Results and Discussion
生体内の塩基除去修復や自然脱プリン/脱ピリミジン化によるAPサイトの形成と修復をより理解するために、”Apurinic-Apurinic-Desyrimidic Site in Genomic DNA in vivo “を提案し、”Endogeneous Apurinic/Apyrimidinic Sites in Mammalian Tissues “と命名した。 成体ラットおよび移植品質のヒト肝臓の様々な組織から抽出したゲノムDNA中の内因性APサイトの数を、ASBアッセイ（3）を用いて測定した。 内因性APサイトの数は組織間で大きく異なるが（図1）⇓組織内では変わらなかった。 最も多くのAPサイトが検出されたのは脳で、106ヌクレオチドあたり30サイト、次いで心臓と大腸であった。 一方、ラットの肝臓、腎臓、肺は一貫してAPサイトの数が最も少なかった（106ヌクレオチドあたり8-9サイト）。 ヒト肝臓の内因性APサイトの数は、ラット肝臓のそれと同程度であった。 これらのデータは、通常の生理的条件下では、哺乳類細胞あたり50,000〜200,000個のAP部位が存続していることを示している。 ゲノムDNA中の定常状態のAP部位の数は、AP部位の形成と修復のバランスを反映しているはずである。 脳における内因性AP部位の数が多いことの解釈として考えられることは、以下の通りである。 (a)脱プリンティングや内因性DNA付加物の形成率が高く、AP部位が多くなる。(b)DNAグリコシラーゼの活性が高く、AP部位が多くなる。(c)II型APエンドヌクレアーゼの活性が低く、AP部位が蓄積する。(d) dRp-ase やβ-エリミネーターの効率が低く、5-nicked AP部位が残っている。
ラットおよびヒトの組織における内因性AP部位。 無傷のラット組織と正常なヒト肝臓から4℃でDNAを抽出し、ASBアッセイを用いてAP部位の数を測定した。 A、ラット組織の内因性AP部位を示す典型的なX線フィルム。 DNA（標準DNA試料を含む）をNC膜にロードした（1スロットあたり1.5μg）。 B, ラットおよびヒトの組織における内因性AP部位の走査型デンシトメトリーデータ。 コラム、5〜8個の個別サンプルの複製スロットからの平均値、バー、SD.
AP部位の修復の主要プロセスは、II型APエンドヌクレアーゼ/β-pol依存性経路である(7)。 タイプII APエンドヌクレアーゼはAP部位を認識し、損傷部位のすぐ5′側のホスホジエステル骨格を切開し、3′-ヒドロキシル基と5′-AP部位末端を残すことができる(5)。 その後、5′-dRpが遊離し、1塩基のギャップが埋められる。 哺乳類細胞の核には、かなりの量のII型APエンドヌクレアーゼが存在することが証明されている(8)。 以前、我々はASBアッセイとタイプII APエンドヌクレアーゼまたはNaOHの組み合わせにより、それぞれAP部位の3′または5′切断が誘発されることを示した(3)。 APエンドヌクレアーゼとdRp-aseのin vivoでの活性を理解するために、我々はAPサイト切断アッセイをさらに最適化した。 この実験では、タイプII APエンドヌクレアーゼとしてExo IIIを用い、AP部位の3′-切断を確認し、プトレシンを用いて5′-ニックを検出した（Fig.2）⇓。 このAPサイト切断アッセイの特徴を明らかにするために、MXで前処理してAPサイトの数を106ヌクレオチドあたり3.8 ± 0.5 APサイト（平均±SD）に減少させたDNAを、熱と酸バッファでインキュベートした。 様々な期間の熱/酸インキュベーションにより、106ヌクレオチドあたり11、47、115、320のAPサイトが誘導された。 Exo IIIの1回の処理により、最初に存在した数にかかわらず、各DNAサンプルのAPサイトの数は106ヌクレオチド当たり4～10個減少した（図3）⇓。 この減少は、Exo IIIによる5′側の酵素的切開と、Exo IIIとのインキュベーション中のAP部位の非特異的3′切断の組み合わせによるものと思われる。 この非特異的な3′切断により、このアッセイではDNA中の3′ニッキングAP部位の数を正確に定量することができなかった。 一方、プトレシンの処理では、AP部位の数の減少は見られなかった。 Exo IIIとインキュベートした後、プトレシンを投与すると、MXで前処理した子牛胸腺DNAのAPサイト数は元のAPサイト数まで減少した。 Exo IIIとプトレシンの組み合わせによるAP部位の切断効率は>99%であった。
