Abstract
尿毒症患者が結核感染後高カルシウム症となり，イオン化カルシウム値と1，25ジヒドロキシビタミンD3（1，25（OH）2D3）値には相関があった． 我々は、単球が腎尿細管細胞以外の1,25(OH)2D3変換の代替部位であるかどうかを明らかにするために、さらなる研究を行った。 本研究では、ex vivoバイオアッセイを用いて、単球の1-α水酸化酵素（CYP27B1）活性が、結核接触頻度の高い患者よりも結核活動中の患者で有意に高いことを見いだした。 しかし、活動性結核患者の単球を結核菌由来の抗原で再刺激すると、1,25(OH)2D3が少なくなることが観察された。 一方、結核との接触頻度が高い人では、1,25(OH)2D3のレベルは変化しなかった。 単球は25-ヒドロキシビタミンD3をより活性の高い1,25(OH)2D3に変換しうる1-α水酸化酵素の代替供給源であると結論した
1.結核菌と単球との接触は、単球の1-α水酸化酵素が1,25(OH)2D3に変換しうることを示す。 はじめに
結核は先史時代から世界を苦しめてきた。 最近の報告によると、毎年100万人の患者が結核および関連する併存疾患によって死亡しています。 この数十年，結核の病態生理を理解するために多大な努力が払われてきた。 動物モデルやヒトでの研究により、結核菌に対する個々の免疫反応の解明への道が開かれた。 これらの研究は、ビタミンDがヒトの結核に対する抵抗性に重要な役割を果たしていることを示す証拠となっている。ビタミンDは、200年以上前から結核対策に使用されてきた。 ビタミンDの主要な供給源であるタラの肝油とカルシフェロールは、17世紀以来、結核患者の治療に使われてきた . 通常の生理では、日光に当たった後、皮膚に蓄えられていた7-デヒドロコレステロールがプレビタミンD3に変換され、続いて熱異性化によりビタミンD3が生成される . 次に、ビタミンD3は肝臓で水酸化され、25-ヒドロキシビタミンD3 (25(OH)D3) となる。 さらに、25(OH)D3は1-水酸化酵素（CYP27B1）により、最も活性の高い1,25(OH)2D3へと水酸化される。 腎尿細管上皮細胞は、1-水酸化酵素の主要な供給源であり、血清中の1,25(OH)2D3濃度を決定する上で重要な役割を担っている . 腎外組織における CYP27B1 の存在は、数十年前から認識されています。 しかし、1,25(OH)2D3の血清濃度に対する腎外CYP27B1の影響については、まだ明らかにされていない。 患者は2日前から疲労を伴う筋力低下を経験し、かかりつけ医を受診した。 血液生化学検査で電離カルシウム値が5.44 mg/dLと高値であった。 高カルシウム血症であったが，通常の治療で症状は軽快した． 4ヵ月後、患者は発熱を伴う進行性の筋力低下を経験した。 ERでは、再びイオン化カルシウム値の上昇（6.88mg/dL）が認められた。 さらに，心電図で心拍の異常とT波の広がりを伴うQT間隔の短縮が認められた． 胸部X線では右上葉の肺浸潤を認め、後に肺結核と判定された。 その後，9ヶ月の抗結核治療を行った． 治療後4カ月でイオン化カルシウム値は正常化（5.2mg/dL）し、症状は完全に消失した。 この患者の高カルシウム血症の病態を解明するために、イオン化カルシウム値に加えて、1,25(OH)2D3値を測定した。 図1に示すように、1,25(OH)2D3値はイオン化カルシウムの値と高い相関があった
腎臓のCYP27B1発現に加え、マクロファージや単球もCYP27B1の重要な腎外発現部位と考えられている。 今回、ビタミンD3の代謝における単球の役割をex vivoのバイオアッセイを用いて評価した。 さらに、単球をMTB由来の抗原で刺激し、単球が細菌チャレンジに応答してビタミンD3代謝を調節する仕組みについてさらに理解を深めた
2. 材料と方法
2.1. 対象者
