RECEPTOR
Erythropoietinreceptoren er blevet klonet ved hjælp af en ekspressionsstrategi fra et cDNA-bibliotek af murine erythroleukæmiske celler (D’Andrea et al., 1989). Det humane erythropoietinreceptor-gen er lokaliseret på kromosom 19p (Winkelman et al., 1990). Der er otte exoner og syv introner, som koder for et 507 aminosyrepeptid med en molekylvægt på 66 kDa. I det menneskelige gen koder exon 1-5 for det ekstracellulære domæne på 251 aminosyrer, exon 6 for en a-helisk region på 20 aminosyrer, der spænder over membranen, og exon 7-8 for det cytoplasmatiske domæne på 236 aminosyrer (Youssoufian et al., 1993). Den humane erythropoietinreceptor har ingen N-koblede glykosyleringssteder, men en høj frekvens af serin- og threoninrester (Jones et al., 1990). Der er 82% identitet mellem humant og murin erythropoietin. Krydsbinding af erythropoietin til celleoverfladen af erytroide celler har afsløret to accessoriske molekyler på 85 og 100 kDa, som ikke genkendes af anti-p66-antistoffer (D’Andrea og Zon, 1990; Mayeux et al., 1991). Deres funktion skal imidlertid bestemmes.
Erythropoietinreceptoren tilhører type 1-familien af enkelt-transmembran cytokinreceptorer. Denne familie deler et bevaret ekstracellulært domæne bestående af fibronectin type III (FNIII) subdomæner samt et bevaret α-kædens cytoplasmatiske boks 1 motiv, som binder selektivt til Janus kinaser (JAK) (Bazan, 1990b). Den ekstracellulære region af erythropoietinreceptoren indeholder to FNIII-subdomæner (D1 og D2), som danner en L-form, hvor den lange akse af hvert domæne er rettet ca. 90° mod den anden akse. Det NH2-terminale D1-domæne består af fire på fire a-strenge, og D2-domænet består af syv aniparallelle a-strenge (Livnah et al., 1996). D1-domænet danner en h-type fold med en hybrid FNIII/immunoglobin-lignende topologi, og to distale par af cysteinrester danner disulfidbroer. Det membranproximale D2-domæne folder sig med standard FNIII-topologi af s-typen og indeholder et konserveret WSXWS-motiv (dvs. tryptofan-serin-animal aminosyre-tryptofan-serin), som er vigtigt for erythropoietinreceptorens foldning (Quelle et al., 1992). D1- og D2-domænerne bidrager sammen med seks loops til erythropoietin-interaktioner. Den cytoplasmatiske region, som er rig på aminosyrerne prolin, glutamin og aspartase, indeholder et box 1-domæne (rester 257-264), som er specifikt for JAK2 (Zhuang et al., 1994; Jiang et al., 1996), et boks 2-domæne (rester 303-313) og otte phosphotyrosinsteder (Tyr 343, 401, 429, 431, 443, 460, 464, 479), der formidler rekruttering af Src homology-2 (SH2)-domæne-kodende effektorer. En udvidet box2 (rest 329-372) er afgørende for binding af tyrosinkinase-receptoren KIT efter aktivering af dens ligand og forårsager tyrosinfosforylering af erythropoietinreceptoren, hvilket indikerer et funktionelt samspil mellem de to receptorer (Wu et al., 1995a). Erythropoietin aktiverer erythropoietinreceptoren ved dimerisering (Philo et al., 1996). Det ene p66-molekyle binder erythropoietin med høj affinitet (Kd ca. 1 nM), det andet med en lavere affinitet (Kd ca. 2 μM). Ved hjælp af mutationer og deletioner er de aktive steder for erythropoietin blevet kortlagt (Boissel et al., 1993; Wen et al., 1994; Elliott et al., 1997). Bivalente, men ikke monovalente monoklonale antistoffer rettet mod det ekstracellulære domæne af erythropoietinreceptoren inducerer proliferation af erythropoietinafhængige cellelinjer og dannelse af BFU-E, hvilket tyder på en receptoraktivering gennem dens dimerisering (Elliot et al., 1996). Den samme virkning kan opnås ved anvendelse af små erythropoietin-mimetiske peptider (EMP’er) (Livnah et al., 1996; Wrighton et al., 1996). Selv om EMP ikke har nogen sekvenshomologi med erythropoietin, binder de specifikt til erythropoietinreceptoren. Punktmutationer i det ekstracellulære domæne (R129C, E132C eller E133C) danner disulfidbindinger og aktiverer konstitutivt også receptoren (Watowich et al., 1994). Især mutationen af arginin 129-residuen til en cystein er onkogen og inducerer erythroleukæmi (Longmore og Lodish, 1991). EMP33 er derimod i stand til at dimerisere receptoren, men ikke til at aktivere den, hvilket tyder på, at konformationsændringen i den dimeriserede receptor spiller en væsentlig rolle for dens signalering (Livnah et al., 1998; Remy et al., 1999). Det er blevet foreslået, at der findes præformede inaktive receptordimerer på celleoverfladen, som formidles af de mellemliggende D1-D2-regioner og giver en adskillelse på 79 A ved basen af deres ekstracellulære domæner (Livnah et al., 1996). Efter binding af en agonist ændrer de ekstracellulære receptordomæner deres struktur i en defineret orientering med en afstand på 39 Å, hvilket giver en justering af deres cytoplasmatiske komponenter og fører til signalering (Wilson og Jolliffe, 1999).
Udover at binde erythropoietin kan erythropoietinreceptoren aktiveres ved andre mekanismer. Det gp55-hindeprotein, der er kodet af murin Friend-virus, inducerer erythroleukæmi hos mus efter binding til og aktivering af den murine erythropoietinreceptor (Wolff og Ruscetti, 1985; Li et al., 1990). Desuden er syntetiske peptider, der ikke deler nogen sekvenshomologi med erythropoietin, i stand til at stimulere erythropoietinreceptoren (se nedenfor).