resultaterne blev det konstateret, at prøvens pH-værdi var ca. 7,79, og muligvis af denne grund blev det også konstateret, at disse stammer voksede godt under in vitro-betingelser ved pH 7-8 i BCDA og NA. Bakterier kan tolerere en jordreaktion mellem pH-niveauerne 4 og 10, men den mest gunstige pH-værdi for de fleste er lige på den alkaliske side af neutralitet. Bakterier som Thiobacillus thiooxidans og Acetobacter sp. er i stand til at vokse ved meget lave pH-værdier mellem pH 0 og 2, og nogle Bacillus sp. kan vokse ved pH 11.15 Optimal vækst af Thermoactinomycetes finder sted ved pH 8 eller 9 og er stærkt hæmmet af reaktioner på omkring pH 516 Vibrio, Streptococcus faecalis og Escherichia coli tåler også en alkalisk reaktion (pH 8-9).16

Provens NPK-indhold blev undersøgt indledningsvis. Indholdet af organisk stof viste sig at være 27,84 % (Barrackpore Kommune) og 29,32 % (Dhapa), kvælstofindholdet i % var 0,165 (Barrackpore Kommune) og 0,179 (Dhapa), fosforindholdet i % var 0,502 (Barrackpore Kommune) og 0,545 (Dhapa) og kaliumindholdet i % var 18,29 (Barrackpore Kommune) og 19,21 (Dhapa). Alle disse analyser gav en klar forståelse af bakteriernes oprindelige miljø og var således afgørende faktorer for isolering og dyrkning af stammerne.

Kulturelle karakteristika for bakterieisolater

I vores undersøgelse blev BM1, BM2, BM3, D1, D2, D3, D4, C2 og C3 – disse 9 bakteriestammer – isoleret i kulturmedier. Czapek dox agar og Nutrient agar blev udvalgt for at bestemme de bedst egnede medier til at sikre massiv vækst af de isolerede stammer. czapek dox agar (BCDA) var egnet til massiv vækst af BM3, D1,C2 og Nutrient agar (NA) medium var egnet til massiv vækst af BM1, BM2, D2, D3, D4, C3. Det blev konstateret, at gærekstrakt-xylanholdige medier var velegnede til maksimal vækst af bakterier, men Pseudomonas sp., Bacillus spp. og Aeromonas sp. voksede godt i næringsagarmedier. Visuel og mikroskopisk observation blev anvendt til at karakterisere de udvalgte stammer. Detaljer om bakteriernes koloniforhold er noteret (tabel 1). Gramfarvning er en gammel og pålidelig metode til observation af bakterier. Gramnegative bakterier blev affarvet med alkohol, hvorved de mistede den lilla farve fra krystalviolet. Gram-positive bakterier blev ikke affarvet og forblev violette.

I den foreliggende undersøgelse, BM1, BM2, BM3, D1, D2, D3, D4, C2 og C3 – disse 9 bakteriestammer blev isoleret, og der blev foretaget en mikrobiologisk karakterisering. Resultaterne viste, at BM1, BM3, D1 er grampositive baciller, BM2 er grampositive korte baciller, D2 er grampositive diplobaciller, D3, C2 er gramnegative baciller, D4 er gramnegative korte baciller og C3 er grampositive kokkus. Der blev også udført forskellige biokemiske test for de 9 isolater for at få kendskab til deres biokemiske egenskaber. Nærmere oplysninger om bakteriernes biokemiske karakterer er anført i (tabel 2).

Overstående resultater gav en idé om de isolerede stammers morfologi, koloni-karakteristika og biokemiske karakter, hvilket vil være en hjælp til identifikation og karakterisering af de isolerede bakteriestammer i fremtiden.

Optimering af vækstbetingelser

I den foreliggende undersøgelse blev væksten af de isolerede stammer observeret i forskellige vækstmedier som NA, ACDA og BCDA. Det blev set, at basisk czapek dox agar (BCDA) var egnet til massiv vækst af BM3, D1, C2 og næringsstof agar (NA) medium var egnet til massiv vækst af BM1, BM2, D2, D3, D4, C3.

