Abstract
皮膚黒色腫患者のサブセットにBRAF変異があることが最初に発見されてから、BRAF変異の病的影響を決定し、変異を同定する診断技術を最適化し、変異を有する腫瘍においてこの標的の機能を阻害する治療介入法を開発することがかなりの研究課題となった。 近年、BRAF変異メラノーマ患者に対する標準的な治療法に革命をもたらす進歩があった。 本論文では、変異型BRAFシグナルの病原性、BRAF変異を検出する最新の分子検査法、およびメラノーマとBRAF変異を有する患者におけるBRAF経路阻害薬の最新の臨床データについて概説する。 最後に、BRAF阻害剤に対する新たな耐性メカニズムと、この耐性を克服する方法について議論する＜370＞ ＜6983＞1. はじめに
メラノーマは現在、アメリカ人男性および女性にそれぞれ5番目と7番目に多いがんである 。 さらに、メラノーマの発生率は過去60年間で劇的に上昇し、他のすべての固形がんよりも速く増加している。 早期の患者の大部分は外科的切除でうまく治療できるが、多くは播種性疾患を発症する。 標準治療にもかかわらず、IV期の患者の95%以上は5年以内に死亡し、ほとんどの患者は1年以内に死亡する。
最近では、前臨床での発見により、黒色腫の発症の基礎となる重要な分子シグナル伝達事象の理解が著しく進んでいる。 最も注目すべきは、メラノサイト由来の腫瘍の高い割合で、BRAFの活性化変異を保有し、その構成的な活性につながることが示されていることである。 後天性メラノサイト母斑の約70-80％、悪性黒色腫の40-60％がBRAF変異を有し、その大部分はコドン600のアミノ酸が1つ変化したもの（BRAFV600E）である。 その結果、細胞外シグナル制御キナーゼ（ERK）の無反応かつ恒常的な活性化により、細胞増殖の促進、アポトーシスの阻害が起こり、最終的にメラノーマに変化する。 しかし、このシグナル伝達の亢進は、BRAF経路の様々なメディエーターを標的とする低分子阻害剤の使用に対して変異細胞を感受性にする。
2 RAFシグナル伝達とメラノーマの発症
成長因子受容体とそのリガンド間の相互作用は、通常、細胞の成長と生存を促す一連のイベントを誘発する。 RASファミリーは、このようなシグナル伝達の重要なメディエーターとして働くGTPaseである。 RASは正常な細胞のターンオーバー、死、生存のホメオスタシスにおいて重要な役割を果たしているが、RASファミリーメンバー（HRAS、KRAS、NRAS）の活性化変異は、様々なヒトの悪性腫瘍と関連して同定されてきた。 メラノーマでは、NRAS 変異が腫瘍サンプルの10-25%で同定されており、これらの患者における発癌の重要なドライバーであると考えられている 。 発がんは、いくつかの下流シグナル伝達メカニズム、特にマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（MAPK）およびフォスファチジルイノシトール-3-キナーゼ（PI3K）経路のアップレギュレーションによって媒介されています。
活性化したRASは、RAFオンコプロテイン（BRAFおよびCRAF）との相互作用を通じてMAPK経路の活性化を引き起こし、進行シグナル伝達カスケードの開始をもたらす 。 変異したNRASからMEKにシグナルを伝達するのがBRAFであるかCRAFであるかは不明であるが、CRAFが主要なメディエーターであることを示唆する証拠が圧倒的に多い . RAF は MAPK/ERK キナーゼ（MEK）と相互作用し、それによって MEK のリン酸化を開始し、次に ERK の活性化リン酸化を引き起こす。 ERKの活性化は、多くの悪性腫瘍の病態に重要であると思われる、増殖および形質転換シグナルを引き起こす。 この経路は、RAFアイソフォーム、BRAF、CRAFのいずれによっても開始されるが、CRAFは、抗アポトーシス蛋白である核因子κB（NF-κB）およびB細胞白血病2（BCL-2）のアップレギュレーションなどを通して生存促進効果も持っている …。 興味深いことに、CRAFとは異なり、活性化されたBRAFは他に既知の基質を持たない。 したがって、BRAF 変異メラノーマは、MEK とそれに続く ERK を介してのみシグナルを発 現し、発癌に至る。 この特徴により、これらの腫瘍はMAPK経路の強力な阻害剤に対して極めて高い感受性を示します。 診断／検出
