The cryptochromes

Circadian Biological Clockは、約24時間ごとに周期を変え、光やその他の環境信号への曝露によってリセット（調律）できる生化学的な振動子である。 動物では、生物全体の概日行動を制御する脳の中央発振器と、いくつかの組織の末梢発振器がある。 この振動は、タイムレス（Tim）、ピリオド（Per）、クロック（Clk）、Bmal1などの時計転写因子とクリプトクロムが関与する転写フィードバックループから生じるものである。 クリプトクロムは、すべての生物の器官や組織に遍在して発現しており、一般に遺伝子発現を制御する核タンパク質である。 動物クリプトクロムは、ショウジョウバエのクリプトクロムCry、マウスのクリプトクロムCry1およびCry2が最もよく研究されており、シロイヌナズナのクリプトクロムCRY1およびCRY2もまた広く研究されてきた。 CryはTimというタンパク質と直接相互作用し、時計の負のフィードバックループを抑制することで概日時計を制御している（図3a）。 光はCry-Tim相互作用を刺激し、Timのユビキチン化とプロテオソーム依存性分解を促進し、Per-Timヘテロ2量体の形成を抑制する。 こうして、Per-TimヘテロダイマーによるClockタンパク質とCycleタンパク質のヘテロダイマーの阻害が解除され、概日振動の位相がリセットされる（図3a）。 しかし、ショウジョウバエの概日時計を巻き込む光受容体はクリプトクロムだけではないらしい。 Cryの機能を失ったcrybmutantハエの行動リズムは、それにもかかわらず、視覚色素による信号伝達がなくならない限り、光に応答して拘束されるのである 。 ショウジョウバエの中心振動子の同調のための光受容体としての役割に加えて、Cryは末梢の概日振動子の機能において光に依存しない役割を担っている。

哺乳類クリプトクロム

ショウジョウバエのCryの二つの機能-視覚色素とともに概日時計を同調させる光受容体としての機能と概日振動子タンパク質複合体の必須構成要素としての機能は、哺乳類のクリプトクロムの特徴でもある。 哺乳類クリプトクロムは、主に核タンパク質であるが、細胞質にも存在する。 哺乳類クリプトクロムは、ショウジョウバエのCryと同様に、概日時計の制御において光依存的および光非依存的な機能を担っている。 いくつかの観察により、哺乳類Cryタンパク質の光依存的な役割が証明されている。 Cry遺伝子の一方または両方を欠損したノックアウトマウスは、光に反応してperやプロトン遺伝子c-fosなどの遺伝子の発現を誘導する能力が低下または消失している 。 さらに、Cry1とCry2の両方を欠損した変異マウスの瞳孔は光に対する反射反応が低下している。

一方、Cry1 cry2二重変異マウスは明暗循環条件では一見正常なリズム性を示すが、フリーラン（常に暗い）条件では瞬間的に完全にリズム性を失う。 これらのことから、Cryタンパク質は哺乳類の中枢性概日振動子において、光に依存しない必須の機能を果たしており、時計の光制御を行う光受容体はクリプトクロムだけではないことが明らかになった。 クリプトクロムはマウス中枢振動子の不可欠な部分であるため、時計の光同調におけるその役割を直接検証することはほとんど不可能である。 しかしながら、ショウジョウバエの場合とやや類似して、マウスのクライ突然変異体は、視覚色素の機能も同時に破壊されない限り、光入力を媒介する能力を保持することが分かっている。 両クリプトクロムの変異と網膜変性変異を持つトリプルミュータントマウスは、明暗サイクル条件下でほぼ不整脈を起こす 。 これらの結果は、哺乳類のCryタンパク質は確かに光による概日時計の制御に関与しているが、概日時計の光同調におけるその役割は、他の光受容体によって重複して担われていることを示すものである。 哺乳類の概日振動子の同調にクリプトクロムと一緒に働く追加の光受容体は、視覚の桿状錐体オプシンおよび関連タンパク質のメラノプシンであることは、今や明らかなようだ。

ショウジョウバエのクリプトクロムと同様に、哺乳類のクリプトクロムはプロモータ結合転写制御因子である Per、Clkおよび Bmal1などの時計タンパク質と物理的に相互作用する（図3b）。 ショウジョウバエのCryとは対照的に、哺乳類のCryタンパク質は、概日時計のネガティブフィードバックループの構成要素である（図3b）。 クリプトクロムと他の時計構成要素との物理的相互作用は、それらの活性、相互作用、分解、核内輸送に影響を与え、結果として時計遺伝子の転写調節を変化させる 。 しかし、クリプトクロムとPer、Clk、Bmal1などの他の時計タンパク質との相互作用は光の影響を受けないようであり、このような相互作用はショウジョウバエのように概日時計の光阻害のメカニズムではない可能性が示唆された。

Arabidopsiscryptochromes

Arabidopsis CRY1とCRY2は主に核タンパク質で、光に応答して遺伝子発現の調節と概日時計の同調を媒介する． CRY1とCRY2は植物の光形態形成に大きな役割を果たし、例えば青色光による茎の伸長の抑制、青色光による葉の伸長の刺激、日長による開花の調節などを行っている。 クリプトクロムは、光に応答した遺伝子発現の変化を通じて、植物の発生変化を制御していると考えられる。 CRY1とCRY2を合わせて、シロイヌナズナゲノムの最大10-20%の遺伝子発現を青色光依存的に変化させる。

