Resultater
Vi rapporterer demografiske data og klinisk fænotype for 36 genetisk bekræftede AME-patienter fra International Consortium of Rare Steroid Disorders (internationalt konsortium for sjældne steroide lidelser). Størstedelen af patienterne var af omansk (22 af 36) og persisk (6 af 36) afstamning, hvor 75 % var fra consanguine ægteskaber, hovedsageligt inden for Oman (Fig. 1B og Tabel S1). Medianalderen for AME-diagnosen var 4.6 y (interval: 0.1-15), og kohorten var ligeligt fordelt for begge køn. Størstedelen af patienterne (86%) blev født til termin, og 76% blev født små for gestationsalderen. Fig. 1A viser, at der i vores kohorte var seks missense-, en insertion-, to deletions- og tre frameshift-mutationer samt to indels i vores kohorte. Som forventet ud fra AME’s patofysiologi var det nuværende gennemsnitlige arterielle tryk forhøjet over den 90. percentil for alle forsøgspersoner (Fig. 1C). Det gennemsnitlige serumkaliumniveau ved diagnosen var lavt på 2,72 mmol/L (interval: 1,5-4,1 mmol/L), mens serumbicarbonat var højt på 29,5 mmol/L (interval: 20-38 mmol/L) (Fig. 1 D og E). Serumaldosteronniveauerne var forventeligt lave (Fig. 1F), med to patienter med forhøjede niveauer af uklare årsager. Desuden var reninniveauerne lave, bortset fra to patienter (10,4 og 14 ng/mL/h), som var i behandling (Tabel S1). I en delmængde af 29 patienter var det gennemsnitlige (THF + alloTHF)/THE-forhold, der repræsenterer de vigtigste urinmetabolitter af kortisol og kortison, signifikant forhøjet på 19 (interval: 3-55, normalt: 1,0) (Fig. 1G). Det er bemærkelsesværdigt, at 27 af 36 (75 %) patienter også præsenterede nefrocalcinose. Nefrocalcinosen kan opstå som følge af kronisk langvarig hypokalæmi som f.eks. bemærket i Bartters syndrom type III (14).
For at forstå, om den kliniske fænotype af HSD11B2-mangel kunne forudsiges ved at undersøge ændringer i enzymstrukturen induceret af en given HSD11B2-mutation, udførte vi in silico-analyser ved hjælp af tre østrogene HSD17B1, der udviste en 27% sekvenslignende lighed med HSD11B2 over 284 aminosyrer (Fig. S1A). Den humane HSD11B2-model udviste et karakteristisk konserveret NAD-bindende Rossmann-foldemotiv (Fig. S1B) med et tilstødende substratbindende sted (Fig. S1 C og D). 500-ns MD-simuleringerne af monomer- og dimerformerne af HSD11B2 viste en stabil model med stabilt foldet protein (Fig. S1 E-H). Vi brugte Internal Coordinate Modeling (ICM)-software (www.molsoft.com) (18) til at bestemme ΔΔG af missense-mutationer fundet hos AME-patienter eller eksperimentelt konstruerede mutationer. Alle mutationer (Fig. 2A) viste en stigning i ΔΔG-værdierne, hvilket tyder på tab af proteinstabilitet og funktion (Fig. 2B).
