7 RAG Binding Genomewide
RAG1の直接DNA結合特性と、抗原受容体遺伝子に特有の豊富なRSSがあることから、V（D）J組み換えの部位特異性は単にRAG1の好ましいDNA基質に優先的に動員されて施行されていると考えてよいことが分かった。 RAG2はPHDを持ち、固有の触媒活性を持たないため、その局在パターンには機能的な制約がないはずである。 したがって、RAG2はリンパ球のゲノム全体に広く結合し、H3K4me3に富む活性型TSSの大部分（〜60％）を占める（Ji et al.） しかし、RAG1もまた、RAG2とH3K4me3が共存する数千の部位（マウス胸腺細胞およびプレB細胞では約3500）に局在し、高活性で系統特異的なプロモーターおよびエンハンサーのかなりの部分を包含している（Teng et al.、2015）。 この広範囲な局在は、RAG1の触媒変異体（D708A）でも観察され、RAG1の広範囲な結合は切断後の蓄積を反映していないことが示された（Teng et al.、2015）。 抗原受容体遺伝子以外のRAG1結合部位は、RSS様モチーフ（cryptic RSS、またはcRSS）の存在と明確な相関を示さず、配列特異的な接触やRAGによる切断活性では、ゲノム全体のRAG1結合パターンを説明できないことがさらに示された。 その代わりに、クロマチンアクセスのマーカーがRAG1結合の最良の予測因子であることがわかった。 H3K4me3、H3K27Ac、上昇したGCコンテンツ、および上昇したCpGコンテンツ（Tengら、2015）。
実際、RAG1と特定のDNAモチーフの両方と相互作用するトランスファクターを通じて抗原受容体遺伝子に特異的にRAG1を勧誘することを示す例はごくわずかである。 いずれの場合も、RSSそのものではなく、RSSと偶然に重なる転写因子結合モチーフによって、リクルートメントイベントの遺伝子座特異性が決定されている。 マウスのTcrb遺伝子座は、RAG1の標的化によって、組み換えの正しい順序（Vβ-DJβの前にDβ-Jβ）を維持するのに役立つ「12/23以降」の制限に寄与している例を示している。 Dβ1およびDβ2に隣接する3′23-RSSは、AP-1転写因子のサブユニットであるc-fosの保存された結合部位を含む（Wangら、2008年）。 c-fosはその転写活性化特性とは無関係に、RAG1を3′DβRSSに優先的に動員し、したがってDβ-Jβ組換えを促進する（Wangら、2008年）。 B系統では、類似の抗原受容体遺伝子座はIgh遺伝子であり、そこでは直接的なVh-Dh組み換えはVh-DJh組み換えに比べて好まれない。 しかし、この場合、組換え順序は、D-Jh組換えに続くエピジェネティックマークの局所的なシフトによって制御されているようであり、DJ産物は生殖細胞のDh遺伝子セグメントよりも優先的にRAG1結合と組換えを行うようにマークされている（Subrahmanyam et al, 2012）。 さらに、Vh-Dhの直接組み換えは、DとVの遺伝子群の間にあるIGCR1と呼ばれる配列要素によって抑制される（Guo et al.、2011）。 IGCR1には2つの重要なCTCF部位があり、Igh遺伝子座のDJ部分とV部分を隔離するクロマチンループのアンカーポイントとして機能していると考えられている（Guo et al.） ヒトTcrd遺伝子座は、遺伝子座特異的なRAG1沈着のもう一つの例を提供する。ここでは、Runx1依存的なRAG1によるDδ2へのリクルートが、古典的なDδ-Jδ組み換えに先立つDδ2-Dδ3転位事象に有利である (Cieslak et al., 2014). この結果、Tcrd再編成において2つのD遺伝子セグメントがヒトに特異的に含まれることになる。 最後に、Pax5はRAGと相互作用し、Vh遺伝子セグメントへのRAGのリクルートを促進することが示唆されている（Zhang et al.、2006）が、このメカニズムが内在性Igh遺伝子座の組み立てを促進することはまだ示されていない。 TcrやIg遺伝子内でも、RAG1結合はRSSの境界を越え、H3K4me3に富むがRSSのないイントロン領域を占めている（Teng et al.、2015）。 しかし、RSSがRAG1結合の安定化や増強に二次的な役割を担っていないとは言えない。 TcraとIgk遺伝子は、それぞれ二重陽性の胸腺細胞とプレB細胞におけるRAG1結合のトップリクルーターであり、RAG1蓄積の明確なピークが組み換え中心におけるRSSの上にはっきりと観察される（Teng et al.、2015）。
