Transcriptome analysis
R. Solaniの種間相互作用が明らかにされ、Rzoctonia solaniのAGE-PTとその宿主植物の相互作用に伴う腐朽性生活様式が明らかにされた。 solani AG3-PT分離株Ben3とジャガイモ培地耐性品種’Arkula’との種間相互作用をRNAシークエンスを用いてトランスクリプトームレベルで解析した。 相互作用の成立やさらなる相互作用の進行に重要な因子を見出すため、生育中のジャガイモ植物に誘引せずに培養したR. solani AG3-PT分離株Ben3の純菌糸（Ben3）、R. solaniが付着した塊茎3 dpi（初期）および8 dpi（後期）のジャガイモ芽の3種類のサンプリング方法を使用した。 R. solaniとジャガイモの新芽の相互作用の両方のサンプリング日において、すべての出現した新芽を収穫し、分析に用いた。 スプラウトの壊死性病変は8dpiで初めて目に見えるようになる。 その後、RNA抽出、RNA配列決定（RNAseq）、および分離株Ben334のゲノムへのリードのマッピングを行い、100万マップリードあたりのリード数（RPKM）値を算出した。 一般に、接種したサンプルでは、各データセットの1～23%がBen3ドラフトゲノムにマップされた。 対照試料では、これらのデータセットの70〜75%がBen3ゲノムにマップされた。
3つのサンプリングすべてにおいて、同数の遺伝子が発現していることが検出された（表1）。 R. solani AG3-PT株のBen3ゲノムの12,567遺伝子のうち、純粋な菌糸では11,206遺伝子が発現し、3 dpiと8 dpiではそれぞれ10,181と9,939遺伝子にリードをマップすることができた。
Table 1から明らかなように、マッピングしたリードの量はかなり異なっている。 これは、Ben3サンプリングではR. solani AG3-PT分離株Ben3の純粋な菌糸のトランスクリプトームが配列決定され、初期および後期サンプリング（3および8 dpi）ではデュアルRNAseqアプローチを使用して相互作用する両方の生物のトランスクリプトームに同時にアクセスしたという事実に起因するものである30。 ライブラリーサイズと各ライブラリーから生成される配列量は同等であったため、Ben3サンプリングでは、ほぼすべてのリードを分離株Ben3ゲノムにマッピングすることが可能であった。 3dpiと8dpiのサンプリングにおけるdual RNAseqアプローチでは、Ben3ゲノムにマッピングできたリードはごく一部であり、他は主にジャガイモゲノムにマッピングされた。 R. solani AG3-PT株のBen3ゲノムにマッピングされたリードの量がサンプリングごとに異なるため、以下のことを考慮する必要がある。 (1)Ben3のみRPKM値が低い遺伝子は、必ずしも菌が植物に挑戦したときに発現しないとは限らず、単にライブラリサイズに起因する可能性がある。(2)3サンプリング全てで発現が認められた遺伝子は、共通して発現すると考えられる。(3)3および8 dpiサンプリングのかなり小さなライブラリでのみ発現が認められた遺伝子は、相互作用特異性があると想定される。
要約したマッピング結果（表1）から、3つのサンプリングで共通して発現している遺伝子が多数存在するはずであることが既に示されている。 そこで、3つのサンプリングを比較し、共通する遺伝子数と個々のサンプリングを区別する遺伝子数の計算値を可視化するためにベン図を作成した（図1）。 その結果、3つのサンプリング全てで9,000以上の遺伝子が発現しており、そのうち871は植物と接触していない菌糸体でのみ転写されていることがわかった。 3dpiと8dpiのサンプルで共通して発現が確認された遺伝子は29個で、生きたジャガイモの植物が存在する場合にのみ発現する遺伝子を表していた。 さらに、3dpiでは27の遺伝子が排他的に発現し、8dpiでは21の遺伝子の小さなセットに対応する配列リードが排他的に検出された。 図1
3つのサンプリングにおける転写遺伝子のベン図である。 生育中のジャガイモ植物に誘引されずに培養したR. solani AG3-PT分離株Ben3の純粋菌糸（Ben3）；3dpiでジャガイモ芽と相互作用したBen3（早期）；8dpiでジャガイモ芽と相互作用したBen3（後期）
