産業用酵素の生産と廃棄物分解のための都市固形廃棄物から分離した細菌の分離と特性評価

Barrackpore MunicipalityとDhapa waste dump siteから細菌株の分離と特性評価が本研究で行われた。細菌の増殖は、培地、pH、温度、培養期間、炭素源など、さまざまな物理化学的条件に依存する。したがって、分解者として利用するために大量増殖を行う前に、自然生息地で細菌が増殖するためのさまざまな条件を研究する必要がある。そこで、以下のパラメータを考慮した：

都市固形廃棄物の物理的および化学的特性

細菌は幅広い水分レベルで増殖することができる。本研究では，Barrackpore MunicipalityとDhapa廃棄物処理場から採取したサンプルの含水率はそれぞれ約65.32%と66.45%であることがわかった．様々な土壌の細菌数は含水率と密接な相関がある。好気性バクテリアの活動に最適なレベルは、土壌の保水力の50～75%であることが多い。1 Pseudomonas、Achromobacter、Bacillus属の数は、ほとんどの好気性土壌で見つかり、嫌気性で湿った状態では、Clostridiumが発生する。 15

この研究では、2つの培地（BCDAとNA）のpHを細菌株の培養に最適化した。採取したサンプルのphはどちらも7.79であった。 pHは人工培地で細菌を増殖させるための重要な因子である。 pHの最適化は、Nutrient Agar (NA) と Basic czapek dox agar (BCDA)の2つの培地で実施された。 pH7.2および7.6のNAおよびBCDAは、細菌株の最大増殖に適していることが判明した。その結果、試料のpHは約7.79であり、この理由から、これらの菌株はBCDAおよびNAのpH7-8のin vitro条件下でも良好に増殖することが判明した。バクテリアはpH4から10の間の土壌反応に耐えることができるが、大多数にとって最も好ましいpHはちょうどアルカリ性から中性になるところである。 Thiobacillus thiooxidansやAcetobacter属のような細菌は、pHレベル0から2の間の非常に低いpH値で成長することができ、いくつかのBacillus属はpH11で成長することができます。15 熱放線菌の最適な増殖はpH8または9で起こり、pH516前後の反応では大きく落ち込む Vibrio、Streptococcus faecalis、Escherichia coliもアルカリ反応（pH8-9）に耐える16

最初にサンプルのNPK含有量を調査した。有機物含有量は27.84% (Barrackpore Municipality) および29.32% (Dhapa) 、窒素含有量 (%) は0.165 (Barrackpore Municipality) および 0.179 (Dhapa) 、リン含有量 (%) は 0.502 (Barrackpore Municipality) および 0.545 (Dhapa) 、カリウム含有量 (%) は 18.29 (Barrackpore Municipality) および 19.21 (Dhapa) であることが判明しました。これらの分析結果は，細菌の生育環境を明らかにし，菌株の分離培養の決定要因になった．

分離菌株の培養特性

本研究では，BM1，BM2，BM3，D1，D2，D3，D4，C2およびC3，これら9菌株の培養液を分離した．その結果，BM3, D1, C2の大量増殖にはczapek dox寒天培地（BCDA），BM1, BM2, D2, D3, D4, C3の大量増殖にはNutrient寒天培地（NA）が適していることが明らかとなった．酵母エキスを含むキシラン培地は細菌の最大増殖に適していたが、Pseudomonas属、Bacillus属、Aeromonas属は栄養寒天培地でよく増殖することが分かった。選択された菌株の特性評価には、目視および顕微鏡観察が用いられた。細菌のコロニーの特徴の詳細を記す（表1）。グラム染色は、細菌を観察するための古くて信頼できる方法である。グラム陰性菌はアルコールによって脱色され、クリスタルバイオレットの紫色が失われた。グラム陽性菌は脱色されず、紫色のままであった。

