GroEL/GroESのサイクリング。 ATPは基質タンパク質より先に開いたリングに結合し、タンパク質の結合とネイティブ状態の生成を促す

Results

Rapid ATP Binding to GroEL as Revealed by Fluorescence Intensity Changes of GroEL F44C labeled with Oregon Green 488.ATP は非配位子の GroEL と GroEL/GroES/ADP 複合体の trans 環に速やかに結合する。 (A) GroEL/GroES/ADP/AlFx複合体（文献24；PDB IDコード：1PCQ）のGroELサブユニット1個の赤道ドメインの一部でF44の位置を示すリボン図である。 (B）EL44-OG単独（黒色トレース）、500μM ADPとの混合（緑色）、および500μM ATPとの混合（赤色）の発光スペクトルを示す。 励起光は496 nmであった。 (C) EL44-OG の ATP との混合フロー停止時の蛍光の変化。 このトレースは、2つの指数関数の和としてフィットさせることができる（白線）。 模式図は、赤道領域のOG（緑）を示している。 (D) 蛍光変化の速い方の速度のATP濃度依存性。 異なるATP濃度でのC（黒）とE（赤）の実験の速度定数をATP濃度の関数としてプロットすると、それぞれのATP結合の2次速度定数に等しい勾配の直線が示される。 (E) EL44-OG/GroES/ADP複合体のATPとのストップフロー混合時の蛍光の変化。 Dはシス環のADP、GroESは灰色に着色、ATP（赤）は結合する環に隣接して示している。 (F) EL44-OGを用いた以外は、Eと同様。 (G) Eと同様であるが、MDHがトランスリングに結合している（模式図では青線で表現）。 (H) Eと同様のストップフロー混合実験。ただし、複合体中のGroELはアピカルドメインの外側の315位にOGで標識されている。 ここでは、トレースは、示された速度で単一の指数関数として適合させることができた。 (I)システイン置換した位置でOG標識したGroELの単一リングバージョン、SR1を用いたストップフロー実験（速度と振幅の要約は表S1参照。)

EL44-OGの蛍光発光スペクトル(496 nmで励起)から、ATP添加により定常状態の蛍光強度の大きな低下(500 μM ATPで約65%)と発光最大値の小さなブルーシフト(図1B)を生じたことが明らかになった。 0.5 mM ATPとEL44-OGの流路混合を停止すると、発光強度の急激な低下が観察され、1つは100 s-1の速度定数、もう1つは4 s-1の速度定数を持つ2つの指数関数の和としてフィットする曲線が得られた（図1C）。 前者は、ATP と非結合型 GroEL の相互作用が速いことを示し、F44W (ref. 16; 80 ± 5 s-1) や、トリプトファンが赤道領域の他の場所に置換された Y485W (ref. 17) などのトリプトファン置換型 GroEL の速度と一致する。 18; 123 ± 2 s-1）、そして頂膜ドメインの空洞に面した部分にトリプトファンを置換したR231W（参考文献17; 80 s-1）である（GroELにはトリプトファンがない）。 予想通り、ATP と EL44-OG の相互作用速度は ATP 濃度に依存し（図 1D）、高速相では 2 × 105 M-1 s-1 の二分子速度定数が決定され た。 同じくATP濃度に依存する遅い速度相は、GroELのR231WとY485Wで観察されたATP結合時の第3の蛍光相に相当すると思われる（17, 18）。

Equally Rapid Fluorescence Change on ATP Binding to Open Trans Ring of GroEL/GroES/ADP Asymmetrical Complex.

生理的条件下では、通常のATP受容体状態はGroEL/GroES/ADP非対称複合体の開放トランスリングである。 ストップフローミキシングにより、EL44-OG/GroES/ADP複合体のトランス環へのATP結合速度は、非配位GroEL環へのそれと同様であることが確認された（図1E、図1Fと比較）。 トランス環に結合した基質ポリペプチドはATP結合速度に影響しない。

多くのin vitro研究において、非ネイティブポリペプチドはまず非対称ADP GroEL/GroES 複合体の開いたトランス環に結合され、その後ATPと過剰のGroESを添加した (8, 9) 。 このような条件下では、ATPの結合とGroESの結合は、明らかに非ネイティブポリペプチドをカプセル化し、生産的なフォールディングを誘導することが可能である。 このような状況下でのATP結合速度は、結合した基質タンパク質に影響されるのだろうか？ これを調べるために、非ネイティブのMDHを非対称のEL44-OG/GroES/ADP複合体に結合させ、ストップフローミキシングでATPを添加した。 この条件下では、蛍光強度の変化率はポリペプチド非存在下のEL44-OG/GroES/ADP複合体のそれとほとんど同じだった（図1Gと図1Eを比較）。 このように、トランスリング・アピカルドメインに結合した非ネイティブ基質の存在は、トランスリング赤道側ヌクレオチド結合ポケットへのATPの急速な侵入に検出可能な影響を与えない。