しかし、ゲノム全体では、RSSに依存しないRAG1のリクルートが見られ、これは、NBDを含むRAG1コアの様々なドメインを介した、RAG1とDNAとの非特異的相互作用によって起こると考えられる（Tengら、2015; Yinら、2009）。 さらに、RAG1がクロマチンに間接的に動員されるのは、RAG2との相互作用を通じて起こる可能性があるが、後者はRAG1結合パターンを完全に説明できないが、強度は低下するものの、RAG2がない状態でも部分的に維持される（Teng et al. RAG2のC末端領域（PHDを含む）がない場合、RAG1は最も活性の高いTSSにホーミングするのではなく、H3K4me3の密度が低い部位に向かって拡散する（Teng et al.、2015）。 1つの可能性として、RAG2 C末端領域にある自己抑制ドメインがないことから、RAG1の追加の非特異的DNA結合活性のマスクが剥がされた結果であると考えられる（Lu et al.、2015）。 もう一つの可能性は、RAG2のPHDドメインがないため、RAG複合体はH3K4me3の高い領域に留まる性質が低いということである。 また、RAG2 C末端領域の欠失は、RAG1タンパク質レベルのアップレギュレーションを引き起こすという事実も、より広いRAG1結合パターンに関連しているかもしれない（Teng et al.、2015）。 また、コアRAG1は、完全長RAG1よりもはるかにプロミスクに結合し、興味深いことに、完全長RAG1と比較して、多くの非抗原受容体部位で結合強度の上昇を示すが、Tcra遺伝子座では強度が減少する（Teng et al.、2015年）。 これは、切断型RAG1タンパク質の本質的なDNA結合特性の変化、またはRAG1の非コア末端にコードされる活性（RINGによるヒストンのユビキチン化やC末端による自己阻害など）がないことを反映しているのかもしれない。 また、コアRAG1が全長RAG1よりもかなり高いレベルで発現していることも関係しているかもしれない。
RAGリコンビナーゼは基質、特にRSSスペーサーだけでなく、7量体と非量体の配列変異を許容する(Hesse et al, 1989; Lewis, Agard, Suh, & Czyzyk, 1997; Marculescu, Le, Simon, Jaeger, & Nadel, 2002; Ramsden, Baetz, & Wu, 1994; Zhang & Swanson, 2008)がある。 NBDによって媒介されるRAG1-ノナマー相互作用でさえ、比較的少数の配列特異的な接触に依存している（Yinら、2009）。 抗原受容体遺伝子に存在するRSSは、その配列内容が多様であり（時にはコンセンサスである7量体や非量体モチーフから大きく乖離している）、RAGによる基質認識は、レパートリーの多様性を最大にするために十分柔軟である必要がある。 抗原受容体遺伝子以外では、RAG1結合部位は特定の配列シグネチャーに対する累積的な選好性を示さない（Tengら、2015）
しかし、RAGによる柔軟な基質認識は、ゲノムの残りの部分にとって問題を生じさせる。 機能的なRSSのためのかなり最小限の配列要件（少なくとも、我々が現在理解している規則によって）により、cRSSは脊椎動物ゲノムにかなり頻繁に発生する（Lewis et al.、1997）。 このような偶然のcRSSの危険性は、リンパ腫の発生に寄与するRAG依存的な遺伝子再配列への参加によって明らかになった（Larmonie et al.、2013）。 ゲノム上のRAG1結合の大部分は、DNAまたはアクセス可能なクロマチンへの非特異的な動員によって支配されているので、RAG1結合部位の近傍で強いcRSSの利用を制限し、標的外RAG活性の可能性を最小限に抑えることは生物学的には賢明であると思われる。 実際、マウスやヒトのリンパ球のRAG1結合部位では、cRSSが優先的に枯渇しており（Teng et al.、2015）、これは抗原受容体遺伝子の外で起こる遺伝子再配列によってもたらされた選択圧によるものだと我々は提唱している。 このように、RAG1が関連するTSSのレパートリーは、V(D)J組み換えの際にRAGの活性から保護されます。 我々は、活性を維持し、まれにしか発生しない異所性再配列を媒介し続けるまれなcRSSは、宿主遺伝子座の制御配列や機能配列と重なるためにゲノムに維持されてきたか、単に選択されるほど強い負の影響を及ぼさなかったと推測している
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