この研究は高雄医学大学で行われた。 参加者は2群に層別された。 (1)活動性結核と(2)結核の頻回接触者である。 喀痰培養と胸部フィルムで活動性肺結核と確認された者は活動性結核群()に割り当てられた。 頻繁な結核接触者（）は以下の通りであった。 (1）結核センターで10年以上勤務し，感染経験のない医療スタッフ，（2）結核患者の家族，臨床医，看護師で，結核患者と長期にわたって接触し，感染経験のない者． 頻繁に結核と接触する人はすべてBCGの接種を受けており、年1回胸部X線検査を受け、胸部フィルムに異常がある場合はマントー検査を行った。 糖尿病、悪性腫瘍、その他免疫不全を引き起こす可能性のある疾患を持つ被験者は除外した。 2つのグループは性差と年齢をマッチさせた（表1）。
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| 疾患期間は診断から血液採取までの間隔として定義されました。 | ||||||||||||||||||||||||||||||||
2.2.1 研究参加者の性別と年齢
2.2.1 研究参加者の性別と年齢
研究参加者の性別と年齢
末梢血単核細胞(PBMC)は、2群のドナーから採取したヘパリン処理血液から、標準的なFicoll-Paque (Pharmacia, Uppsala, Sweden) gradientを用いて分離された。 PBMCs ( cells/mL)をL-グルタミンと10%ウシ胎児血清を補充したRPMI1640培地に再懸濁した。 75 cm2フラスコを37℃、5% CO2インキュベーターで1時間培養した後、非接着細胞を含む培地をコニカルチューブにデカントし、フラスコを無血清培地で2回洗浄して残留する非接着細胞をすべて除去した。 付着した単球は、プラスチック製のセルスクレーパーで穏やかに掻き取ることで除去した。 この細胞をコニカルチューブに移し、遠心分離して洗浄液を除去し、補充した培地中にcells/mLまで再懸濁した。 付着細胞集団は、85%以上のCD14+細胞を含んでいた。
2.3. 抗原
結核患者から分離したMTBをリン酸緩衝生理食塩水に再懸濁し、ウォーターバスで70℃、70分間加熱殺菌した。 その後、New Highway sonicator (Farmingdale, NY, USA) を用いて菌体を超音波処理した。 細菌ホモジネートのタンパク質濃度は、Pierce BCA protein assay kit (IL, USA)を用いて測定し、-20℃で保存した。
2.4. Cytofluorometric Analysis
Cytometric Analysisは、FACSサイトメーター（Becton Dickinson）を用いて実施した。 全細胞を50μLの染色バッファー（Hank’s balanced salt solution: 1% BSA and 0.1% sodium azide）中で飽和量の各モノクローナル抗体とともに室温で1時間インキュベートし、PBSで3回洗浄を行った。 PBS中の1％パラホルムアルデヒド500μLに懸濁し、分析用に調製した。 単球集団は、サイドスキャッターとフォワードスキャッターのドットプロットに基づき、分析のためにゲーティングされた。 各分析に合計5,000個のゲーティングされた細胞を使用した。 ゲーティングされた細胞は、フルオレセイン・イソチオシアネート（FITC）結合抗CD14（Ancell）を用いた蛍光染色によってさらに分析された。