クリプトクロムが光に応答した核遺伝子発現変化に影響を与えるメカニズムには、少なくとも2つのものがある。 まず、クリプトクロム分子が転写機構に関連するタンパク質と相互作用して、転写に直接影響を与える可能性がある。 シロイヌナズナのCRY2はDNA配列に依存せずにクロマチンに結合するが（M. Maymon and C.L., unpublished observations）、配列に依存しないクロマチン相互作用タンパク質がどのように遺伝子発現を制御するのかは不明であった。 動物のクリプトクロムは、プロモーター結合型転写調節因子との物理的相互作用を介して転写を調節することが示されているが、植物のクリプトクロムではそのような相互作用は報告されていない。 植物クリプトクロムは、他の細胞機能を担うタンパク質と相互作用し、転写調節因子の安定性、修飾、細胞内輸送を調節しているのではないかという説がある。 例えば、植物クリプトクロムはE3ユビキチンリガーゼであるCOP1と相互作用することが分かっており、植物クリプトクロムは動物クリプトクロムではまだ発見されていない方法で作用している可能性が示唆されている 。 この見解と一致して、シロイヌナズナのクリプトクロムは、重要な花成制御因子であるCONSTANSのプロテアソーム依存性分解を青色光で抑制することも最近明らかにされた …

メカニズム

クリプトクロムの触媒機構は完全には解明されていないが、FADが主触媒のCPDフォトリアーゼのメカニズムにいくつかの手がかりがある。 DNAの修復反応において、CPDフォトリアーゼはDNAのピリミジン二量体に結合し、DNA二重鎖内から酵素のFADアクセスキャビティに「反転」させて、安定な複合体を形成する。 もう一方の発色団（プテリンまたはデアザフラビン）は「アンテナ」発色団とも呼ばれ、青色光またはUV-A光を吸収し、その励起エネルギーをFADのフラビンに伝達する。 励起状態のフラビンは、ピリミジン二量体に電子を供与し、シクロブタン環を分割する。 この過程で電子は再びフラビンに移動し、基底状態のフラビンが再生される。 修復されたジヌクレオチドは、もはやFADアクセスキャビティに収まらないので、フォトリアーゼから解離する。 クリプトクロムの機能におけるFADとFADアクセスキャビティの正確な役割はまだ不明であるが、電子伝達反応にも関与している可能性が考えられる

染色体を含むPHR領域はタンパク質の中で最も保存されているが、カルボキシ末端ドメインは動物および植物のクリプトクロムの機能または制御に関与していることが示されている。 シロイヌナズナのクリプトクロムのカルボキシ末端ドメインをマーカー酵素であるb-グルクロニダーゼと融合して発現させると、PHR領域がない暗所でも光に対して構成的な成長反応を与える . 一方、ショウジョウバエやゼノプスのクリプトクロムのPHR領域は、カルボキシ末端ドメインがなくても生理的に活性である。 Drosophila Cryのカルボキシ末端ドメインはタンパク質の安定性、Timとの相互作用、光受容体の概日光信号に対する感受性に重要であり、Xenopus Cryのカルボキシ末端ドメインはその核局在に必要である。

クリプトクロムはリン酸化により制御されている。 シロイヌナズナのクリプトクロムは青色光に応答してリン酸化され、これが光受容体の機能と制御に関連することが示された 。 さらに、シロイヌナズナのCRY1を昆虫細胞で発現させると、ATP依存的および青色光依存的に自己リン酸化を受けることがわかった . 動物のクリプトクロムもATPに結合するかどうかは不明であるが、マウスのクリプトクロムがリン酸化されることが示されている 。

シロイヌナズナCRY1のPHR領域とATPの相互作用には、ピリミジン二量体とフォトリアーゼの相互作用を思わせるいくつかの興味深い特徴がある：ATPのリン酸基は溶媒にさらされ、アデニンおよびリボース部位はFADアクセスキャビの奥に埋まり、ATPは水を介してFADと接触できる . シロイヌナズナCRY1 pHR領域とATPの相互作用には、タンパク質とリン酸の相互作用、タンパク質とMg2+の接触、リン酸転移のためのセリン残基の近傍など、タンパク質-ATP相互作用によく見られるいくつかの特徴がないこともわかった。 しかし、CRY1のPHR領域の構造を調べると、これらの特徴はすべてクリプトクロムのカルボキシ末端ドメインで提供される可能性があることがわかった（図4）。 β-グルクロニダーゼと融合したシロイヌナズナのクリプトクロムのセリンリッチなカルボキシ末端ドメインは、in vivoで構成的にリン酸化されるという観察から（図4a）、FADアクセスキャビティに結合したATPから近くのカルボキシ末端ドメインにリン酸化が起こる可能性が示唆される（図4b）。 また、光励起されたFADがヌクレオチドへの電子移動の引き金となり、ATPからカルボキシ末端ドメインのセリン残基へのリン酸基転移が起こることも考えられている。 PHR領域の表面は、特にカルボキシ末端ドメインが相互作用しやすい場所では、主に負に帯電しているので、リン酸化されたカルボキシ末端ドメインはPHR領域表面からはじき出され、クリプトクロムのコンフォメーションが変化することになると思われる。 この構造変化によって、他のシグナル伝達タンパク質と相互作用し、光シグナルを伝播させることができるようになる（図4a）。 あるいは、FADアクセスキャビティに結合するクリプトクロムの別の分子が、生産的なATP-クリプトクロム相互作用に必要な欠落した機能を提供することも考えられる。 実際、CRY2-CRY2相互作用とCRY1-CRY2相互作用の両方がシロイヌナズナで検出できる（D. Shalitin, X. Yu, and C.L., unpublished observations）。 クリプトクロムのホモオリゴマーまたはヘテロオリゴマーのいずれかを形成することで、分子間リン酸転移の機構が得られ、クリプトクロムの構造を変化させることができると考えられる（図4b, c）。