Rapid Apical Domain Movement Accompanies ATP Binding.の項参照。

ATPがGroELに急速に結合すると、同じように急速な時間スケールで頂膜ポリペプチド結合ドメインに大きな調整が起こるのか、それともATP結合に応じた頂膜の変化は比較的遅く、ATP結合の効果は後の時間に起こると考えなければならないのか。 R231Wの以前の研究では、その変異体では頂膜の効果が急速に起こることがすでに示されていた(17)。 今回も、円筒内側のATP結合部位から離れた頂膜ドメインの外側側面にある蛍光プローブ（OGで標識したシステインゼロバックグラウンドのGroEL E315C）は、ATP結合と同じ時間スケールで、蛍光強度が急速に変化することが示された。 例えば、ATP濃度150μMのGroEL315-OG/GroES/ADP非対称複合体では、20秒-1の速度定数が観測された（図1H、図1Eの25秒-1と比較）。 E315CのOG修飾単環版であるSR315-OGの解析でも同様の蛍光強度変化率を示したことから、このような頂点の変化はATPが結合している同じ環で起こっていることがわかった（図1I）。

Relatively Slow Binding of Substrate Polypeptide as Measured by FRET.

非ネイティブ基質ポリペプチドとATPの結合速度を比較するために、次にFRETを用いて非対称GroEL/GroES/ADP複合体と基質タンパク質の結合速度を測定した。 3種類の基質タンパク質を検討した。 MDH (33 kDa), Rubisco (51 kDa), そしてマルトース結合タンパク質のダブルミュータント型 (DM-MBP; 41 kDa) である。 この3つのタンパク質は、25℃ではストリンジェントな基質タンパク質として振る舞い、ネイティブな形になるためにはGroEL、GroES、ATPの存在が必要である(3)。 これらのタンパク質が存在しない場合、定量的な凝集が起こる。 結合をモニターするために、システイン残基にクマリン プロピル マレイミド（CPM）（材料と方法参照）で標識した基質タンパク質と EL44-OG（acceptor） との間の FRET を測定した。 CPM の励起極大（384 nm）で励起し、非標識 GroEL に結合した CPM（ドナー）標識基質（図 2A, DM-MBP-CPM の例、黒色トレース）、非標識基質に複合化した EL44-OG（ 図 2A, 受容体標識、青色トレース）、および EL44-OG と結合した CPM 標識基質の複合体（図 2A, 赤色トレース）について発光スペクトル測定を行な った。 DM-MBP-CPM、MDH-CPMともにEL44-OGとの結合で強いドナー消光が見られた。同時に、かなりのアクセプターシグナルが現れた。

非ネイティブ基質であるDM-MBPは、非配位子のGroELおよびGroEL/GroES/ADP複合体のトランス環に比較的ゆっくりと結合する。 (A) GroELに結合したCPM標識DM-MBP（ドナー）の発光スペクトル（D、黒色トレース）、非ネイティブDM-MBPと複合体化したEL44-OG（アクセプター）の発光スペクトル（A、青色トレース）、DM-MBP-CMとEL44-OGの複合体の発光スペクトル（D、赤色トレース）、すべてCPMの最大励起波長の384 nmで励起した場合。 (B) 非ネイティブ DM-MBP-CPM と EL44-OG のストップフロー混合に伴うドナ ーチャンネル蛍光の変化。 青線は非天然型DM-MBP、黄丸のDはCPMのラベルを表す。 (C) DM-MBP結合の高速化速度定数のGroEL濃度依存性。 異なる濃度のGroEL（黒）またはGroEL/GroES/ADP複合体（赤）を用いたBと同様の実験の速度定数をGroEL濃度に対してプロットすると、傾き（2次速度定数）がそれぞれ6.11 × 106 M-1s-1と5.36 × 106 M-1s-1の直線が得られる。 (D) 非ネイティブ DM-MBP-CPM と EL44-OG/GroES/ADP 複合体および 500 μM ATP のフロー停止混合時のドナー蛍光の変化。 複数の実験（n = 6）において、速い相の速度は、ATPの存在下では、その非存在下よりもトランス環で一貫してわずかに速かった：2.08 ± 0.11 対 1.36 ± 0.22 (Table S2).

125nMのDM-MBP-CPMと125nMのEL44-OGをストップフロー混合すると、ドナー発光強度の低下が観察され、1つは1.33s-1の速度定数を持つ指数関数、もう一つは0.65s-1の速度定数を持つ2つの指数の合計として適合できる曲線が見られた(Fig. 2B)。 速い方の速度（k1）はシャペロニンの濃度に依存していたが（図2C）、遅い方の速度は依存していなかった。 GroEL 濃度が 125 nM の場合（図 2B）、基質ポリペプチドの結合速度（k1 = 1.33 s-1）は、ATP 結合速度（500 μM ATP で 100 s-1; 図 1C）よりも 60 倍遅くなることが判明した。 基質結合速度は、生理的なGroEL濃度である1-2μMでは数倍大きくなると予測されるが（図2C）、生理的なATP濃度が数ミリモルであることを考えると、ATP結合速度もある程度大きくなると思われる（図1D）。 さらに、蛍光標識したDM-MBPと同時にATPを添加すると、DM-MBPの結合速度が増加するという再現性のある効果があった（図2D、表S2）。 つまり、トランスリングへの添加の生理的順序は、ATPの急速な到着の後に、基質タンパク質のゆっくりとした到着からなるようである。 この順序は、ポリペプチドが最初にトランス環に結合し、その後ATPが付加されるという、最近の研究でプログラムされた順序とは逆である(8, 9)。 このような添加順序は、基質タンパク質のリフォールディングに何らかの影響を与えるのだろうか？