2.5. 1，25（OH）2D3の定量＜3281＞＜8894＞精製単球を96ウェル組織培養プレートの各ウェルに100μLずつ、200nMの25（OH）D3を1％エタノール終濃度にて溶解し、細胞／mlの密度で培養した。 3時間培養後、1 mLのアセトニトリルを加えて反応を停止させた。 細胞および培地を採取し、等容量のメタノールと合わせて脂質を除去した。 1,25(OH)2D3 の量は 1,25-dihydroxyvitamin D 125I RIA kit (INCSTAR, Stillwater, MN, USA) を用いて測定した。 簡単に説明すると、2 mLの水と5 mLのメタノール/水（70 : 30）をC18OHカートリッジに加え、真空下で塩類、極性脂質、色素を除去した。 次に、C18OHカートリッジにヘキサン／塩化メチレン（90 : 10）5mLを加えて25(OH)D3を除去し、ヘキサン／イソプロパノール（99 : 1）5mLを加えて24，25（OH）2D3／25，25（OH）2D3が除去された。 各C18OHカートリッジは、シリカカートリッジ内に密に装着した。 真空下でヘキサン／イソプロパノール（92：8）を添加した後、C18OHカートリッジを取り出した。 最後に、精製した1,25(OH)2D3を5 mLのヘキサン/イソプロパノール(80 : 20)でシリカカートリッジから溶出させた。 1,25(OH)2D3のレベルは、125I標識抗1,25(OH)2D3および抗1,25(OH)2D3抗体を用いた競合ラジオイムノアッセイ（RIA）によって定量した＜1789＞ ＜795＞2.6. MTB抗原による処理＜3281＞＜8894＞単球（cells／mL）を10μg／mLのMTBおよび200ng／mLの25（OH）D3とともにインキュベートした。 3時間培養後、1mLのアセトニトリルを加え、反応を停止させた。 得られた1,25(OH)2D3を細胞および培地から精製し、RIAで定量した。 残りの手順は、前のアッセイと同じであった
2.7. 統計解析
すべてのデータはStudentの-testを使用して分析された。 結果
3.1. 活動性結核および尿毒症患者におけるイオン化カルシウムおよび1,25ジヒドロキシビタミンD3濃度
初診時から抗結核治療終了後1年までの各時点で血清イオン化カルシウムおよび1,25(OH)2D3濃度を測定した。 図1に示すように、イオン化カルシウムの濃度は1,25(OH)2D3の濃度と相関がありました（図1）
3.2. 研究対象者
25名を頻回結核接触群に、25名を活動性結核群に募集した。 平均年齢と性比は両群間で有意な差はなかった。 データセットの特徴を表1に示す
3.3. 1,25(OH)2D3 Quantitation
単球を25(OH)D3と共に3時間培養した。 その後、細胞および培地から1,25(OH)2D3を精製し、RIAで測定した。 図2に示すように、結核活性群の1,25(OH)2D3量はpg/mL（平均±SD）であり、結核接触頻回群（）（）に比べて有意に高い値を示していた。 単球をMTBと25(OH)D3と同時に3時間インキュベートした場合、活動性結核群の1,25(OH)2D3量はMTB無添加群と比較して著しく減少した( および , resp.) () （図3参照) 。 また、頻回結核接触者群では、MTBへの曝露の有無による単球の差は認められなかった（、、、）
図2
活動性結核患者および頻回結核接触者の 1,25(OH)2D3 定量値． 25(OH)D3と3時間培養した単球懸濁液から精製した1,25(OH)2D3をRIA測定した。 活動性結核群の1,25(OH)2D3量は、結核頻回接触者群に比べ有意に高かった。 各列は1,25(OH)2D3定量の平均を表す。 エラーバーは標準偏差を表す。 *.
図3
M. tuberculosis（MTB）抗原を有するまたは有さない活動性TB患者および頻繁なTBコンタクトにおける1，25（OH）2D3の定量の結果。 単球に25(OH)D3をパルスし，MTB抗原の有無にかかわらず，1.25(OH)2D3を定量した。 MTB曝露による1,25(OH)2D3量は、活動性結核患者群ではMTB非曝露時に比べ有意に減少した。 各列は1,25(OH)2D3定量の平均を表す。 エラーバーは標準偏差を表す。 *.
