Kryptokromerne

Cirkadiske biologiske ure er biokemiske oscillatorer, der cykluserer ca. hver 24. time, og som kan nulstilles ved at blive udsat for lys og andre miljøsignaler. Hos dyr findes der en central oscillator i hjernen, som styrer hele organismens cirkadiske adfærd, samt perifere oscillatorer i nogle væv. Oscillationen skyldes et transkriptionelt feedbackloop, der involverer en række clock-transskriptionsfaktorer, herunder timeless (Tim), period (Per), clock (Clk) og Bmal1 samt kryptochromer. Cryptochromer er allestedsnærværende udtrykt i alle organers organer og væv, og de er generelt nukleare proteiner, der regulerer genekspressionen. De bedst undersøgte dyre-kryptokromer er Drosophila-kryptokromet Cry og musekryptokromerne Cry1 og Cry2 , og de to Arabidopsis-kryptokromer CRY1 og CRY2 er også blevet undersøgt indgående.

Drosophilakryptokromer

Drosophila Cry er et overvejende nukleært protein, der medierer regulering af det cirkadiske ur ved hjælp af lys , selv om det også kan findes i cytosolen. Det regulerer det cirkadiske ur ved at interagere direkte med proteinet Tim for at undertrykke urets negative feedbackloop (figur 3a). Lys stimulerer Cry-Tim-interaktionen, hvilket fremmer ubiquitination og proteosomafhængig nedbrydning af Tim og undertrykker dannelsen af Per-Tim-heterodimeren. Hæmningen af en heterodimer af Clock- og Cycle-proteinerne af Per-Tim-heterodimeren ophæves således, og fasen af den cirkadiske svingning nulstilles (figur 3a). Cryptochrom er dog tilsyneladende ikke den eneste fotoreceptor, der trækker det cirkadiske ur i Drosophila. Adfærdsrytmen hos den crybmutante flue, som mangler Cry-funktionen, kan ikke desto mindre trækkes med som reaktion på lys, medmindre signaltransduktionen fra det visuelle pigment også elimineres . Ud over sin rolle som fotoreceptor for medtagelse af den centrale oscillator i Drosophila har Cry også en lysuafhængig rolle i funktionen af den perifere cirkadiske oscillator .

Pattedyrs kryptokromer

Drosophila Cry’s to funktioner – som en fotoreceptor til entrainering af det cirkadiske ur sammen med synspigmenter og som en integreret komponent i det cirkadiske oscillatorproteinkompleks – er også kendetegnende for pattedyrs kryptokromer. Pattedyrs kryptochromer er overvejende nukleare proteiner , men de kan også findes i cytosolen . Ligesom Drosophila Cry udfører pattedyrs kryptokromer både lysafhængige og lysuafhængige funktioner i reguleringen af det cirkadiske ur. Flere observationer viser, at pattedyrs Cry-proteiner spiller en lysafhængig rolle. Knockout-mus, der mangler et eller begge Cry-gener, har en reduceret eller ophævet evne til at inducere ekspression af gener som f.eks. per og protooncogenet c-fos som reaktion på lys . Desuden har pupillerne hos mutantmus, der mangler både Cry1 og Cry2, reducerede refleksreaktioner på lys .

På den anden side viser cry1 cry2-dobbeltmutantmusen en tilsyneladende normal rytmicitet under lys-mørke-cyklusforhold, men den mister rytmiciteten øjeblikkeligt og fuldstændigt under fritløbende (altid mørke) forhold . Disse observationer tyder på, at Cry-proteinerne spiller en væsentlig og lysuafhængig funktion i pattedyrenes centrale cirkadiske oscillator, og at kryptokromerne ikke er de eneste fotoreceptorer, der formidler lysstyring af uret. Det faktum, at cryptochromer er integrerede dele af musens centrale oscillator, gør det næsten umuligt at teste direkte deres rolle i lysstyringen af uret. Ikke desto mindre har man fundet ud af, at musens cry-mutant, lidt analogt med situationen for Drosophila, bevarer sin evne til at formidle lysinput, medmindre funktionen af synspigmenter også er forstyrret samtidig. Triple-mutante mus, der bærer mutationer i begge kryptochromer sammen med en nethindedegenerativ mutation, er næsten arytmiske under lys/mørke-cyklusforhold . Disse resultater viser, at pattedyrs Cry-proteiner faktisk er involveret i regulering af det cirkadiske ur ved hjælp af lys, men at deres rolle i lysstyringen af det cirkadiske ur udføres redundant af andre fotoreceptorer. Det synes nu at stå klart, at de yderligere fotoreceptorer, der sammen med kryptokromer virker sammen med pattedyrs cirkadiske oscillator, er visuelle stav-kegleopsins og det beslægtede protein melanopsin .