Disruptive mutationer, der påvirker dimergrænsefladen hos HSD11B2. (A) Human HSD11B2-dimer-model konstrueret ved hjælp af eksisterende HSD17B1-krystalstrukturer: 1IOL (samkrystalliseret med 17β-estradiol), der var den mest komplette struktur uden manglende rester; 1JTV (1,5 Å), der blev samkrystalliseret med testosteron og udviste en højere opløsning end 1IOL (2,3 Å); og 1FDV, der blev samkrystalliseret med coenzymet NAD. Placeringen af alle kendte muterede rester er angivet. (B) ∆∆G-værdier for alvorlige (rød) eller milde (sort) HSD11B2-mutationer. (C) Ved dimergrænsefladen dannes der to R186-E190-ionpar mellem den tofoldige omvendte symmetri af de tilstødende underenheder. I tilfælde af monomeren (D) dannes et intrahelikalt ionpar, som ligner den R112- og E120-saltbro, der dannes i HSD17B1-skabelonerne. (E) Rumlige positioner af mutationer (blå) kortlagt på en underenhed. De to underenheder er tydeligt farvet (brun og blå). NAD+ (gul) og kortisol (grøn) er illustreret som pinde. Ionpar-interaktionen ved dimergrænsefladen er stabil i hele 500-ns-simuleringen (F). Der observeres dog visse udsving i den intrahelikale interaktion som følge af konformationsændringer i monomeren (G). (H) R186 skaber ionparinteraktioner med E190 fra den tilstødende underenhed. R186C-mutationen resulterer i tab af ionparinteraktionen. Et intrahelikalt ionpar, der er dannet mellem R186 og E190 i monomeren, er også gået tabt. (I) A237V-mutationen øger hydrofobiciteten ved grænsefladen. (J) D244 danner et intrasubunit ionparinteraktion med R336 samt hydrogenbindinger med R360 fra den tilstødende underenhed. Den polære uladede sidekæde af asparagin i mutanten er ikke i stand til at give strukturel stabilitet. (K) OH-gruppen i L251S-mutationen danner en hydrogenbinding med R361 fra den tilstødende underenhed og forbedrer dermed interaktionen ved dimergrænsefladen. (L) Den hydrogenbinding, der dannes mellem D176N og T200, forstærker den inaktive dimertilstand.
HSD11B2 eksisterer som en homodimer i sin inaktive tilstand (13). Fire rester – nemlig R186, E190, A237 og R336 – ligger ved dimergrænsefladen og kunne derfor interferere med dimerdannelse (Fig. 2C). Residuerne R186 og E190 er placeret ved dimergrænsefladen på α4-helixen. Der dannes en intersubunit ionparinteraktion (R186-E190) som følge af den tofoldige omvendte symmetri af den tilstødende underenhed (Fig. 2D), svarende til ionparret R112-E120 i HSD17B1 (15⇓-17). Det er vigtigt, at denne interaktion blev fundet at være stabil og blev opretholdt i hele forløbet af 500-ns MD-simuleringer (Fig. 2 E-G). Endvidere blev det konstateret, at interaktionen stabiliserer α4-helixen og opretholder fleksibiliteten omkring coenzymbindingsstedet. Således resulterer R186C-mutationen i tab af intersubunit-ionparret og skubber ligevægten i retning af dannelse af et aktivt monomer enzym (Fig. 2H). Den forhindrer også dannelsen af den intrahelikale ionparinteraktion og muliggør således destabilisering af strukturelle elementer omkring coenzymbindingsstedet.
Der er flere andre forstyrrende mutationer ved denne dimergrænseflade, der involverer resterne A237, D244, L251 og D176. Rest A237 er omgivet af L241 og V239 fra begge HSD11B2-underenheder. Dets mutation til Val øger hydrofobiciteten af denne klynge og styrker enzymets inaktive dimeriske tilstand (Fig. 2I). Rest D244 skaber ikke kun en intrasubunit saltbro med R336, der holder α5-helixen og β7-bladene sammen, men også hydrogenbindingsinteraktioner med R360 fra den tilstødende underenhed (Fig. 2J). Dens mutation til Asn mindsker styrken af R360-interaktionen, hvilket fører til tab af saltbroen med R366; dette forringer til gengæld proteinets stabilitet. På samme måde øger mutation af en hydrofob L251-sidekæde til en hydroxylgruppe af Ser polariteten og danner en hydrogenbinding med de positivt ladede sidekædegrupper af R361; dette forbedrer dimerbindingen (Fig. 2K). Endelig skaber mutationen af D176 til Asn en hydrogenbinding mellem asparagin og T200, hvorved den inaktive dimertilstand forstærkes (Fig. 2L).
Mutationer af HSD11B2-rester, der danner substrat- eller coenzym (NAD+)-bindingslommen, har i in vitro-undersøgelser vist sig at eliminere enzymaktiviteten (19) og forårsage alvorlig AME. For eksempel er Y226 placeret i den substratbindende lomme (fig. 3A). Den aromatiske phenolsidekæde danner hydrofobiske interaktioner med substratets aromatiske ring. Y226N-mutationen erstatter denne rest med en ikke-aromatisk rest, hvilket resulterer i tab af hydrofob stabling, hvilket forstyrrer substratbindingen (Fig. 3A). Desuden ændrer denne mutation sidekæden fra at være hydrofobisk til hydrofil, hvilket er ugunstigt for bindingen af et hydrofobisk substrat. A221V-mutationen erstatter den korte sidekæde med en lidt mere voluminøs sidekæde af Val, hvilket forstyrrer substratbindingen ved at reducere lommens volumen, mens A221G-mutationen mindsker hydrofobiciteten og indfører fleksibilitet omkring den stive bindingslomme (fig. 3B).