4.Discussion
肺結核の尿毒症患者において、1,25(OH)2D3レベルがイオン化カルシウムレベルと相関することが観察された。 活動性の肺結核では、この患者の1,25(OH)2D3の血清レベルは高く、その結果、イオン化カルシウムのレベルも高く誘導されることが確認された。 治療後、1,25(OH)2D3およびイオン化カルシウムのレベルはともに低下した。 理論的には、尿毒症患者において、腎臓のCYP27B1活性は些細なものである。 血清 1,25(OH)2D3 濃度が低いことは、尿毒症患者においてしばしば観察される。 ヒトで観察されたことと同様に、無脾マウスモデルにおいても、低い1,25(OH)2D3レベルが観察される . しかし、CYP27B1 の腎外への供給源については、60 年以上前から報告されている。 Harrell と Fisher は、病的状態における 1,25(OH)2D3 の副腎外合成を最初に見いだした。 これらの著者らは、カルシウムのホメオスタシスの異常とサルコイドーシスとの関連性を確立した。 その後、これらの患者群では、組織マクロファージが1,25(OH)2D3産生の副腎外供給源であることが明らかにされた。 皮膚メラノサイト、組織マクロファージ、胎盤の残留細胞など、異なる研究グループによって CYP27B1 を発現する組織の数が増加していることが明らかにされました . 驚くべきことに、CYP27B1 を発現しているすべての細胞が酵素活性を有しているわけではありません。 循環単球が 1,25(OH)2D3 の高値に寄与している可能性を明らかにするために、25(OH)D3 を基質とする ex vivo バイオアッセイを利用して CYP27B1 の活性を測定した。 その結果、活動性結核患者の単球におけるCYP27B1活性は、結核と頻繁に接触する人の単球における活性よりも有意に高いことが明らかになった。 循環単球は、25(OH)D3からより活性の高い1,25(OH)2D3への変換に寄与しているのである。 興味深いことに、ビタミンD3は伝統的に内分泌因子であると考えられてきた。局所（尿細管）で産生された1,25(OH)2D3は血液によって運ばれ、例えば骨など、他の組織や器官に影響を及ぼす。 しかし、ここ数十年の間に、ビタミンD3は内分泌以外の役割も果たすことが明らかになった。 炎症細胞が産生する1,25(OH)2D3は、隣接する細胞と炎症細胞自身のビタミンD受容体の発現を刺激することができる。 ビタミンD受容体およびレチノイド受容体に結合することで、リガンドと受容体の複合体は、多くの炎症性遺伝子のプロモーターに結合することができる 。 このような作用から、ビタミンD3はパラクラインとオートクラインの両方の機能を持つと考えられていた。 ビタミンD3は、カルシウム調節因子としての内分泌機能とは対照的に、パラクラインおよびオートクライン機能は、炎症性細胞の抗菌ペプチド産生を誘導し、オートファジーのプロセスを増大させる。 1,25(OH)2D3は局所的に産生され、カルシウムの恒常性調節の標的部位に運ばれないため、その産生が血清カルシウム値に影響を与えることはない。 興味深いことに、本研究では、単球が産生する1,25(OH)2D3は特別なケースであることを見出した。 単球が産生する1,25(OH)2D3は局所的に作用することができるが、この細胞は血液によって全身の組織に運ばれているのである。 単球が産生する1,25(OH)2D3は、内分泌因子としてもふるまうのである。 単球は、ビタミンD3のエンドクリン、パラクリン、オートクリン機能を制御できる唯一の細胞なのかもしれない。 興味深い問題は、1,25(OH)2D3の総量に対する単球の1,25(OH)2D3供給源の相対的寄与が何であるかということである。 Dussoらは、単球からの1,25(OH)2D3の最大生産量は、通常の1,25(OH)2D3濃度（単位：pmol/mL）と比較して、ごくわずか（fmole/時間/マイクログラムDNA）であると観察している。 