AP サイト切断アッセイのスキーム。 II型APエンドヌクレアーゼ、および生体内のdRp-aseの活性をより理解するために、ゲノムDNA中のAP部位の5′側または3′側での切断の有無を測定した。 プトレスシンとExo III（type II AP endonuclease）はそれぞれ3′-切断と5′-切断のAP部位を残す。 AP部位の3′側と5′側に切り込みがない無傷のAP部位については、AP部位に隣接するリン酸ジエステル結合のいずれかの側で切り込みを入れた後もAP部位がDNAバックボーン上に残るので、ASBアッセイは理論的にはExo IIIまたはプトレシンで処理しても元の数のAP部位を検出することが可能である。 しかし、Exo IIIとプトレシンの組み合わせは、AP部位の3′と5′の両側を切断し、DNAバックボーンからAP部位を遊離させる。 このような遊離したAP部位は、このアッセイでは検出されない。 この切断反応後にDNAバックボーン上に残されたAP部位の数に基づいて、5′-及び3′-切断されたAP部位の数を推定することができる。 もし、5′-切断されたAP部位がDNA中に存在すれば、プトレシンの単一処理により、AP部位の3′-切断により5′-ニックのAP部位を遊離させることができる． 同様に、DNA中の3′-nicked AP部位は、Exo IIIを用いた5′-excisionによって解放されることができる。
熱/酸緩衝液で処理した子牛胸腺DNAのAP部位切断アッセイ。 AP部位切断アッセイを検証するために、Exo IIIとプトレシンが子牛胸腺DNAに誘導される無傷のAP部位に及ぼす影響を調べた。 子牛胸腺 DNA の元の AP サイトの数は、MX によって減少させた（CTD/MX）。 次に、DNAを熱/酸緩衝液中で異なる時間インキュベートして、異なる数の無傷のAP部位を導入した(-/-; Ref. 9)。 DNAをExo IIIおよび/またはプトレシンとインキュベートし、子牛胸腺DNA中の残存AP部位の数をASBアッセイによって測定した 。 列は、3つの個別サンプルの複製スロットからの平均値、棒グラフはSD。 A, 106ヌクレオチドあたり115のAPサイトを含むDNAのAPサイト切断アッセイ。 B、異なる数のAP部位を含むDNAのAP部位切断アッセイの概要
我々は内因性AP部位を特徴付けるために、ラットとヒトの組織から抽出したゲノムDNAにこのアッセイを適用した。 無傷のAP部位と切断されたAP部位、および残留するアルデヒド性病変の画分を図4⇓にまとめた。 ラットとヒトの組織DNAをExo IIIとインキュベートし、その後プトレシンを添加して、検出された損傷が実際のAPサイトであるかどうかを調べた。 AP部位の5′および3′切断後、106ヌクレオチド当たり1.5〜2.2の残留アルデヒド性病変が検出された。 これらのデータは，ASBアッセイが内因性AP部位を正しく測定していることを示している． この残存病変は、AP部位切断アッセイにおける酵素反応の限界と、ホルミルウラシルのような内因性アルデヒド塩基病変の存在によるものと考えられる(10)。 さらに、3′切断されたAP部位と無傷のAP部位を合わせた割合は、異なる組織で106ヌクレオチドあたり約2-3個の病変が検出され、これは内因性AP部位の総数の約1/3-1/10に相当する。 5′切断されたAP部位の数を調べるために、DNAをプトレシンとインキュベートした。 プトレスシンによるAP部位の減少量（元のAP部位数からプトレスシンインキュベーション後に残ったAP部位数を引いた値）が5′切断型AP部位の数を表している。 熱/酸緩衝液で前処理した子牛胸腺DNAとは対照的に、プトレシンで処理したゲノムDNAはAP部位の数が著しく減少していた。 これらのデータは、内因性AP部位の約3分の2以上が生体内で既にAP部位の5′側で切断されていることを示している
ラットとヒトの組織DNAのAPサイト切断アッセイの概要。 図1B⇓の凡例に記載したAP部位の元の数は、5′切断、3′切断、無傷のAP部位、および残留するアルデヒド性病変から構成されている。 5′薙ぎ払われたAP部位の数は、元のAP部位の数からプトレシンのみで処理した後に残ったAP部位の数を引いたものとして計算された。 3′切断型AP部位と無傷のAP部位を合わせた割合は、プトレスシン処理とExo IIIとプトレスシンの併用処理との差であった。 また，残存するAP部位は未切断のアルデヒド病変の数を示した。