I dette forsøg blev bakteriekulturerne af 9 stammer inkuberet ved forskellige temperaturer som 25, 29, 34, 37 og 40 °C. Den optimale vækst for alle stammerne blev fundet ved 37 °C. Det optimale temperaturområde for bakterier er fra ca. 25-36 °C. Et stort antal bakterier kan vokse ganske godt ved en temperatur på 10-4 °C.6 Sultana17 observerede, at 33 ± 4 °C var ideelt for bakterievækst.17 Visse bakterier udvikler sig kraftigst ved temperaturer under 20 °C. Termofile bakterier vokser godt ved temperaturer 45-65 °C, og nogle termofile bakterier er ude af stand til at formere sig under 40 °C.1

De stammer, der blev opnået i denne undersøgelse, blev inkuberet i forskellige inkubationsperioder (6, 12, 24, 36, 48 og 72 timer). Inkubationsperioden på 24 timer var passende for BM1, BM2, D2, D3, D4, C3, mens BM3, D1 og C2 viste sig at være passende med en inkubationsperiode på 36 timer. Coliforme bakterier vokser i en inkubationsperiode på 24 ± 2 timer og ved 32 °C, og de viser god vækst ved 37 °C i 48 timers inkubation. Ved visuel observation blev det konstateret, at BM2 efter 24 timers inkubation havde en lys orange farve, BM1 var hvid og BM3 var cremehvid i deres foretrukne medium (BCDA og NA). Efter 48-72 timers inkubation var BM2 orange, BM1, D1 var gule, C2 var rød, og BM3, D2, D3, D4, D4, C3 var stadig cremefarvede. Kolonityperne af stammerne BM1, BM2, D2 og D4 var våde, mens resten var cremefarvede. Stafylokokker og mikrokokker danner gyldenbrune, gule eller hvide kolonier på almindelige medier. Nogle enterokokker, coryneformer og enterobakterier kan producere sorte kolonier på almindelige medier.8

Antagonismeassay

Cross streaking-metoden blev anvendt til at bestemme antagonismen mellem bakteriestammerne med henblik på deres fremtidige anvendelse i forskellige aspekter. Detaljer om antagonismen inden for de bakterielle isolater er beskrevet (tabel 3).

BM2 har antagonisme med alle de andre stammer, så det er ikke muligt at udvikle et konsortium med denne stamme som et af isolaterne. D1, D3 har også antagonisme med de fleste af de andre stammer. BM1 er den mest potente stamme, da den ikke har antagonisme med nogen af de andre isolater. BM3, D2, D4, D5 og D6 har antagonisme med nogle få isolater, og disse stammer kan sammen med BM1 testes i forskellige kombinationer med henblik på at fremstille et konsortium.

Toleranceforsøg med tungmetaller

Fem tungmetaller (As, Zn, Pb, Hg, Cd) blev udvalgt til bestemmelse af de isolerede bakteriestammernes (BM1, BM2, BM3, DF1, D2, D3, D4, C2, C3) evne til at tolerere metaller. Tolerancetesten viste, at blandt de fem undersøgte tungmetaller blev der udvist maksimal tolerance over for Pb med vækst af mikroorganismer op til 4000 ppm og minimal tolerance over for Cd med ingen vækst over 30 ppm. MIC blev konstateret, når isolaterne ikke kunne vokse på pladerne selv efter 10 dages inkubation. Resultatet viser, at MIC for alle tre bakterier varierede fra 250 ppm til 350 ppm for As, Cd (10-30 ppm), Zn (200-300 ppm), Hg (200-300 ppm) og Pb (3000-4000 ppm) (tabel 4). I den foreliggende undersøgelse blev den højeste tolerance over for As og Cd fundet i BM1, mens den højeste Zn-tolerance blev observeret i BM2, og BM3 viste maksimal Hg- og Pb-akkumulering. I vores undersøgelse er det mest giftige metal (med den laveste MIC) Cd, mens det mindst giftige metal, der blev testet, er Pb (tabel 4).

MIC blev konstateret, når isolaterne ikke voksede på pladerne, selv efter 10 dages inkubation.18 Mergeay et al.19 testede de minimale hæmmende koncentrationer (MIC) af flere forskellige metaller og fandt, at det mest giftige metal (med den laveste MIC) var kviksølv, mens det mindst giftige metal var mangan.19 Den mikrobielle tolerance ved hver koncentration af tungmetaller blev skildret ved hjælp af cup assay-testen. Diameteren af hæmningszonen omkring hvert bæger øgedes med stigningen i koncentrationen af tungmetaller, hvilket indikerer tungmetallernes toksiske virkning på mikroorganismernes vækst. Barrackpore Kommune og Dhapa affaldsdeponeringssted indsamler alt fast husholdningsaffald og industriaffald fra henholdsvis Barrackpore by, Kolkata by og de omkringliggende områder. Affaldet fra husholdnings- og industriaffald er det rette miljø, hvor mikroorganismerne kan udvikle resistens over for tungmetaller. Tilstedeværelsen af små mængder tungmetaller i det faste affald kan give anledning til fremkomsten af tungmetalresistente mikroorganismer. Den mikrobielle resistens over for tungmetaller tilskrives en række forskellige afgiftningsmekanismer, som er udviklet af resistente mikroorganismer, f.eks. kompleksdannelse ved hjælp af exopolysaccharider, binding med bakterielle cellehjule, metalreduktion, metaludstrømning osv. Disse mekanismer er sommetider kodet i plasmidgener, der letter overførslen af resistens over for giftige metaller fra en celle til en anden20 . Da tungmetaller alle ligner hinanden i deres toksiske mekanisme, er flere metaltolerancer almindelige fænomener blandt tungmetalresistente bakterier.21