しかし、このデータはex vivo実験のものであり、体内のどれだけの単球が刺激を受けて1,25(OH)2D3を産生するかは分からない。 我々は、1,25(OH)2D3の総量に対する単球の供給源の相対的寄与は、ほとんどの状況において小さいと推測している。 肉芽腫性疾患であっても、高濃度の1,25(OH)2D3に起因する高カルシウム血症の臨床症状を示す患者はごくわずかである。 また、活動性結核患者の単球にMTB抗原を加えて培養すると、抗原を加えない場合に比べ、1,25(OH)2D3転換率が有意に低くなることを見出した。 結核接触頻度の高い群では、MTB抗原の有無による差はなかった。 この観察には、2つの説明が可能である。 第一に、活動性結核患者のプライミング単球は、MTB抗原でさらに刺激すると、1,25(OH)2D3をカルシトロ酸に活発に水酸化する24（OH）水酸化酵素（CPY24）活性を相手より多く誘導できる。ビタミンD3は炎症遺伝子生成だけでなくCPY24の発現を誘導する 。 CPY24 はビタミン D3 の主要な異化酵素である。 CYP27B1 と CYP24 の活性は正反対に調節され、血清中の 1,25(OH)2D3 レベルを制御している 。 この協働作用により、高カルシウム血症はほとんど観察されない。 結核頻回接触群は、さらに優れた協調作用を示し、そのため、MTB抗原で刺激しても1,25(OH)2D3換算値に変化がなかった。 第二の説明は、単球がMTB抗原で再刺激されるとCPY27B1活性が枯渇することである。
mRNA expressionは、以下の理由で本研究では測定されなかった。 まず、ex vivoバイオアッセイに参加者の単球が大量に必要であった。 定量的 mRNA 発現と ex vivo バイオアッセイの両方を実施した場合、各参加者から 30 mL 以上の血液を採取する必要があったはずである。 この量の血液を採取することは、倫理委員会から拒否された。 第二に、先に述べたように、組織によっては酵素活性が検出されずに CYP27B1 が発現している場合がある。mRNA レベルと酵素活性は必ずしも相関していない。 CYP27B1 が発現しているにもかかわらず、酵素活性が検出されない組織があった。 今後、CYP27B1、CYP24のレベル、およびビタミンD3の代謝物であるカルシトロ酸や24,25（OH）2D3のレベルを定量化し、結核の病態生理過程におけるビタミンD3代謝を明らかにする必要があると思われる。
5. 結論
結論として、結核に感染した尿毒症患者において、カルシウム値と1,25(OH)2D3値は相関があった。 さらに、単球のCYP27B1活性は結核接触頻度の高い患者よりも活動性結核患者で高いことがわかった。
倫理的承認
この研究プロジェクトは高雄医学大学病院の施設審査委員会によって承認された。 承認番号はKMUH-IRB-20130103である。
利益相反
著者はこの論文に利益相反がないことを宣言する。
著者の貢献
イーチンタンとウェン-チャンツアイは実験を実施し論文を執筆した。 Tsan-Teng OuとWen-Chan Tsaiは研究の設計と標本の収集を行った。 最終論文は全執筆者が読み、承認した
。
末梢血単核細胞(PBMC)は、2群のドナーから採取したヘパリン処理血液から、標準的なFicoll-Paque (Pharmacia, Uppsala, Sweden) gradientを用いて分離された。 PBMCs ( cells/mL)をL-グルタミンと10%ウシ胎児血清を補充したRPMI1640培地に再懸濁した。 75 cm2フラスコを37℃、5% CO2インキュベーターで1時間培養した後、非接着細胞を含む培地をコニカルチューブにデカントし、フラスコを無血清培地で2回洗浄して残留する非接着細胞をすべて除去した。 付着した単球は、プラスチック製のセルスクレーパーで穏やかに掻き取ることで除去した。 この細胞をコニカルチューブに移し、遠心分離して洗浄液を除去し、補充した培地中にcells/mLまで再懸濁した。 付着細胞集団は、85%以上のCD14+細胞を含んでいた。