Interferens med coenzym- eller substratbinding til HSD11B2. (A) Tyrosinen på position 226 danner væggen af substratbindingsstedet og giver hydrofobicitet. En mutation til N226 resulterer i tab af hydrofobisk stabling, hvilket gør det ugunstigt for substratbinding. (B) A221V-mutationen reducerer volumenet af den substratbindende lomme, mens A221G øger fleksibiliteten omkring bindingsstedet. (C) I L179R-mutationen laver den positivt ladede guanidinium-sidekæde hydrogenbindinger med størrelseskæderne af T184 og E172, hvorved fleksibiliteten omkring NAD+-bindingsstedet reduceres. (D) Hydroxy-phenylsidekæden af Y232 laver hydrogenbindinger med hydroxylgruppen af ribosesukker og sidekæden af N171. Disse hydrogenbindinger er essentielle, da mutationer til phenylalanin, serin eller cystein ikke tolereres. Mutationen til phenylalanin fjerner hydroxylgruppen og fører til tab af hydrogenbindingen, mens mutation til serin med en kortere sidekæde resulterer i øget afstand mellem OH-gruppen og NAD+, og igen forhindrer effektiv hydrogenbinding; begge mutationer resulterer i inaktivt enzym. (E) Carboxylsidekæden af asparaginsyre i G89D-mutationen forårsager alvorlige steriske sammenstød med ribosesukkerdelen af adenosin i NAD og påvirker coenzymbindingen. (F) Den mere voluminøse sidekæde i K236R-mutationen mindsker størrelsen af den coenzymbindende lomme, hvilket gør den ugunstig for optimal NAD+-binding.
Vores model viser, at den polære 17-OH-gruppe i cortisol er gemt i et hydrofobisk område omgivet af Y226, P227 og L229. Denne hydroxylgruppe er fraværende i kortikosteron, hvilket resulterer i forbedrede hydrofobiske interaktioner og ∼10 gange højere bindingsaffinitet til HSD11B2 sammenlignet med kortisol (Fig. S2A). Ud over nyrerne udtrykkes HSD11B2 også i placenta. Selv om mineralokortikoidreceptoren ikke udtrykkes i dette væv, inaktiverer HSD11B2 kortisol for at fjerne dets væksthæmmende og proapoptotiske virkninger under den embryonale udvikling. Under graviditeten kan det høje niveau af progesteron i den maternelle cirkulation binde sig til og modulere HSD11B2-aktiviteten. Dette kan udmønte sig i virkninger af eventuelle loss-of-function-mutationer, der forstyrrer progesteronbindingen, på fødselsvægten. For eksempel påvirker A221V-mutationen alvorligt bindingen af progesteron mere end kortisol på grund af de steriske sammenstød mellem Val og de fremspringende methylgrupper i progesteron (Fig. S2B). Meget interessant finder vi, at de to patienter med A221V-mutationer var små i forhold til gestationsalderen (Tabel S1). Ligeledes påvirker A221G-mutationen indirekte progesteronbindingen ved at ændre strukturen af bindingsstedet. På samme måde er Y226N-mutationen mere skadelig for progesteronbindingen, da den reducerer de hydrofobiske interaktioner mellem progesteronskelettet og hydroxyphenylringen af tyrosin (Fig. S2B). I modsætning hertil giver P227 indirekte strukturel støtte til bindingsstedet, og mutation til Leu har lignende virkninger for både kortisol og progesteron (Fig. S2B).