メラノーマにおけるBRAFの活性化変異が同定されて以来、検出技術は劇的に改善されました。 腫瘍組織におけるBRAFの標準的な変異検査は、一般に、市販されており高い特異性を提供する双方向性直接蛍光シーケンシングおよび対立遺伝子特異的ポリメラーゼ連鎖反応のような技術を利用している。 しかし、これらのアッセイの感度は、遺伝子解析のために提出された検体のうち、腫瘍細胞が＜5878＞5-10％を占める場合にのみ変異を検出することができるという点で限界がある。 この程度の感度は、均一な腫瘍結節におけるBRAFV600E突然変異の存在を検出するには通常十分であるが、高率の間質性またはリンパ性要素、浸潤リンパ球、または末梢血細胞の背景における少数の腫瘍細胞を検出するには十分な感度ではないようである。
Amplification Refractory mutation systems (ARMSs) は最近報告された、ホルマリン固定パラフィン包埋 (FFPE) 組織の標準DNA配列決定と比較して感度が高い（変異細胞を1％含む変異サンプルを検出可能）アレル特有技術である。 変異検出の感度を大幅に向上させるもう一つのアプローチは、サンプル中の変異DNA/RNAを選択的に増幅するアッセイを利用することである。 対立遺伝子特異的プライマーとロックされた核酸プライマーを組み合わせて使用すると、1mLの血液から10個のメラノーマ細胞を検出することができることが報告されている。 変異の検出感度を上げるための第三のアプローチは、野生型アレルのユニークな制限酵素部位を利用して、1000個の非変異細胞に1個の変異細胞を検出することができると報告されており、これにより野生型アレルを消化し、変異アレルを濃縮することができる。 最後に、COLD-PCRを組み込むことにより、FFPE組織からのBRAF変異の検出において、標準的なシークエンスとパイロシーケンスを用いた場合の2倍近い感度を実現しました。
変異検出の感度向上につながる新技術（ARMS）やルーチン手法の変更に加え、以前は検査されていなかったサンプルに標準アッセイを適用することで、BRAF検査のアプローチも変化しています。 血清や血漿中の遊離 DNA を用いた BRAF 解析や、分離された循環腫瘍細胞（CTC）からの BRAF 変異の検出が報告されている。 CTC、血清および血漿中のBRAF分析は可能であると思われるが、これらのアッセイの1つ以上が日常的に臨床使用されるか、あるいは実験的アプローチにとどまるかは、まだ決定されてはいない。
標準的および実験的分子診断学の役割は、組織または血液の両方で、関心のある特定の変異（すなわち、BRAFV600E）を識別するために利用されているが、これらは特定の治療に対する感受性を示すことがあるので、他の変異や異常を検査することも価値があるかもしれない。 例えば、シーケノム社の MassARRAY テクノロジーは、プライマー伸長反応と質量分析を用いて生成物を検出し、臨床的に影響を及ぼす可能性のある変異を特定することで、より大規模な発癌性変異のパネルを照会するために使用されている。 Array comparative genome hybridization (aCGH) は、ゲノム全体のコピー数の変化を調べる機会を提供し、標的治療に対する感度を与える可能性のある増幅や欠失の両方を含んでいます。 しかし、これらの技術はすべて、既知の、あらかじめ選択された異常しか特定できないという点で明らかに限界がある。 全ゲノム解析（WGA）は、これらの手法や検査のすべてまたは大部分を単一の技術プラットフォームに統合するだけでなく、これらの他のアッセイの設計パラメータの外にある追加の遺伝子変化を同定する可能性を持っている。 また、WGA は、メラノーマゲノムにおけるこれまで知られていなかった（おそらく患者固有の）変異を発見する機会を提供し、変異や多型の特定のプロファイルが特定の治療（例：BRAF 阻害剤、HD IL-2）による利益を予測できるかどうかを調査するものである。 370>
