放射線、化学療法薬、分子標的薬を含む細胞障害刺激によるクローン形成の成長とその阻害をin vitroで定量化するために多くの研究においてclonogenic assayが使用されてきた。 生存率を決定する現在の標準的な手順は、処理した細胞培養におけるクローン原性増殖が、細胞株固有の定数PEで除算することにより、未処理の対照に対して正規化できるという仮定に基づいている
しかし、ここではこれが普遍的に適用できないことを示す。 一方、我々のデータは、培養皿に播種した細胞数と得られたコロニー数との相関が、常に直線的であるとは言い難いことを明確に示している。 協力的な振る舞いをする細胞株では、PEを用いたクローン形成生存データの解析により、アッセイ固有の大きな誤差から莫大な誤差を含む結果が得られた。 適度なコロニー数（C = 5から100）の培養皿だけを分析に使ったとしても、細胞の協力性が高い細胞株では、ある投与量でのクローン形成生存率に1桁をはるかに超える差があった。 注目すべきは、与えられたデータセットから計算されたこの範囲の結果から、事実上あらゆる生存曲線（急峻または平坦、中程度または強く湾曲、線形、二次、または不規則）を導き出すことができることで、この観察は放射線生物学者にとって特に重要であろう。 特に、1つまたはいくつかの似たような細胞密度しかプレーティングされない場合、結果は大きく歪むことになります。 このようなやり方は、選択した細胞密度の直接的な結果であるアッセイ固有の誤差を生じさせ、したがって統計的な誤差分析に適さない。 協力的に増殖する細胞株について、我々の観察は、報告された治療効果データのアッセイ間、研究者間、および研究室間の不一致を部分的に説明するかもしれない。 A549のコロニー形成アッセイデータのメタアナリシスも、この仮説を支持している。 156の異なる研究のパネルの中で、Nuryadiらはこの特定の細胞株のSF4値を5から90％の範囲で報告し、SF4の四分位範囲は25％以上であった。 他の様々なパラメータが治療効果データに影響を与えることは確かであるが、我々はこのデータから、細胞間の協力が研究間のばらつきを説明する主要な要因であると結論づけた。 クローン原性生存率のわずかな差でさえも、研究者に新しい科学的仮説の立案と研究を促す可能性があり、それは最終的には誤った精度に基づくかもしれない。 この方法は、播種した細胞数とコロニー数の間の非線形関係を考慮し、すべての処理条件において幅広い細胞数を播種した培養皿をスコアリングすることによって得られた。 PEベースの計算に使用したのと全く同じデータセットを適用したところ、明らかに安定した、細胞密度に依存しない結果が得られた。 注意深い読者は、ここで紹介した方法で行った生存率の計算が、べき乗回帰で抽出された係数aと指数bだけに依存していることに気づいたかもしれない。 これは明らかに細胞間の協力の効果を補償するものであるが、回帰の不正確さに由来する別の質の誤差を伴い、PEベースの生存率計算における同様の質の誤差と定量的に比較することは不可能である。 従って、この誤差は、十分な数の独立した複製を用いた慎重な実験デザインを保証することによって最小化する必要がある。 さらに、生存率計算は、回帰係数Rで示されるような適切な性能のパワー回帰の結果を用いてのみ実行されるべきである。 播種細胞数と計数されたコロニー数との相関が線形（b≒1）であるか否かを示すものである。 BT20細胞やSKLU1細胞で得られたような高いb値は、細胞あたりの培養液量が増加した場合（大きなアッセイ容量の使用または播種細胞数の減少のいずれか）、in vitroでの細胞増殖が減速する（または完全に阻害される）ことを意味する。 b値は決して特定の細胞株に特異的なものではなく、むしろ選択した細胞培養液、いくつかのアッセイ培養パラメーター、および培地処方、栄養素や成長因子の補充、細胞分離に用いる方法、プラスチック器具など、単一細胞としてプレーティングしたときに極度のストレス状況にある細胞のクローン増殖に影響を与える可能性のあるあらゆる側面を含む実験手順の結果であることが強調されてよいだろう。 