Der er fire mutationer, der befinder sig i og forstyrrer coenzymbindingsstedet og dermed alvorligt forringer HSD11B2-aktiviteten. Sidekæden af rest L179 er normalt placeret rumligt i en kort drejning mellem β4-arket og α4-helixen (fig. 3C). Ved at tillade interaktioner med de hydrofobiske sidekæder af V174 og L282 gør disse interaktioner det coenzymbindende sted mere fleksibelt. Mutation til Arg introducerer en guanidinium-sidekæde, som tillader interaktioner med carboxylgruppens sidekæde af E172 og hydroxylgruppens sidekæde af T184 (Fig. 3C), hvorved der indføres stivhed i vendingen og mindskes den fleksibilitet, der er nødvendig for optimal enzymfunktion (7). Y232, der er placeret i coenzymbindingslommen, er en meget konserveret rest i Rossmann-foldemotivet (20), hvilket tyder på, at dets mutation vil være skadelig for enzymaktiviteten (21). Hydroxyl-phenyl-sidekæden af Y232 danner vigtige hydrogenbindinger med N171 og NAD+ og holder koenzymet i den korrekte position for dets katalytiske funktion (Fig. 3D). Denne interaktion er forstyrret i Y232C-mutationen, der forårsager alvorlig AME. Betydningen af denne rest for enzymaktiviteten er blevet uafhængigt bekræftet af flere manipulerede mutationer (21) (Fig. 3D). I G89D-mutationen udviser Asp’s carboxylsidekæde alvorlige steriske sammenstød med ribosesukkerdelen af adenosin, hvilket påvirker bindingen af NAD+ (fig. 3E). En anden manipuleret mutation K236R fører til afbrydelse af NAD-binding (fig. 3F). Selv om mutationen bevarer evnen til at interagere med NAD+ gennem hydrogenbinding, ophæver den enzymaktiviteten (21).
Forringelser i den strukturelle stabilitet af HSD11B2 forstyrrer dens tertiære struktur, hvilket forårsager en markant dæmpning af enzymaktiviteten og alvorlig AME. Rest L250 er placeret i α5-helixen, og dens sidekæder sidder i en tæt hydrofob lomme omgivet af sidekæderne af L204, F246, W253, V255 og V257 (fig. 4A). De hydrofobiske lommerester er låst af et ionparinteraktion mellem R208 og E249. Introduktion af en Pro-sidekæde bryder α5-helixen ved at indføre stivhed. Denne lomme er også for stram til at rumme den store, voluminøse guanidinium-sidekæde af Arg (Fig. 4A). Et efterfølgende tab af hydrofobicitet i dette område påvirker den strukturelle stabilitet. En anden stabil intrahelikal ionparinteraktion dannes mellem D144 og R147 (fig. 4B). Denne interaktion gør det muligt for α3-helixen at pakke tæt sammen med de tilstødende β-blade i nærheden af NAD+-bindingsstedet. D144V-mutationen resulterer i tab af denne interaktion og destabiliserer pakningsarrangementet (Fig. 4B). Den hydrofobiske pakning er også forstyrret i F185S-mutationen, når den aromatiske sidekæde af phenylalanin, der er omgivet af hydrofobiske rester af V182, C188 og M189, erstattes med en polær sidekæde af serin (Fig. 4C). På samme måde er den hydrofobiske sidekæde af L363, der er omgivet af M347, I350 og F362, placeret i en helix-turn-helix (fig. 4D). L363P-mutationen forstyrrer helixen og det lokale strukturelle miljø.