最初にATPを添加し、次にポリペプチドを添加すると、逆の順序に比べて、より広範囲にネイティブな状態を回復することがわかった。

GroELの単環型であるSR1を使って添加順序実験を行い、「シングルラウンド」分析を可能にした。 SR1が捕捉したポリペプチドはGroESとの結合後、安定なSR1/GroES複合体の長寿命シスキャビティの中でほぼ定量的にネイティブフォームに折り畳まれる(10, 11)。 そこで、SR1をATPと非ネイティブポリペプチドのいずれの順でインキュベートした後、GroESを添加し、ネイティブタンパク質の回復の程度を、添加の順序と添加の間隔の両方に関連して測定することができた（図3A）。 これらのテストでは、最初の相互作用が完了するように、ATP/ポリペプチドの2秒後にGroESを添加した。 最初の実験では、非ネイティブのルビスコを先に添加し、2秒後にATPを添加した場合、ルビスコがネイティブな形で回復する程度は≈30%に過ぎないことが再現的に観察された。 これは、ATPを先に添加した場合の>60%や、あらかじめ形成されたルビスコ-SR1複合体（非ネイティブのルビスコとSR1を10分間インキュベートして生成）にATPとGroESを添加した場合の約70%の回復と比較すると、非常に高い回復率であることがわかる。 このことは、アクセプターGroEL/GroES/ADP複合体のトランス環がGroESの結合前に≈1-2秒だけ開いてポリペプチドを結合できる循環反応において、急激なATP結合による先端ドメインの移動が非ネイティブポリペプチドの結合を促進することを示唆するものであった。 一方、ポリペプチドをATPの2秒前に添加すると、GroES添加の2秒前にATPでアピカルドメインが動員されるにもかかわらず、結合にはあまり有利でないようであった。 ルビスコとATPの添加間隔を4秒にすると（図3A）、添加順の効果は緩和され、回復の速度や程度はATPを先に添加した場合と同等になった。これは、ATP添加前の間隔でポリペプチドがより広範囲に結合したためと思われる。 2秒の間隔を置いた添加順の研究では、ルビスコの回復の程度が大きく影響されたが、安定なSR1/GroES複合体内でのネイティブ状態の回復の速度論は同様であり、カプセル化した室内でのフォールディングの速度ではなく、基質タンパク質結合への影響と一致していた

ATPを先に添加した場合のRubiscoのより広い結合率。

基質タンパク質結合に対する添加順序の効果に対処するため、35S標識Rubiscoを用い、最終生成物混合物のゲルろ過を使用して安定なSR1/GroES/Rubisco複合体と未結合ポリペプチドを分離し、添加順序のインキュベーション中にSR1により結合するようになった量を測定した。 その結果、40,000 cpm 35S-Rubisco (125 nM)をATPの2秒前に添加すると≈10,000 cpm 35S-Rubisco が結合し、ATPをRubiscoの2秒前に添加すると≈30,000 cpm 35S-Rubisco が結合した (Fig.3B). 後者の結合量は、10分間かけて形成したSR1-Rubisco複合体をATPとGroESとともにインキュベートした場合にも得られた（図3B）。 基質結合の程度のこれらの測定は、酵素活性の回復の程度と平行しており（図3Bと図3Aを比較）、ATP/ポリペプチドの添加の間に2秒の間隔がある場合、最初はATPの添加がより効率的な基質タンパク質結合に適しているという結論を支持するものであった。

Greater Rate of Rubisco Binding to an ATP-Exposed Chaperonin Ring.

先に述べた、最初にATPを添加した実験では、ルビスコの結合範囲が大きいという観察は、ATPで移動した頂膜ドメインとルビスコの結合率が大きいかもしれないと示唆している。 そこで、SR1の44位のシステインにOGを置換したATP加水分解欠損D398Aバージョン（C138Aバックグラウンド）を用いて、CPM標識ルビスコの結合速度をFRETにより報告した（図3 C-E）。 その結果、前述の添加順の実験と同じ条件で行ったルビスコの結合速度は、ATP存在下と非存在下で2倍大きいことが確認された（図3Dと図3Cの比較）。 生理的な状況を反映して、ATPと非天然型ルビスコを同時に添加した場合、ルビスコの結合速度はATPをルビスコより先に添加した場合と似ていた（図3E、図3Dと比較）。 これらのデータは、ルビスコがATPで固定化されたリングとより速く結合すること、そしてATPと非ネイティブ基質の両方が存在する生理的条件下では、基質結合に作用するのはATPで固定化されたアピカルドメインであることを支持するものである

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