Som Cry fra Drosophila interagerer pattedyrs kryptokromer fysisk med urproteiner, herunder de promotorbindende transkriptionsregulatorer Per, Clk og Bmal1 (figur 3b). I modsætning til Drosophila Cry er pattedyrs Cry-proteiner komponenter i det cirkadiske klokkes negative feed-back loop (Figur 3b). Cryptochromets fysiske interaktion med andre urkomponenter påvirker deres aktivitet, interaktion, nedbrydning eller nukleare trafikering og ændrer følgelig den transkriptionelle regulering af urgenerne . Men interaktionen mellem kryptokromer og andre urproteiner såsom Per, Clk og Bmal1 synes ikke at blive påvirket af lys, hvilket tyder på, at sådanne interaktioner måske ikke er mekanismen for fotostyring af det cirkadiske ur, som det er tilfældet i Drosophila. Ud over den direkte regulering af transkription via fysisk interaktion med promotorbindende transkriptionsregulatorer kan kryptokromer også påvirke det cirkadiske ur ved at deltage i reguleringen af histonmodifikationer , men hvordan dette fungerer, skal endnu ikke belyses.

Arabidopsiskryptokromer

Arabidopsis CRY1 og CRY2 er overvejende nukleære proteiner, der medierer regulering af genekspression og meditation af det cirkadiske ur som reaktion på lys . CRY1 og CRY2 spiller vigtige roller i planters fotomorfogenese, såsom hæmning af stængelforlængelse ved blåt lys, stimulering af bladudvidelse ved blåt lys og regulering af blomsterinitiering ved dagslængde . Det ser ud til, at kryptokromer kontrollerer udviklingsændringer i planter via ændringer af genekspression som reaktion på lys. CRY1 og CRY2 er tilsammen ansvarlige for blålysafhængige ændringer i genekspressionen af op til 10-20% af Arabidopsis-genomet .

Der er mindst to mekanismer, hvormed kryptochromer kan påvirke nukleare genekspressionsændringer som reaktion på lys. For det første kan et kryptokrommolekyle interagere med proteiner, der er forbundet med transkriptionsmaskineriet, for at påvirke transkriptionen direkte. Arabidopsis CRY2 binder til kromatin på en DNA-sekvens-uafhængig måde ( og M. Maymon og C.L., upublicerede observationer), men det er uklart, hvordan et sekvens-uafhængigt kromatin-interagerende protein kan regulere genekspression. I modsætning til de animalske kryptokromer, som har vist sig at regulere transkription via fysiske interaktioner med promotorbindende transkriptionsregulatorer, er der ikke rapporteret om en sådan interaktion for plantekryptokromer. En alternativ model er, at plantekryptokromer kan interagere med proteiner, der udøver andre cellulære funktioner for at regulere transkriptionsregulatorernes stabilitet, modifikation og cellulære trafikering. F.eks. har man fundet, at plantekryptokromer interagerer med en E3 ubiquitinligase, COP1, hvilket tyder på, at plantekryptokromer kan virke på en måde, som endnu ikke er opdaget for dyrekryptokromer . I overensstemmelse med dette synspunkt er det også for nylig blevet konstateret, at Arabidopsis-kryptokromer medvirker til at undertrykke den proteasomafhængige nedbrydning af en vigtig blomsterregulator, CONSTANS , ved hjælp af blåt lys. Præcis hvordan cryptochromer gør dette skal undersøges yderligere.

Mekanisme

Kryptochromernes katalytiske mekanisme er ikke fuldt ud opklaret, men nogle ledetråde kan findes i mekanismen for CPD-fotolyaser, hvor FAD spiller den vigtigste katalytiske rolle . I en DNA-reparationsreaktion binder CPD-fotolyase sig til DNA’s pyrimidin-dimer og “vender” den ud fra DNA-duplexet og ind i enzymets FAD-adgangshulrum for at danne et stabilt kompleks. Den anden kromofor (pterin eller deazaflavin), som også kaldes “antenne”-kromoforen, absorberer fotoner af blåt eller UV-A-lys og overfører excitationsenergien til FAD’s flavin. Flavin i den exciterede tilstand afgiver en elektron til pyrimidindimeren for at dele cyclobutanringen. Elektronen overføres tilbage til flavin i denne proces, hvilket resulterer i regenerering af flavin i grundtilstand. Det reparerede dinukleotid passer ikke længere ind i FAD-adgangshulrummet, så det adskiller sig fra fotolysen. Den nøjagtige rolle, som FAD og FAD-adgangshulrummet spiller i kryptokromernes funktion, er fortsat uklar, men det er tænkeligt, at det også kan være involveret i elektronoverførselsreaktioner.