Colony Color色彩の特徴

Bacilli

短桿菌

クリーム丸型形状です。 shiny

White

Cream 丸型形状。ぬるぬるした増殖

Bacilli

Cream

Cream 丸型．透明、光沢あり

Cream 丸型です。 shiny

Strain no	コロニーの特徴		Cell features
	Nature of colony	Gram nature	Shape
BM1	白	イラネーヨ。腫れ物、分泌物あり	Gram Positive
BM2	Cream	round shaped.のようなもの。透明	グラム陽性
BM3	クリーム	イレギュラーです。透明	グラム陽性	バチルス
D1	Gram positive	Bacilli
D2	イラネーヨ。 boil like, shrinked	Gram positive
D3	Gram negative
D4	Irregular, 腫れ物、分泌物あり	Gram negative	Short bacilli
C2	Gram negative	Bacilli
C3	Gram positive	Coccus

表1 分離菌のコロニーの特徴

今回の調査では、以下のようになった。 BM1，BM2，BM3，D1，D2，D3，D4，C2，C3，これら9菌株を分離し，微生物学的な特性評価を行った．その結果、BM1, BM3, D1はグラム陽性桿菌、BM2はグラム陽性短桿菌、D2はグラム陽性複室桿菌、D3, C2はグラム陰性桿菌、D4はグラム陰性短桿菌、C3はグラム陽性球菌であることが明らかとなった。また、9株の生化学的特性を把握するために、さまざまな生化学的検査を行った。表2にその生化学的性質を示す。

Indole

Biochemical tests

Strain no

Catalase

Starch

Ammonia

Eijkman

Urease

Carbohydrate

アミラーゼ

BM1

bm2

bm3

表2 分離菌の生化学特性

+=Positive;

以上の結果から、分離菌株の形態、コロニー特性および生化学的性質が明らかとなり、今後の分離菌株の同定および特性解析に役立つと思われる。

増殖条件の最適化

今回の検討では、NA、ACDA、BCDAなどの各種増殖培地で分離菌株の増殖を観察した。その結果，BM3，D1，C2の大量増殖にはBasic Czapek Dox寒天培地（BCDA）が，BM1，BM2，D2，D3，D4，C3の大量増殖にはNutrient Agar（NA）培地が適していることが判明した．すべての菌株の最適な増殖は37℃で確認された。バクテリアの最適温度範囲は約25〜36℃である。 Sultana17 は、33±4℃の温度は細菌の増殖に理想的であると観察している17。ある種の細菌は、20℃以下の温度で最も活発に発育する。好熱菌は45-65℃でよく増殖し、一部の好熱菌は40℃以下では増殖できない。1

本研究で得られた菌株を異なる培養時間（6、12、24、36、48および72時間）で培養した。 BM1、BM2、D2、D3、D4、C3は培養時間24時間、BM3、D1、C2は培養時間36時間が適当であることがわかった。目視観察では、24時間培養後、BM2は薄いオレンジ色、BM1は白色、BM3はクリーム色の白色と、それぞれの好適培地（BCDA、NA）で発色していることが分かった。 48-72時間培養後、BM2の色は橙色、BM1, D1は黄色、C2は赤色、BM3, D2, D3, D4, C3はクリーム色の白色のままであった。コロニータイプはBM1, BM2, D2, D4株が湿潤、その他がクリーム色であった。ブドウ球菌、ミクロコッカス属は普通の培地で金茶色、黄色、白色のコロニーを作る。 8

Antagonism assay

Cross streaking methodを用い，菌株間の拮抗作用を調べ，今後の様々な分野での応用を検討した．分離された細菌内の拮抗作用の詳細を説明する（表3）。

Antagonism
Strain no	BM1	BM2	BM3	D1	D2	D3	D4	c2	c3
bm1	×	+		+
bm2	bm2	+	×	+	+	+	+	+	+
bm3	+	+ ×
D1		+		×	+	+	+	+	+
D2		+		+	×
D3	+	+		+		×	+	+
D4		+		+		+	×
C2		+		+		+		×	+
C3		+		+				+	×