2.3. 抗原
結核患者から分離したMTBをリン酸緩衝生理食塩水に再懸濁し、ウォーターバスで70℃、70分間加熱殺菌した。 その後、New Highway sonicator (Farmingdale, NY, USA) を用いて菌体を超音波処理した。 細菌ホモジネートのタンパク質濃度は、Pierce BCA protein assay kit (IL, USA)を用いて測定し、-20℃で保存した。
2.4. Cytofluorometric Analysis
Cytometric Analysisは、FACSサイトメーター（Becton Dickinson）を用いて実施した。 全細胞を50μLの染色バッファー（Hank’s balanced salt solution: 1% BSA and 0.1% sodium azide）中で飽和量の各モノクローナル抗体とともに室温で1時間インキュベートし、PBSで3回洗浄を行った。 PBS中の1％パラホルムアルデヒド500μLに懸濁し、分析用に調製した。 単球集団は、サイドスキャッターとフォワードスキャッターのドットプロットに基づき、分析のためにゲーティングされた。 各分析に合計5,000個のゲーティングされた細胞を使用した。 ゲーティングされた細胞は、フルオレセイン・イソチオシアネート（FITC）結合抗CD14（Ancell）を用いた蛍光染色によってさらに分析された。
2.5. 1，25（OH）2D3の定量＜3281＞＜8894＞精製単球を96ウェル組織培養プレートの各ウェルに100μLずつ、200nMの25（OH）D3を1％エタノール終濃度にて溶解し、細胞／mlの密度で培養した。 3時間培養後、1 mLのアセトニトリルを加えて反応を停止させた。 細胞および培地を採取し、等容量のメタノールと合わせて脂質を除去した。 1,25(OH)2D3 の量は 1,25-dihydroxyvitamin D 125I RIA kit (INCSTAR, Stillwater, MN, USA) を用いて測定した。 簡単に説明すると、2 mLの水と5 mLのメタノール/水（70 : 30）をC18OHカートリッジに加え、真空下で塩類、極性脂質、色素を除去した。 次に、C18OHカートリッジにヘキサン／塩化メチレン（90 : 10）5mLを加えて25(OH)D3を除去し、ヘキサン／イソプロパノール（99 : 1）5mLを加えて24，25（OH）2D3／25，25（OH）2D3が除去された。 各C18OHカートリッジは、シリカカートリッジ内に密に装着した。 真空下でヘキサン／イソプロパノール（92：8）を添加した後、C18OHカートリッジを取り出した。 最後に、精製した1,25(OH)2D3を5 mLのヘキサン/イソプロパノール(80 : 20)でシリカカートリッジから溶出させた。 1,25(OH)2D3のレベルは、125I標識抗1,25(OH)2D3および抗1,25(OH)2D3抗体を用いた競合ラジオイムノアッセイ（RIA）によって定量した＜1789＞ ＜795＞2.6. MTB抗原による処理＜3281＞＜8894＞単球（cells／mL）を10μg／mLのMTBおよび200ng／mLの25（OH）D3とともにインキュベートした。 3時間培養後、1mLのアセトニトリルを加え、反応を停止させた。 得られた1,25(OH)2D3を細胞および培地から精製し、RIAで定量した。 残りの手順は、前のアッセイと同じであった
2.7. 統計解析
すべてのデータはStudentの-testを使用して分析された。 結果
3.1. 活動性結核および尿毒症患者におけるイオン化カルシウムおよび1,25ジヒドロキシビタミンD3濃度
初診時から抗結核治療終了後1年までの各時点で血清イオン化カルシウムおよび1,25(OH)2D3濃度を測定した。 図1に示すように、イオン化カルシウムの濃度は1,25(OH)2D3の濃度と相関がありました（図1）
3.2. 研究対象者
25名を頻回結核接触群に、25名を活動性結核群に募集した。 平均年齢と性比は両群間で有意な差はなかった。 データセットの特徴を表1に示す