Mutationer, der påvirker HSD11B2-stabiliteten. (A) L250 er placeret på α5-helixen, og sidekæden er omgivet i en indsnævret hydrofob lomme. En mutation til bulky arginin eller prolin, der introducerer helixforvridning, tolereres ikke. (B) D144V-mutationen resulterer i tab af D144-R147-ionparinteraktionen og destabiliserer α3-helixpakningsarrangementet nær NAD-bindingsstedet. (C) Den polære sidekæde i F185S-mutationen forstyrrer den hydrofobiske pakning, der er dannet af V182, C188 og M189. (D) Den hydrofobiske L363-residual er placeret i en helix-turn-helix, omgivet af M347, I350 og F362. Mutation til prolin ødelægger helixen og det lokale strukturelle miljø. (E) I mutanten A328V viser valins sidekæde steriske sammenstød i den hydrofobiske lomme. (F) Hydroxylgruppens sidekæde af S180 skaber interaktioner med backbone-atomerne og sidekæden af T184. En phenylalanin-sidekæde ophæver disse interaktioner og giver løkken fleksibilitet. (G) R208-E249-ionpar-interaktionerne holder α4- og α5-helixerne sammen. R208H/C-mutanter er ude af stand til at danne denne interaktion. (H) Carboxylsidekæden af D223 laver hydrogenbindinger med sidekæderne af Q261 og R337. Mutation til Asn afbryder hydrogenbindingen med R337. (I) R213C-mutationen resulterer i tab af hydrogenbindingsinteraktioner dannet mellem argininsidekæden og rygsøjleatomerne i A331 og L329. (J) R337 danner et ionparinteraktion med D223 og også en hydrogenbinding med Y339. Mens lysinsidekæden bevarer en nedsat evne til at danne hydrogenbinding med Y339, ophæver en mutation til histidin, cystein eller alanin helt ionparinteraktionen R337-D223 ionparinteraktion. (K) Hydroxyphenylsidekæden af Y338 danner hydrogenbinding med backbone-atomerne i D327 og A328. Disse interaktioner opretholder de rumlige positioner af α7 og β7. En mutation til histidin eller phenylalanin resulterer i tab af disse interaktioner og introducerer fleksibilitet.
Dertil kommer, at flere mutationer kan forstyrre pakningen af HSD11B2-proteinet for at forringe stabiliteten gennem introduktion af en mere voluminøs rest. Rest A328 danner hydrofobisk interaktion med V215, I260, I325 og Y338 (fig. 4E). Ved at erstatte alaninen med en mere voluminøs Val-rest forårsager A328V-mutationen steriske sammenstød med sidekæden af I260 og Y338 fra de omgivende β-blade (Fig. 4E). Rest S180 er placeret på en løkke, og dens hydroxylgruppesidekæde interagerer med sidekæden og rygsøjlens nitrogen af T184 (Fig. 4F). Denne sidekæde ligger inden for et meget snævert rum og begrænser modtagelsen af enhver mere voluminøs rest, hvilket faktisk forårsager steriske sammenstød uden at ændre proteinstrukturen. Således tolereres en Phe-sidekæde med en voluminøs aromatisk ring, som i S180F-mutationen, ikke på denne position (Fig. 4F).
Multiple hydrogenbindinger og saltbroer mellem polære rester stabiliserer den tertiære struktur af HSD11B2-enzymet. Visse mutationer forårsager et tab af disse interaktioner, hvilket resulterer i inaktivt enzym og alvorlig AME. For eksempel er saltbroen mellem R208 og E249 kritisk (Fig. 4G). Tabet af den, som det er tilfældet med R208C- og R208H-mutationerne, destabiliserer proteinet og resulterer i alvorlig sygdom (Fig. 4G). På samme måde danner D223 en saltbro med R337 (fig. 4H). Ved at erstatte denne saltbro med en mindre stærk binding, en hydrogenbinding, ændrer D223N-mutationen den negativt ladede rest til en uladet polær rest, hvilket resulterer i en markant dæmpning af in vitro-aktiviteten (22). Dette tyder også på, at saltbroen spiller en afgørende rolle for at opretholde HSD11B2’s stabilitet og aktivitet. Sidekæderne af R213 danner hydrogenbindinger med backbone-atomerne i resterne A331 og L329 (Fig. 4I). Ved at mindske disse hydrogenbindinger, som hjælper med at opretholde proteinets tertiære struktur, forringer R213C-mutationen enzymstabiliteten (Fig. 4I).