表3 分離菌内の拮抗作用

+ = アンタゴニズムが存在する。

BM2 は他のすべての株と拮抗しているので、この株を1株としてコンソーシアムを形成することは不可能である。 D1、D3も他のほとんどの株と拮抗している。 BM1は他のどの株とも拮抗せず、最も強力な株である。 BM3、D2、D4、D5、D6は少数の菌株と拮抗作用を示し、これらの菌株とBM1の組み合わせでコンソーシアムを作成することが可能である。その結果，5種類の重金属に対して，Pbは4000ppmまで，Cdは30ppm以上では微生物が増殖しないことがわかった． MICは、10日間培養しても菌が増殖しない場合に表示される。その結果、As、Cd（10-30ppm）、Zn（200-300ppm）、Hg（200-300ppm）、Pb（3000-4000ppm）に対するMICは、3つの細菌すべてにおいて250ppmから350ppmの範囲にあった（Table 4）。本研究では，BM1 で As と Cd に対する耐性が最も高く，BM2 と BM3 で Hg と Pb に対する耐性が最も高いことが示された。本研究では、最も毒性の高い金属（MICが最も低い）はcdであり、最も毒性の低い金属はPbであった（表4）。

As3+

の順。

阻害濃度 (ppm)
Strain no	As5+	Zn	Pb	Hg	Cd
BM1
bm2
bm3
D1
d2
d3
d4
c2
C3

表4 分離菌株の金属耐性

10日間培養してもプレート上で増殖しない場合、MICが認められた。18 Mergeayら19 は、いくつかの異なる金属の最小発育阻止濃度（MIC）を試験し、最も毒性の高い金属（MICが最も低い）は水銀であり、最も毒性の低い金属はマンガンであることを見出した。19 重金属の濃度ごとの微生物の耐性は、カップアッセイ試験で描かれた。重金属の濃度が高くなるにつれて、各カップの周囲の阻害域の直径は大きくなり、重金属が微生物の増殖に有害な影響を与えることが示された。 Barrackpore MunicipalityとDhapa廃棄物処理場は、それぞれBarrackpore市、Kolkata市とその周辺地域の家庭ごみと産業廃棄物をすべて回収している。家庭や産業から出る廃棄物は、微生物が重金属に対する耐性を獲得するのに適した環境である。固体廃棄物中に少量の重金属が存在すると、重金属耐性微生物の出現を誘発することがある。重金属に対する耐性は、外来多糖による錯形成、細菌細胞膜との結合、金属還元、金属排出など、耐性微生物が開発する様々な解毒機構に起因している。これらの機構はプラスミド遺伝子にコード化されることもあり、細胞間の毒性金属抵抗性の伝達を容易にしている20。 21

抗生物質感受性試験

抗生物質感受性試験は、抗生物質が試験生物に対してどの程度有効であるかを調べるのに役立つ。分離された9株について、4種類の抗生物質に対する感度を調べ、その結果を表5に示した。ほとんどの菌株が抗菌性化合物を生産しており、医学的な有用性がある。 D1、D3、D5は抗菌活性を示さなかった。

抗生物質濃度（100ppm）
菌株番号	Gentamycin	Oxytetracycline Penicillin	Streptomycin
BM1	+		+
bm2	+	+
bm3	+ +		+	+
D1	+	+	+	+
d2	+	+
d3	+ + +	+		+
D4	+	+		+
c2	+
c3	プラス + +	+

表5 細菌の抗生物質感受性

+=増殖が阻害される。

抗菌活性測定

抗菌性化合物の生産はほとんどの細菌に共通する現象であるようだ。本研究では、3株が抗菌活性を、5株が抗真菌活性を示したが、3株は病原体に対して抗菌活性も抗真菌活性も示さないことが判明した。その結果を表6に示す。 Subramaniamらによる同様の研究が報告されている22。Bacillus属のメンバーによって様々な抗菌性化合物が生産されており、これらの多くはペプチド、リポペプチド、フェノール誘導体として同定されている。近年、様々な環境下で多様な生物活性を示す新規二次代謝産物の探索が注目されている。