3.3. 1,25(OH)2D3 Quantitation
単球を25(OH)D3と共に3時間培養した。 その後、細胞および培地から1,25(OH)2D3を精製し、RIAで測定した。 図2に示すように、結核活性群の1,25(OH)2D3量はpg/mL（平均±SD）であり、結核接触頻回群（）（）に比べて有意に高い値を示していた。 単球をMTBと25(OH)D3と同時に3時間インキュベートした場合、活動性結核群の1,25(OH)2D3量はMTB無添加群と比較して著しく減少した( および , resp.) () （図3参照) 。 また、頻回結核接触者群では、MTBへの曝露の有無による単球の差は認められなかった（、、、）
4.Discussion
肺結核の尿毒症患者において、1,25(OH)2D3レベルがイオン化カルシウムレベルと相関することが観察された。 活動性の肺結核では、この患者の1,25(OH)2D3の血清レベルは高く、その結果、イオン化カルシウムのレベルも高く誘導されることが確認された。 治療後、1,25(OH)2D3およびイオン化カルシウムのレベルはともに低下した。 理論的には、尿毒症患者において、腎臓のCYP27B1活性は些細なものである。 血清 1,25(OH)2D3 濃度が低いことは、尿毒症患者においてしばしば観察される。 ヒトで観察されたことと同様に、無脾マウスモデルにおいても、低い1,25(OH)2D3レベルが観察される . しかし、CYP27B1 の腎外への供給源については、60 年以上前から報告されている。 Harrell と Fisher は、病的状態における 1,25(OH)2D3 の副腎外合成を最初に見いだした。 これらの著者らは、カルシウムのホメオスタシスの異常とサルコイドーシスとの関連性を確立した。 その後、これらの患者群では、組織マクロファージが1,25(OH)2D3産生の副腎外供給源であることが明らかにされた。 皮膚メラノサイト、組織マクロファージ、胎盤の残留細胞など、異なる研究グループによって CYP27B1 を発現する組織の数が増加していることが明らかにされました . 驚くべきことに、CYP27B1 を発現しているすべての細胞が酵素活性を有しているわけではありません。 循環単球が 1,25(OH)2D3 の高値に寄与している可能性を明らかにするために、25(OH)D3 を基質とする ex vivo バイオアッセイを利用して CYP27B1 の活性を測定した。 その結果、活動性結核患者の単球におけるCYP27B1活性は、結核と頻繁に接触する人の単球における活性よりも有意に高いことが明らかになった。 循環単球は、25(OH)D3からより活性の高い1,25(OH)2D3への変換に寄与しているのである。 興味深いことに、ビタミンD3は伝統的に内分泌因子であると考えられてきた。局所（尿細管）で産生された1,25(OH)2D3は血液によって運ばれ、例えば骨など、他の組織や器官に影響を及ぼす。 しかし、ここ数十年の間に、ビタミンD3は内分泌以外の役割も果たすことが明らかになった。 炎症細胞が産生する1,25(OH)2D3は、隣接する細胞と炎症細胞自身のビタミンD受容体の発現を刺激することができる。 ビタミンD受容体およびレチノイド受容体に結合することで、リガンドと受容体の複合体は、多くの炎症性遺伝子のプロモーターに結合することができる 。 このような作用から、ビタミンD3はパラクラインとオートクラインの両方の機能を持つと考えられていた。 ビタミンD3は、カルシウム調節因子としての内分泌機能とは対照的に、パラクラインおよびオートクライン機能は、炎症性細胞の抗菌ペプチド産生を誘導し、オートファジーのプロセスを増大させる。 1,25(OH)2D3は局所的に産生され、カルシウムの恒常性調節の標的部位に運ばれないため、その産生が血清カルシウム値に影響を与えることはない。 興味深いことに、本研究では、単球が産生する1,25(OH)2D3は特別なケースであることを見出した。 