生きたジャガイモ植物の存在下でよく発現した29遺伝子から4遺伝子は植物細胞壁の分解に関わるタンパク質をコードしていることがわかった。 これは、細胞壁分解酵素を分泌して宿主細胞の壊死と栄養分の漏出を誘導する、壊食性病原体の病原性戦略に合致している21。 また、タンパク質の分解に関わるタンパク質をコードする遺伝子が1つあることも、この攻撃方針をさらに裏付けている。 さらに、DNA結合ドメインを持ち、転写制御に推定される機能を持つタンパク質をコードする2つの遺伝子もこのリストに含まれており、攻撃の転写制御に関与していると考えられる（例えば、Ben3g4553、表2参照）。 3dpiで排他的に発現する27個の遺伝子の大部分は、推定機能を割り当てることができない仮説的なタンパク質をコードするものである。 相互作用の後期（8dpi）に排他的に発現した21の遺伝子から、8つの遺伝子は植物細胞壁の分解に関与するタンパク質をコードし、2つの遺伝子はプロテアーゼをコードしていることが分かった。
まとめ：3サンプリングのトランスクリプトームデータを最初に調べたところ、明確かつ妥当な差異が明らかになったため、本研究が、R. Roverの相互作用を確立するための重要な要因を見出す可能性を示している。 R. solani AG3-PT株Ben 3とジャガイモ耐病性品種’Arkula’の種間相互作用を、3つの異なるサンプリングで最も豊富な転写産物を調べることによって評価した。 液体培養した成長菌糸では、分離株Ben3ゲノムの11,206遺伝子の転写産物が認められた。 これらの遺伝子のうち、RPKM値の中央値が100以上の転写産物は698個、RPKM値の中央値が1,000以上の転写産物は37個検出された。 塊茎新芽の病原菌との相互作用初期（3dpi）において、10,181遺伝子の転写産物が検出され、729個がRPKM値の中央値が100以上、25個がRPKM値の中央値が1,000以上であった。 R. solani AG3-PTの遺伝子は8dpiで9,939個が転写され、RPKMの中央値が100以上のものが742個、1,000以上のものが26個あった（補足表5-7）。 合計で9,679の分離株Ben3ゲノムの遺伝子が3つのサンプリングすべてで発現していることが確認され、その中には解析した個々のサンプリングのそれぞれで最も豊富な転写産物が含まれていた。 これらの最高発現遺伝子のうち5つ（Ben3g9573, Ben3g6448, Ben3g5323, Ben3g2326, Ben3g675）は、R. solani特有の機能未知の仮説的タンパク質をコードする遺伝子であった。 したがって、これらのタンパク質は植物との相互作用の際に特定の役割を果たすとは考えられず、むしろこれらのタンパク質は一般的な成長や細胞代謝に重要である可能性がある。 また、個々のサンプリングで最も豊富な転写産物の中には、レクチンドメインを含むいくつかのタンパク質（Ben3g9146、Ben3g9350、Ben3g8869）が含まれている。 このようなリシン型β-トレフォイルレクチンドメインを含むいくつかのタンパク質は、宿主植物レタス30との相互作用の際にR. solani AG1-IB分離株7/3/14で最も多く存在することも以前報告されている。 これらのレクチンドメインタンパク質の具体的な役割は不明であるが、R. solaniのレクチンは菌糸体内で貯蔵タンパク質として機能している可能性が提唱されている37。 また、Thuringiensis toxin domainを持つタンパク質をコードする2つの遺伝子（Ben3g8806, Ben3g11931）も、解析した3つの試料すべてで強く転写されていることが確認された。 Bacillus thuringiensis 毒素は、昆虫に対する殺生物活性で知られる細菌タンパク質であるが38、それ以外の様々な生物も標的としている39。 R. solaniでこのような毒素ドメインのホモログが強く発現していることから、これらの毒素は菌類植物相互作用において特定の役割を果たすというよりも、R. solani AG3-PT 分離株 Ben3にとって一般的に重要である可能性が示された。 また、セプタル・ポア・キャップ・タンパク質をコードする遺伝子（Ben3g7115）は、3つのサンプリング全てで最も豊富な転写産物の一つであり、担子菌の菌糸恒常性に寄与していることが示唆された40。 また、R. solani AG1-IB株7/3/14のレタスとの無症状区で見つかった転写産物には、隔膜孔キャップタンパク質（RSOLAG1IB_6054）に類似した転写産物が非常に多く含まれていた30。 R. solaniに特異的なこのタンパク質は、菌糸細胞の隔壁孔キャップ内の孔を閉じ、隣接する細胞間の細胞質液の輸送を阻止する栓物質の一部である。 さらに、ヘモペキシンドメインタンパク質をコードする遺伝子（Ben3g6614）も、3つのサンプリングに共通して高発現遺伝子に含まれていた。 このドメインは亜鉛依存性メタロプロテアーゼを示し、細胞外環境の恒常性制御に重要な役割を果たすことが広く認識されているが41、その生物学的機能は細胞外マトリックスの分解以外にも及ぶ可能性がある42。 これらのタンパク質はいずれもR. solani AG3-PTにおいて宿主植物との接触の有無にかかわらず高い量を示したことから、全体的な成長や代謝に重要であると考えられるが、菌と植物との相互作用には特に関連性がないようである。 solani AG3-PT とジャガイモ