Men selv om PHR-regionen, der indeholder kromoforen(erne), er den mest bevarede del af proteinerne, er det carboxy-terminale domæne blevet vist at spille en rolle i funktionen eller reguleringen af både dyre- og plantekryptokromer. Ekspression af de carboxy-terminale domæner af Arabidopsis-kryptochromer, der er fusioneret med markørenzymet b-glucuronidase, giver et konstitutivt vækstrespons på lys selv i mørke i fravær af PHR-regionen . I modsætning hertil er PHR-regionerne i Drosophila- og Xenopus-kryptochromerne fysiologisk aktive i fravær af det carboxy-terminale domæne . Det carboxy-terminale domæne af Drosophila Cry er vigtigt for proteinstabilitet, interaktion med Tim og fotoreceptorens følsomhed over for cirkadiske lyssignaler , mens det carboxy-terminale domæne af Xenopus Cry er påkrævet for dets nukleare lokalisering .

Kryptochromer reguleres ved fosforylering. Det er blevet vist, at Arabidopsis-kryptochromer fosforyleres som reaktion på blåt lys, og at dette er forbundet med fotoreceptorernes funktion og regulering . Da Arabidopsis CRY1 blev udtrykt i insektceller, viste det sig desuden, at det undergår ATP-afhængig og blålysafhængig autofosforylering . Det vides ikke, om dyrs kryptokromer også binder til ATP, selv om det er blevet vist, at musekryptokromer er fosforylerede .

Interaktionen mellem Arabidopsis CRY1 PHR-regionen og ATP har et par interessante træk, der minder om interaktionen mellem pyrimidindimeren og fotolyase : ATP’s fosfatgrupper er eksponeret for opløsningsmiddel; adenin- og riboseenhederne er begravet dybt inde i FAD-adgangshulrummet; og ATP kan have en vandmedieret kontakt med FAD . Interaktionen mellem Arabidopsis CRY1 pHR-regionen CRY1 og ATP mangler også flere af de egenskaber, der almindeligvis findes i protein-ATP-interaktioner, såsom protein-til-fosfat-interaktion, protein-til-Mg2+-kontakt og en nærliggende serinrester til fosfotransfer . En undersøgelse af topologien i CRY1 PHR-regionens struktur viser imidlertid, at alle disse egenskaber potentielt kunne leveres af det carboxy-terminale domæne af cryptochromet (figur 4). Observationen af, at de serinrige carboxy-terminale domæner af Arabidopsis-kryptokromer, der er fusioneret med β-glucuronidase, er konstitutivt fosforylerede in vivo (, tyder på, at der kan ske en fosfotransfer fra ATP bundet til FAD-adgangshulrummet til det nærliggende carboxy-terminale domæne (Figur 4a). Det er også tænkeligt, at foton-eksponeret FAD kan udløse elektronoverførsel til nukleotidet og fosfotransfer fra ATP til serinrester på det carboxy-terminale domæne. Da PHR-regionens overflade overvejende er negativt ladet, især på det sted, hvor det carboxy-terminale domæne sandsynligvis vil interagere med den, vil det fosforylerede carboxy-terminale domæne derefter blive frastødt fra PHR-regionens overflade, hvilket vil resultere i en ændring af cryptochromkonformationen. Denne konformationsændring vil give det mulighed for at interagere med andre signalproteiner og for at udbrede lyssignalet (figur 4a). Alternativt kan et andet cryptochrommolekyle, der binder sig til FAD-adgangshulrummet, også give de manglende egenskaber, der er nødvendige for et produktivt ATP-cryptochrom-interaktion. Faktisk kan både CRY2-CRY2-interaktion og CRY1-CRY2-interaktioner påvises i Arabidopsis (D. Shalitin, X. Yu og C.L., upublicerede observationer). Dannelse af enten en homo-oligomer eller en hetero-oligomer af kryptokromer ville give en mekanisme for intermolekylær fosfotransfer, som kan ændre strukturen af kryptokromerne (Figur 4b, c).