Antibiotikafølsomhedstest

Antibiotikafølsomhedstest hjælper til at bestemme, hvor effektivt et antibiotikum er mod testorganismen. De 9 isolater blev undersøgt for deres følsomhed over for fire antibiotika, og resultatet er noteret (tabel 5). De fleste af isolaterne producerer antimikrobielle forbindelser, som kan være til gavn for lægevidenskaben. D1, D3 og D5 viste ingen antimikrobiel aktivitet.

Antimikrobiel aktivitetstest

Produktion af antimikrobielle forbindelser synes at være et generelt fænomen for de fleste bakterier. I den foreliggende undersøgelse viste 3 isolater antibakteriel aktivitet og 5 isolater antimykotisk aktivitet, men 3 isolater viste hverken antibakteriel eller antimykotisk aktivitet over for patogenerne. Resultatet er blevet vist (tabel 6). En lignende undersøgelse blev rapporteret af Subramaniam et al.22 En række forskellige antimikrobielle forbindelser produceres af medlemmer af Bacillus-slægten, hvoraf mange af disse identificeres som peptider, lipopeptider og phenolderivater. Søgningen efter nye sekundære metabolitter med forskelligartet biologisk aktivitet i forskellige miljøer har fået større opmærksomhed i de senere år.

Ekstracellulær enzymproduktion

Med den stigende bevidsthed om miljøbeskyttelse har brugen af enzymer, især fra ekstremofile, fået stor opmærksomhed i mange industrielle processer. I de seneste år har mikrobielle enzymer erstattet kemiske katalysatorer ved fremstilling af kemikalier, tekstiler, lægemidler, papir og fødevarekemikalier til landbruget. Enzymbaserede industrielle bioprocesser konkurrerer nu direkte med etablerede kemisk baserede processer. I denne undersøgelse blev de 9 isolater imidlertid underkastet kvalitative analyser for produktion af otte forskellige enzymer såsom protease, lecithinase, DNase, lipase, cellulase, amylase, katalase og oxidase. En lignende undersøgelse blev rapporteret af Subramani og Narayanasamy.23 Interessant nok viste 6 af dem i vores undersøgelse produktion af proteaseenzym, som har en høj markedsværdi. Alle de 9 stammer producerede katalase- og oxidaseenzym. Resultatet er noteret (tabel 7).

Proteaseassay

6 stammer (BM1, BM3, D1, D3, C2 og C3) blandt de 9 isolater udviste proteaseproduktion. Da protease har en bred anvendelse i fødevareindustrien, vaske- og rengøringsmiddelindustrien, medicinalindustrien og i nedbrydning af fast affald, blev der foretaget en kvantitativ analyse af den producerede protease. Aktiviteten af det således producerede proteaseenzym blev bestemt, og resultatet blev udtrykt i IU/ml. Resultatet er vist i tabel 8. Den kvantitative bestemmelse af protease viste uvægerligt, at blandt de 6 stammer producerer BM1 protease med en høj titerværdi, og Gupta et al.,24 rapporterede ligeledes om alkalisk proteaseproduktion fra bakteriearter og dens industrielle anvendelse.

Affaldsnedbrydningspotentiale ved isolerede bakterier

Proteaseenzym har stor anvendelse ved nedbrydning af affald. De 6 stammer, der kan producere proteaseenzym, blev således underkastet en test for affaldsnedbrydningseffektivitet. I vores undersøgelse kan det konstateres, at BM1 har det højeste nedbrydningspotentiale efterfulgt af BM3. BM1 er også en potent proteaseenzymproducent og har derfor også en bedre nedbrydningsevne (figur 1). Efterhånden som affaldet nedbrydes af mikroorganismer (bakterier), mindskes strøelsens vægt. I den foreliggende undersøgelse af nedbrydningen observerede vi, at vægten af det behandlede affald faldt, fordi bakterierne nedbrød det og omdannede det til simple molekyler. Procentdelen af vægttabet af affaldsprøverne øgedes med fremgangen i nedbrydningsprocessen, som det fremgår af figur 1. En lignende observation blev rapporteret af Zaved et al.25 om en undersøgelse af vægttab af affald ved hjælp af specifikke bakterier i Bangladesh. I vores undersøgelse kan det observeres, at BM1 har det højeste nedbrydningspotentiale efterfulgt af. BM1 kan således anvendes effektivt til bioremediering af fast affald.