R. solani AG3-PT 分離株 Ben3 とジャガイモ新芽の相互作用に関連する要素を見つけるために、ReadXplorer プラットフォーム (v2.2) に統合されている遺伝子発現差異を実施した43。 この単離Ben3の純粋な菌糸のトランスクリプトームとジャガイモの新芽との相互作用の3 dpiまたは8 dpiのトランスクリプトームの一対の比較は、DESeq2プログラムを用いて達成された。 遺伝子は、P値が0.05未満で、最小倍率が2倍以上であれば、差次的に発現していると判定した。 これらの基準を用いて、592の遺伝子が3dpiで差次的に誘導された（242の遺伝子が初期にのみ誘導され、350の遺伝子が3dpiと8dpiでも誘導された；初期up）一方、520の遺伝子が3dpiで差次的に減少した（412の遺伝子が初期のみ減少し、10の遺伝子が3dpiと8dpiでも減少した；初期down）。 8 dpi では、688 個の転写産物が差次的に誘導され（8 dpi で誘導された 338 個の遺伝子と 3 dpi で誘導された 350 個の遺伝子の合計；late up）、233 個が差次的に減少した（8 dpi と 3 dpi で減少した 125 個の遺伝子と 108 個の遺伝子の合計； late down）ことが明らかにされた。 相互作用の両時点で上昇した遺伝子と下降した遺伝子を比較・可視化するためにベン図を作成した（図2）。 図2
サンプリング間で発現量の異なる遺伝子のベン図（図2）。 生育中のジャガイモ植物に誘引されずに培養したR. solani AG3-PT分離株Ben3の純粋な菌糸（Ben3）を、3dpi（早期）でジャガイモ芽と相互作用したBen3と比較；Ben3の純粋な菌糸を8dpi（後期）でジャガイモ芽と相互作用したBen3と比較。
このDESeq2分析で見つかった発現差はqRT-PCRによる実験において有効であることが確認された。 そのため、発現パターンが一定である適切なコントロール遺伝子を確立する必要がある。 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase（Ben3g7151、GAPDH）、ユビキチン共役酵素E2（EUC63156、UBC）、ユビキチン-プロテインリガーゼE3（Ben3g494、UBI）、伸長因子2（Ben3g3364、EF-2）、βチューブリン遺伝子（Ben3g4099; TUB1) および (Ben3g5288, TUB2) をテストし、ベータチューブリン遺伝子 Ben3g5288 (TUB2) が我々の実験において最も適切なリファレンスであることが示されました。 発現パターンの異なる3つの候補遺伝子の相対転写量は、この不変のコントロールの発現を基に正規化された。 ΔΔCq値を算出し、それぞれのDESeq2解析と比較した（表2）。
発現パターンが大きく異なる3つの候補遺伝子すべてについて、算出したΔΔCq値はDESeq2解析で算出したそれぞれのlog2倍変化値と一致し、発現差異の妥当性を実証した。 さらに、植物との相互作用の開始や確立に重要であると考えられる分子候補を優先的に捕らえるため、有意に誘導される遺伝子に焦点を当てた解析を行った。
Differentially expressed genes (DEGs) in isolate Ben3 at 3 dpi of potato sprouts
Differentially induced genes in isolate Ben3 in interaction with potato sprouts at 3 dpi compared to the pure mycelium of the isolate, as function in initiating and supporting process with the potato sprout. 図3
3dpiにおける生物学的プロセス（BP）、分子機能（MF）、細胞成分（CC）のGO用語分布の違い。 R. solani AG3-PT分離株Ben3の純菌糸を成長中のジャガイモ植物に誘引せずに培養したもの（Ben3）と、3dpiでジャガイモ芽と相互作用したもの（early）を比較した。