Oxytetracycline

の順。

抗生物質濃度（100ppm）
菌株番号	Gentamycin	Penicillin	Streptomycin
BM1	+
bm2	+	+
bm3	+	> +		+	+
D1	+	+	+	+
d2	+	+
d3	+	+		+
D4	+	+		+
c2	+	+
c3	+	+	+

Table 6 細菌の抗菌活性

+ = 抗菌活性あり。 –

細胞外酵素の生産

環境保護への意識の高まりとともに、酵素、特に極限環境微生物の利用が多くの産業プロセスで注目されるようになった。近年、化学品、繊維、医薬品、製紙、食品農薬などの製造において、化学触媒に代わって微生物酵素の利用が進んでいる。酵素を用いた工業的バイオプロセスは、今や化学薬品を用いた既存のプロセスと直接競合しています。しかし、本研究では、9 種類の分離菌株について、プロテアーゼ、レシチナーゼ、DNase、リパーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、カタラーゼ、オキシダーゼの 8 種類の酵素の生産について定性試験を行った。同様の研究は Subramani and Narayanasamy によって報告されている23。興味深いことに、我々の研究では、そのうちの 6 株が市場価値の高いプロテアーゼ酵素を生産していることが示された。また、9株すべてがカタラーゼとオキシダーゼを生産した。その結果を記す（表7）。

Oxytetracycline

抗生物質濃度（100ppm）
菌株番号	Gentamycin	Penicillin	Streptomycin
BM1	+
bm2	+	+
bm3	+	>+	+	+
D1	+	+	+	+
d2	+	+
d3	+	+		+
D4	+	+		+
C2	+		+	+
C3	+	+	+

表7 酵素生産の定性分析

プロテアーゼ分析

6株（BM1, BM3、D1、D3、C2、C3）の9株はプロテアーゼ産生能を示した。プロテアーゼは食品産業、洗剤産業、医薬品、固形廃棄物分解など幅広い分野で利用されていることから、生産されたプロテアーゼの定量分析を実施した。このようにして生産されたプロテアーゼ酵素の活性を測定し、その結果をIU/mlで表した。その結果を図示する（表8）。プロテアーゼの定量試験では、6菌株のうちBM1が高い力価でプロテアーゼを生産していることが明らかになり、Guptaら, 24 同様に、細菌種からのアルカリプロテアーゼの生産とその産業応用も報告されている。

Strain no	Activity in IU/ml
BM1
BM3
D1
D3
C2
C3

表8 生産したプロテアーゼ活性の検討 5944>

分離菌の廃棄物分解能力

プロテアーゼ酵素は廃棄物の分解に広く応用されている。そこで、プロテアーゼ酵素を生産できる6菌株を対象に、廃棄物分解能の試験を行った。その結果、BM1が最も高い分解能力を持ち、次いでBM3が高い分解能力を持つことが確認された。また、BM1は強力なプロテアーゼ酵素を産生するため、より優れた分解能力を有していた（図1）。廃棄物は微生物（バクテリア）によって分解され、その重量は減少する。今回の分解実験では、バクテリアによってゴミが分解され、単純な分子に変換されるため、処理したゴミの重量が減少することが確認されました。図1に見られるように、分解過程の進行に伴い、廃棄物サンプルの重量減少の割合が増加した。同様の観察は、バングラデシュの特定細菌による生ゴミの重量減少研究に関して、Zavedら,25によって報告されたものである。本研究では、BM1が最も高い分解能力を持ち、その次に高い分解能力を持つことが観察された。図1 分離菌株の廃棄物分解能

BM1 は廃棄物のバイオレメディエーションのために効率的に使用できる。

Microbiology & Experimentation

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