単球が産生する1,25(OH)2D3は局所的に作用することができるが、この細胞は血液によって全身の組織に運ばれているのである。 単球が産生する1,25(OH)2D3は、内分泌因子としてもふるまうのである。 単球は、ビタミンD3のエンドクリン、パラクリン、オートクリン機能を制御できる唯一の細胞なのかもしれない。 興味深い問題は、1,25(OH)2D3の総量に対する単球の1,25(OH)2D3供給源の相対的寄与が何であるかということである。 Dussoらは、単球からの1,25(OH)2D3の最大生産量は、通常の1,25(OH)2D3濃度（単位：pmol/mL）と比較して、ごくわずか（fmole/時間/マイクログラムDNA）であると観察している。 しかし、このデータはex vivo実験のものであり、体内のどれだけの単球が刺激を受けて1,25(OH)2D3を産生するかは分からない。 我々は、1,25(OH)2D3の総量に対する単球の供給源の相対的寄与は、ほとんどの状況において小さいと推測している。 肉芽腫性疾患であっても、高濃度の1,25(OH)2D3に起因する高カルシウム血症の臨床症状を示す患者はごくわずかである。 また、活動性結核患者の単球にMTB抗原を加えて培養すると、抗原を加えない場合に比べ、1,25(OH)2D3転換率が有意に低くなることを見出した。 結核接触頻度の高い群では、MTB抗原の有無による差はなかった。 この観察には、2つの説明が可能である。 第一に、活動性結核患者のプライミング単球は、MTB抗原でさらに刺激すると、1,25(OH)2D3をカルシトロ酸に活発に水酸化する24（OH）水酸化酵素（CPY24）活性を相手より多く誘導できる。ビタミンD3は炎症遺伝子生成だけでなくCPY24の発現を誘導する 。 CPY24 はビタミン D3 の主要な異化酵素である。 CYP27B1 と CYP24 の活性は正反対に調節され、血清中の 1,25(OH)2D3 レベルを制御している 。 この協働作用により、高カルシウム血症はほとんど観察されない。 結核頻回接触群は、さらに優れた協調作用を示し、そのため、MTB抗原で刺激しても1,25(OH)2D3換算値に変化がなかった。 第二の説明は、単球がMTB抗原で再刺激されるとCPY27B1活性が枯渇することである。
mRNA expressionは、以下の理由で本研究では測定されなかった。 まず、ex vivoバイオアッセイに参加者の単球が大量に必要であった。 定量的 mRNA 発現と ex vivo バイオアッセイの両方を実施した場合、各参加者から 30 mL 以上の血液を採取する必要があったはずである。 この量の血液を採取することは、倫理委員会から拒否された。 第二に、先に述べたように、組織によっては酵素活性が検出されずに CYP27B1 が発現している場合がある。mRNA レベルと酵素活性は必ずしも相関していない。 CYP27B1 が発現しているにもかかわらず、酵素活性が検出されない組織があった。 今後、CYP27B1、CYP24のレベル、およびビタミンD3の代謝物であるカルシトロ酸や24,25（OH）2D3のレベルを定量化し、結核の病態生理過程におけるビタミンD3代謝を明らかにする必要があると思われる。
5. 結論
結論として、結核に感染した尿毒症患者において、カルシウム値と1,25(OH)2D3値は相関があった。 さらに、単球のCYP27B1活性は結核接触頻度の高い患者よりも活動性結核患者で高いことがわかった。
倫理的承認
この研究プロジェクトは高雄医学大学病院の施設審査委員会によって承認された。 承認番号はKMUH-IRB-20130103である。
利益相反
著者はこの論文に利益相反がないことを宣言する。
著者の貢献
イーチンタンとウェン-チャンツアイは実験を実施し論文を執筆した。 Tsan-Teng OuとWen-Chan Tsaiは研究の設計と標本の収集を行った。 最終論文は全執筆者が読み、承認した
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