3dpiにおいて、異なる誘導を受けた遺伝子は主に糖質、細胞内窒素化合物の代謝過程、輸送に関わるものとして割り振られている。 一方、53の遺伝子は、グリコシル結合に作用するいくつかの異なるヒドロラーゼ、およびペクチン酸リアーゼ（例えば、Ben3g3530、表2参照）またはキシラナーゼを含む細胞壁分解酵素をコードするものである。 これらの細胞壁分解酵素をさらに特定するために、すべてのDEGはCarbohydrate Active enZyme (CAZy) データベースに従ってアノテーションも行った（補足表11）。 R. solaniのような壊死の植物病原菌は、植物細胞壁の構造タンパク質や糖質成分を分解して細胞を壊死させ、養分を漏出させるために、相互作用の過程でプロテアーゼや細胞壁分解酵素などの多くの加水分解酵素を分泌することが必要である44,45,59,49,50。 したがって、誘導された細胞壁分解酵素および誘導されたペプチダーゼのいくつかは、R. solani AG3-PTとジャガイモ芽の組織との相互作用を支援する機能を有すると考えられる。 しかし、分泌型ペプチダーゼは、グラム陰性菌48 や真菌47,49 のエフェクターとしての役割も広く研究されている。 病原体のエフェクターは通常、病原性因子として宿主細胞内に送り込まれ、基礎的な防御反応を抑制し、病原体の繁殖に適した環境を作り出す50,51,52。 このように、タンパク質分解による宿主タンパク質の翻訳後修飾は、植物の防御反応を制御する上で広く用いられている機構である。 現在のところ、これらの誘導型プロテアーゼは、R. solani AG3-PTのジャガイモ宿主との相互作用をサポートするエフェクターとしての役割を担っていると推測される。 しかし、宿主との相互作用における機能的役割を明確にするためには、個々のプロテアーゼのさらなる機能解析が必要である。
もう一つの大きなグループとして、3 dpiで相互作用の異なるアップレギュレーションを示す100のメンバーからなる仮説的タンパク質が記述されている。 これらの遺伝子の多くはR. solaniに特異的で、R. solani AG3 Rhs1AP, R. solani AG2-2IIIB, R. solani AG8, R. solani AG1-IA and AG1-IBの他の5つの注釈付きゲノムに相同性を見出すことができる。 これらの遺伝子は、R. solani AG3-PTのジャガイモ芽細胞に対する相互作用に関与していることが予想された。 真菌の分泌するエフェクターは、サリチル酸前駆体を加水分解する53 、転写因子に結合してその活性を抑制する54 など、様々な方法で宿主の免疫を標的としていることが既に知られている。 また、R. solani AG3-PTとジャガイモの相互作用において、これらの仮説的なタンパク質がどのような役割を担っているのか、さらなる解析が必要である。
興味深いことに、最も差の大きかった遺伝子（Ben3g6247）は、SaccharomycesのRTA1などのlipid-translocating exporter（LTE）ファミリータンパク質と相同性があった。 RTA1タンパク質は、7つの膜貫通セグメントを持ち55、異物に対する抵抗性を持つ膜貫通タンパク質であることが予想されている56。 他のLTEファミリー遺伝子は、生合成中間体の排泄を直接または間接的に促進するトランスポーターやセンサーをコードしている可能性がある56。 LTEファミリータンパク質のこれらの推定される機能から、遺伝子Ben3g6247は病原菌の攻撃に重要な成分の分泌に関与する有力な候補である。
壊変相互作用の初期段階は、植物宿主の細胞死と様々な二次代謝物の生産、活性酸素種の蓄積を伴う21.A。 いくつかのR. solani 病原体（ジャガイモ新芽-R. solani AG3、ダイズ胚軸-R. solani AG4、ダイズ葉-R. solani AG1-CIA）において、抗酸化過程とそれぞれの遺伝子発現が壊死した組織と相関することが示されている27) 。 ジャガイモ宿主と分離株 Ben3 との相互作用の初期段階（3 dpi ）では、グルタチオン S-トランスフェラーゼ遺伝子の発現の強い増加や、活性酸素種の除去に関与することが知られている他の遺伝子の発現増加は見られなかったため、転写レベルでの病原体菌糸における抗酸化プロセスの誘導の強い証拠は観察することができなかった。 したがって、R. solani AG3-PTをジャガイモのスプラウトにコロニー形成させる本システムでは、3dpiの組織分析は、スプラウト組織への感染に先立つ植物病原体の相互作用の初期段階に類似していると推測される。
Differentially expressed genes in isolate Ben3 at 8 dpi of potato sprouts