Den Arg/Tyr-klynge fra resterne 335-339 er tidligere blevet impliceret i opretholdelse af proteinets stabilitet, selv om den præcise mekanisme er forblevet uklar (23). Mutationer, der involverer disse rester, er blevet rapporteret hos AME-patienter, herunder R337C og Y338H. Simuleringer af de monomere og dimeriske HSD11B2-modeller tyder på, at rest R337 danner en saltbrointeraktion med D223 og hydrogenbindinger med OH-gruppen af Y339 (fig. 4J). Deres interaktioner synes at være vigtige for at opretholde korrekt foldning og stabilitet af proteinet. Således ophæver dets mutation til Cys både saltbroen og hydrogenbindingen for at destabilisere enzymet og forårsage alvorlig AME. Genetisk manipulerede mutationer af denne rest viser endvidere, at R337K, som opretholder polaritet og positiv ladning, reducerer enzymaktiviteten med 70 %, mens R337A, som ligner R337C ved at have uladede og korte sidekæder, inaktiverer HSD11B2 fuldstændigt (23) (Fig. 4J). I den samme Arg/Tyr-klynge inaktiverer mutation af Y338 til His enzymet for at forårsage alvorlig AME. Vores model tyder på, at denne Tyr-rest danner hydrofobiske interaktioner med A328 og hydrogenbindinger med D327 (Fig. 4K). Begge interaktioner er med til at opretholde proteinets stabilitet, således at udskiftning af Tyr med His f.eks. inaktiverer HSD11B2. Dette skyldes, at selv om Y338H bevarer hydrogenbindingsevnen, har det kortere sidekæder, der destabiliserer enzymet. På samme måde tolereres udskiftning af Tyr med Phe i et konstrueret Y338F-konstrukt ikke. Her bevares de hydrofobiske interaktioner, men hydrogenbindingen er ophævet (23). Endelig er R337 og Y338 i Arg/Tyr-klyngen også stærkt konserveret på tværs af mange arter; det er derfor usandsynligt, at ændringer af disse rester tolereres (23).
Der rapporteres om flere mutationer, der forårsager en mildere form af AME med mindre alvorlige kliniske og biokemiske manifestationer. De relevante muterede konstruktioner blev vist at have opretholdt HSD11B2-aktivitet in vitro (4, 19, 24), hvilket er i overensstemmelse med den mindre alvorlige kliniske fænotype. Strukturelt set kan disse mutationer enten indirekte forstyrre substratbindingen (såsom P227L-mutationen hos en af vores patient) eller ændre proteinstrukturen (såsom R279C- og R359W-mutationerne) for at dæmpe, men ikke ophæve enzymaktiviteten (Fig. 5). Det er bemærkelsesværdigt, at mens P227-resten ikke ligger i en position, der interagerer direkte med substratet, tyder dens tilstødende placering til rest Y226 på, at den kan have en rolle i substratbinding (Fig. 5A). Faktisk danner denne rest “knækket” i loop-regionen, der opretholder konformationen af det aktive sted og også holder Y226 i den korrekte position for at interagere optimalt med substratet. Mutation af denne rest til Leu (P227L) afbryder knækket og ændrer placeringen af Y226 (Fig. 5A)
HSD11B2-mutationer, der forårsager mild AME type 2. (A) P227 danner et knæk i loopet og hjælper med at placere Y226 korrekt for at interagere optimalt med substratet. En forøgelse af fleksibiliteten af løkken i P227L-mutationen resulterer i fejljustering af Y226. (B) Hydrogenbindingen mellem R279 og N171 er en af mange, der holder β4- og β6-ark sammen. Den orienterer også sidekæden af N171 til at interagere med NAD+. Mutation til cystein resulterer i tab af disse interaktioner. (C) R359-I350 interaktioner opretholder helix-turn-helixen. R359W-mutationen indfører fleksibilitet i området.
To ikke-konserverende mutationer, der menes at forstyrre den tertiære struktur af HSD11B2, er blevet identificeret hos patienter med AME type 2. R279 danner en hydrogenbinding med N171’s rygsøjle, hvilket bidrager til at opretholde og stabilisere det lokale proteinmiljø (Fig. 5B). Udskiftning af R279 med en rest, der ikke danner en hydrogenbinding, som i R279C-mutationen, fører til en mild dæmpning, men ikke total eliminering af HSD11B2-aktivitet (24), hvilket er i overensstemmelse med en mild klinisk fænotype (Fig. 5B). En anden ikke-konserverende mutation, R359W, ændrer sidekædens egenskaber fra ladet til hydrofobisk. Dette ændrer den lokale interaktion inden for proteinstrukturen, hvor den positivt ladede sidekæde af R359 danner en hydrogenbinding med backbone carbonyl oxygen af I350 (Fig. 5C). Et tab af denne interaktion bidrager til den øgede strukturelle fleksibilitet, hvilket medfører en dæmpning af enzymaktiviteten. Det er bemærkelsesværdigt, at både R279C og R359W forårsager minimal forstyrrelse af de intramolekylære interaktioner og forekommer nær overfladen af proteinet.