例えば、コンフルエントに近いBT20細胞の調整培地を使用すると、BT20単細胞の協同性挙動が強く減衰したが、この手順は非協同的に増殖するMDA-MB231細胞のクローン形成には影響を与えなかった。 さらに、協力的なBT20細胞の倍加時間は、アッセイのインキュベーション時間とウェル内の細胞密度の両方に依存しており、PEベースの計算で得られた不正確なクローン形成生存率に対する自明な生物学的説明を与えるものであった。 増殖中の細胞群の成長速度が遅すぎて、アッセイのインキュベーション時間内にコロニーあたり50個の閾値に到達しない可能性がある。 したがって、例えば35個のゆっくり増殖する細胞からなるクラスターが停止した時点で「非クローン性」に見えるのは、少なくともある程度は任意に選択されたアッセイインキュベーション時間の必然的な結果に過ぎないのである。 この文脈で、我々はさらに、得られたクローン形成生存率に対する培養時間の影響を分析し、他の人が示唆するように、コントロールディッシュの検査だけで停止時点を決定するのは不十分であることを観察した：培養期間の早すぎる終了は、細胞増殖継続前のダメージ修復にさらに時間を必要とする、より積極的な処理を行ったプレートでは、生存率が極めて低くなることがある。
重要なことは、我々のデータは1940年代と1950年代の先駆的な細胞培養研究者の重要な発見と完全に一致しており、当時広く研究されていた現象を単に反映しているということである。 Puckらは、1956年に照射した単一細胞の生存曲線を初めて発表している。 しかし、この基本的な成果に対する最大の科学的挑戦は、当時未解決であった哺乳類細胞培養の問題であった。 細胞株は、低密度に植え付けるとすぐに試験管内で増殖しなくなるのである。 この問題を克服する試みは、1948年にSanfordらによってなされた。彼らは、細胞由来の因子の培地への拡散が強く抑制された小毛細管内で、単細胞由来の線維芽細胞のコロニーを培養することに成功し、十分なオートクライン増殖刺激を可能にしたのである。 彼らは、培養細胞による培養液のプレコンディショニングの重要性を確認し、高密度細胞培養の無限増殖を可能にするのに十分な細胞培養液は、実際には「単一細胞の増殖には最適とは程遠い」と結論づけた。 これに伴い、Earleらは、それぞれの細胞種を非常に低い密度でプレーティングすると細胞死を引き起こすことを説明し、この研究は、1955年にPuckとMarcusが試験管内で哺乳類細胞のクローン形成増殖について初めて発表する際の基礎となった . 彼らは、単細胞の増殖を促進するための条件付き培養液の必要性に触発され、HeLa単細胞と、同じ種類の高照射フィーダー細胞の層との共培養系を使用したのである。 彼らは、先行研究との一致から、大容量アッセイ系での単細胞増殖の阻害は、「短寿命で拡散性の因子の消失」によるものであると結論付けた. 照射された哺乳類細胞の最初の生存曲線が掲載されたものなど、その後の出版物では、Puckたちは、フィーダー細胞による成長因子の補充なしに100％PEで単細胞成長を可能にする高度な培養技術を開発したため、頻繁にフィーダー層の使用を省略した . 彼らは、慎重な洗浄とトリプシン化のプロトコルが不可欠であると述べ、培養皿の中の細胞は、遺伝子型だけでなく、生理学的状態に関しても異なる可能性があることを表す「協調作用」という言葉を作りました . 今回の発見は、これらの観察結果を再現するものである。 50のがん細胞株パネルにおいて、FCSを添加した最新の標準化された培地では、半数以上の細胞株が協調的な増殖挙動を示すことから推測されるように、単一細胞の最適でない増殖は依然として非常によくある現象であることが観察された。 