タイプII APエンドヌクレアーゼによるAP部位の5′切断の後，切断されたAP部位は5′-DRp残基の切除を介してDNAバックボーンから解放されなければならない． この解放過程は、加水分解反応（11）やβ-エリミネーション（12）を介してdRp-aseによって、あるいは5′-dRp部位の下流を切り取るエンド核酸分解酵素（13）によって行われると思われる。 Xenopusとヒトのβ-polはβ-eliminationによって5′-dRpを放出することが証明されている(14)。 また、β-pol欠損細胞やβ-pol欠損細胞の修復パッチサイズを用いて、β-pol欠損細胞では単一のギャップ修復経路が優勢であるが、β-pol欠損細胞ではそうではないことが証明されている(15)。 また、ヒトAPエンドヌクレアーゼとβ-polの相互作用により、in vitroで5′-dRp残基の遊離が促進される(16)。 しかし、細胞内や生体内における5′-dRp残基の修復効率はあまり調べられていない。 酵母の無細胞抽出物を用いて、5′-dRp部位のプロセシングがウラシル含有DNAの塩基除去修復の律速段階であることが判明した（17）。 さらに、β-polが5′-dRpを除去する触媒活性を調べた(18)。 興味深いことに、β-polの5′-dRp分解活性のKcatは、APエンドヌクレアーゼのKcatより100倍も低いことが判明した。 本研究は、ラットおよびヒトの組織において、5′Rp-incised AP部位が明らかに残存していることを示すものである。 これらのデータは、APエンドヌクレアーゼによる切断とその後の5′-dRp残基の放出が生体内では基本的に効率的に連動していない可能性を示唆し、5′-dRpの修復過程が塩基除去修復の律速段階の一つである可能性がある。
前回の研究（3）において、自然脱プリン化が生理状態において1日に106ヌクレオチド当たり1.5箇所のAP部位で生じることが示された。 脳における内因性AP部位の数が多い原因がN3-やN7-アルキルプリンなどの熱に弱いDNA付加物であるかどうかを調べるために、脳と肝臓のDNAで脱プリンティングアッセイを行った。 しかし、脳と肝臓で差は見られなかった（データは示さず）。 したがって、内因性AP部位の定常状態は、不安定な塩基病変によるものではない可能性がある。 最も重要で豊富な内因性DNA病変の一つは、酸化的DNA塩基損傷である。 ラット脳における5-ヒドロキシシトシンの定常状態は、ラット肝臓のそれよりも∼2倍高いことが報告されている(19)。 このような酸化的なピリミジン塩基はEnd IIIによって修復され、DNA骨格にAPサイトが残る。 酸化ストレスとDNA中のAPサイトの定常状態の数が関係しているかどうかを調べるために、ASBアッセイとE. coli End IIIを組み合わせてEnd III感受性部位を定量化した。 End III感受性部位の数は、他の組織（106ヌクレオチド当たり4-5個）に比べ、脳（106ヌクレオチド当たり14個）では3倍も多かった。 最近、End IIIのヒトホモログ（hNTH1）遺伝子がクローニングされ、その特徴が明らかにされた（20）。 この遺伝子のmRNAの発現は、内因性APサイトの数に対応したパターンで臓器により異なる(20)。 酸化塩基の修復に関与するDNAグリコシラーゼの多くは、AP部位の3′側を切断するAPリアーゼ活性を持っている。 従って、内在性の5分子のAP部位は、そのようなDNAグリコシラーゼによる酸化塩基の切断に由来するものではないだろう。 予備実験では、過酸化水素とFeSO4が、酵素を介さずに、子牛胸腺DNAの5′切断AP部位を直接誘導することが示された（データは示していない）。 これらの結果は、酸化ストレスが5′切断を伴うAP部位の定常状態を引き起こす要因の一つである可能性を示唆している。
我々は当初、ゲノムDNA中の内因性AP部位はその毒性や変異原性から、その数は少ないと予想していた。 しかし、本研究により、AP部位の定常状態は、ゲノムDNA中の105ヌクレオチドあたり約1個の病変であることが示された。 AP部位は常に修復されているが、修復を逃れたAP部位の割合は、癌や変性疾患などの加齢に伴う自然発生的な疾患に関連すると考えられる突然変異、染色体異常、転写エラーに寄与していると考えられる
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