In order to find the transcripts that is important in advanced stage of the interaction, differentially induced genes between pure mycelium of isolate Ben3 and Ben3 attracted to potato sprout at 8 dpi was screened. 遺伝子産物のそれぞれの機能的注釈と、共通のGOフィーチャーへの配分を図4に示す。 8dpiで誘導された遺伝子は、主に糖代謝や高分子代謝、輸送に関与していることがわかった。 この後期相互作用において、アップレギュレートされた152遺伝子（> 22%）は、様々な細胞壁分解酵素をコードしている（例えば、Ben3g3530、表2参照）。 また、全てのDEGはCarbohydrate Active enZyme (CAZy)データベースに従ってアノテーションされていた（補足表11）。 このように細胞壁加水分解酵素をコードする遺伝子の発現が増加したことは、分離株Ben3の病原性が高まっていること、また相互作用の過程で栄養素にアクセスするために細胞壁成分を分解することの重要性を示しており、壊死栄養病原体の病原性戦略として説明されていることを確認した21, 57. この破壊的な戦術は、膜の必須構成要素をコードする遺伝子の発現を誘導することを伴っていた。 これらの154のほとんどが未同定の膜タンパク質と推定されるトランスポーターは、養分やヒドロラーゼ活性の分解産物の取り込みに関与していると推定された。 この相互作用の段階では、ペプチダーゼをコードする遺伝子の優位性は低下しているように思われたが、それでも33のペプチダーゼをコードする遺伝子が差次的に発現上昇した（例えば、Ben3g2070、表2参照）。 これは、病原体との相互作用が8日以内のスプラウトと、それ以降の相互作用期間の短いスプラウトを含めて、スプラウト全体を収穫したことによっても説明されるかもしれない。 一般に、これは3dpiと8dpiで共通して差次的に増加した350の遺伝子にも表れている（図2）。
8 dpiにおける生物プロセス（BP）、分子機能（MF）、細胞成分（CC）についての差次増加遺伝子の用語分布（GO）。 R. solani AG3-PT分離株Ben3の純粋菌糸は、成長するジャガイモ植物に誘引されずに培養されたもの（Ben3）と、8dpiでジャガイモ芽と相互作用したもの（late）を比較した。
さらに、8dpiにおける別の大きなDEGs群は機能不明の98遺伝子から構成されている。 これらの遺伝子はリゾクトニア菌に特異的であり、機能を持つ配列との類似領域がないため、病原体と植物の相互作用をサポートする役割については推測するしかない。 これらの遺伝子をさらに機能的に比較し、それぞれの病理系における発現の違いなどから、推定される機能のヒントが得られるかもしれない。
本実験系では、R. solani AG3-PT 分離株 Ben3 をジャガイモ芽にコロニー付けし、8 dpi で初めて病斑が確認された。 植物宿主の壊血病的相互作用と細胞死は，植物と菌のそれぞれの遺伝子発現と相関することが他の実験25,27で示されている。 Samsatly ら27 は、R. solani AG3 にジャガイモの芽を接種して 5 日後に、グルタチオン S トランスフェラーゼおよびカタラーゼをコードする抗酸化遺伝子の発現が有意に増加することを定量的 RT-PCR を用いて明らかにした。 しかし、今回紹介した実験では、これらの抗酸化遺伝子の発現の強い増加は見られなかった。 この理由は、R. solani AG3の病原性の違いによるものと思われる。 しかし、Samsatly ら27 の実験では、in vitro の限られた系で、切り離された新芽を用い た実験であったのに対し、我々の実験では、培養した種塊に新芽を成長させ、in vivo 環境の条件を完全に反映させた実験であることも、違いの一つであった。 さらに、ジャガイモの宿主におけるトランスクリプトーム解析と合わせて検討することで、最終的には自然界に近い環境での宿主病原体の相互関係の理解を深めることができる。 solani AG3-PTの転写産物のうち、主に初期に関連するものと、相互作用の進んだ段階で重要になるものを区別するために、相互作用の3dpiと8dpiの間で差次的に発現した遺伝子もDESeq2で分析した。 0.05以下のP値と2倍以上の変化で173遺伝子が3dpiと8dpiの間で発現が減少し、400遺伝子が後の時点で発現が増加したとした。 これらの遺伝子の完全なリストとそれぞれのbaseMean値およびfold changeの値を補足表10に、3dpiと8dpiの間で最も差次的に発現した20遺伝子のリストを表3および4に示した。 3dpiと8dpiの間で最も差次的に発現が減少した20の遺伝子のうち10は、タンパク質分解と窒素の取り込みと同化に関与するタンパク質をコードしている（表3）。3dpiと8dpiの間で差次的に発現が増加した遺伝子の大部分は多糖分解に関与し、種々の炭素の酸化を伴うセルロース鎖の切断に関わる銅依存性溶解多糖類モノオキシゲナーゼに焦点が当てられている（表4）。