従って、もしある細胞株に最適でないPEが見つかった場合、クローン形成アッセイは、目的の処理の影響と細胞の協力性の影響の両方を同時に検出する可能性がある。 分析した細胞株の PE に影響を与える可能性のある特定の成長支持因子を特定することは、この研究の範囲外であった。 例えば、低濃度の古典的な成長因子やホルモン（例えば、上皮成長因子やエストロゲン）、さらには様々な低分子や高分子の代謝物など、少なくとも一部の細胞はオーソトロフィーを示すようなパラメータによって、ある細胞株の単細胞にとって最適でない成長条件が引き起こされると仮定している。 さらに、培養皿内の単細胞への栄養補給は、周囲の培地やプラスチック器具の物理化学的パラメータ（それぞれの補助栄養因子のタンパク質結合の程度やプラスチック表面への吸着など）に影響されると思われます。 理論的には、この問題は、SとCの間に直線的な相関関係（b = 1）が（再）確立されるように、低密度状態での最大PEを回復させる措置をとることによって対処することが可能である。 Puckが推奨するフィーダー細胞、コンディショニングされた培地、および／またはソフトアガーへの単一細胞の埋め込みは、特定の細胞株でこれを達成するのに十分であり、それに応じてPEベースの計算の頑健性を向上させるはずである。 しかしながら、アッセイ条件を改良し標準化することで、全ての単一細胞の生存率や増殖率が最適になるようにすることは、非常に困難であることは明らかである。 私たちは、単細胞増殖のための最適でないアッセイ条件を受け入れることにし、その代わりに、このよく説明された現象を考慮したクローン発生生存データ解析のための計算法を開発することにしました。 明らかに、べき乗回帰と補間を用いた我々のアプローチは、生存データを目で見てフィッティングしていた1950年代の技術能力を超えていた。 しかし、その後数十年の間に、なぜか細胞間協力の重要性がクローズアップされなくなった。 コロニー形成アッセイにおける非線形性に関するいくつかの報告はあったものの、PEを用いた解析の性能の限界については触れられませんでした。 これと同様に、我々のパネルのいくつかの細胞株では、b値が1.0よりわずかに低い値も得られた。 この観察には3つの異なるシナリオが考えられ、そのうちの2つは方法論的アーチファクトによるものである。 まず、1.0よりわずかに低いb値は、小さなコロニーが研究者によって見落とされ、成長しすぎたコロニーが多数存在するウェルをカウントした結果であると考えられる（図1aの「nd」マークのついたウェルを参照のこと）。 次に、細胞数の多いディッシュでは、栄養塩濃度の急激な低下により、早い段階で細胞の成長が阻害され、その結果、コロニーが頓挫することがある。 第三に、生物学的にはあまり直感的ではないが、例えば増殖抑制因子の分泌による細胞増殖の競争的な挙動が考えられる。 重要なことは、これらの現象はいずれも回帰と補間のアプローチによって説明されるということであり、b値によって反映される直線性からの逸脱を考慮するからである。 これらのケースの大部分において、照射した細胞のb値は未処理対照のそれぞれのb値よりも高い傾向があり、照射によって細胞の協力性が高まることが示されている。 その結果、C=5〜100のコロニーで得られる生存率の値の範囲は、b値がほぼ同一の場合（細胞株HCC1806およびA549参照）よりも広くなっている。 このことは、クローン形成アッセイでは、一定のコロニー数（C）を選んで解析しない限り、より正確な生存率値を抽出することは技術的に不可能であることを示唆している。 さらに、処理された細胞のb値が非常に高い細胞株は、治療抵抗性の研究に関して特に重要であると考えられる。 例えば、ある種の細胞から分泌される放射線誘発性生存因子は、それに応じて高いb値を示すため同定されるかもしれない。 このことはクローン形成アッセイの信頼性とそれに基づく仮説の弾力性を大きく向上させる可能性がある
。