4. RAFシグナル阻害剤（変異型BRAF、CRAF、MEK、ERK阻害剤を含む）
BRAFV600E, その他の変異型 BRAF（600, 601位）、およびCRAFに対して選択性の異なる一連の低分子阻害剤が開発されている。 さらに、RAF活性化の下流メディエーターであるMEKとERKの阻害剤も開発されている。 本項では、臨床試験が行われ、公表されている薬剤についてのみ解説する
5. BRAF阻害剤
5.1. ソラフェニブ
BRAF、CRAF、血小板由来成長因子受容体（PDGFR）、血管内皮成長因子受容体（VEGFR）2、p38、CKITのマルチターゲット型チロシンキナーゼ阻害剤であるソラフェニブは、BRAF突然変異が最初に報告された年に第2相試験が可能になり、黒色腫患者で最初に活発に研究されたRAF-阻害剤である。 残念ながら、単剤および化学療法との併用で多くの第I、II、III相試験で評価されているにもかかわらず、ソラフェニブの臨床的有用性は期待はずれでした。 例えば、 ソラフェニブの単剤試験では、 メラノーマ患者の無増悪生存期間の中央値は 11 週間でした。 6 名の患者（16％）が 6 ヵ月後に安定した病勢を示し、場合によっては 12 ヵ月以上持続した。 しかし、本試験に参加した37名の患者のうち、実際にRECIST-(Response Evaluation criteria in solid tumor)で定義された腫瘍反応を示したのは1名のみであった。
この研究の後、ソラフェニブと様々な細胞障害性薬剤を併用した試験がいくつか行われましたが、最もよく研究された組み合わせは、ソラフェニブとカルボプラチン、パクリタキセルの組み合わせでした。 このレジメンで最初に期待されたのは、 ソラフェニブとカルボプラチン、 パクリタキセルを併用した固形癌患者 24 名の第 I 相試験でした。 10人のメラノーマ患者（42％）が客観的奏効を達成し、さらに11人（46％）の患者がRECISTに基づく病勢安定を示しました。 無増悪生存期間の中央値は43.7週間であった。 これらの有望な結果から、テモゾロミドまたはDTIC療法後に進行したメラノーマ患者を対象に、カルボプラチン／パクリタキセル±ソラフェニブを比較する第III相試験が実施されました。 この試験（PRISM試験）には270人の患者が登録され、この2次治療患者集団ではカルボプラチン／パクリタキセルにソラフェニブを追加しても効果がないことが示されました。 また、米国インターグループ内で実施されたプラセボ対照無作為化第III相試験（E2603）では、治療歴のない進行性黒色腫患者を対象に、カルボプラチン／パクリタキセルとソラフェニブの併用が比較された。 この試験には800名の患者が登録され、PFS中央値またはOS中央値のいずれにおいてもソラフェニブの追加によるベネフィットは認められませんでした。 高活性BRAF阻害剤（PLX4032、GSK2118436）
メラノーマ患者におけるソラフェニブの単剤効果がないことの主な説明として、BRAF、特にV600E変異を持つBRAFを完全に阻害できないことが提案されています。 PLX-4032 や GSK2118436 などの他の BRAF 阻害剤が開発されており、ソラフェニブよりも変異型 BRAF に対して強力かつ選択的な阻害剤となっている 。 このようにBRAFV600Eに対する阻害が強化されたことにより、これらの薬剤の臨床活性がソラフェニブに比べて向上したことは予想されます。
5.3. ベムラフェニブ
ベムラフェニブは、第I相試験を完了し、大きな臨床的利益を示した最初の高活性BRAF阻害剤です。 PLX4032の第I相試験では、BRAFV600E変異を有する腫瘍を有する患者16人のうち、用量漸増段階で240 mg以上1日2回投与した11人に腫瘍反応が見られた一方、野生型BRAFを有する腫瘍を有する患者5人には臨床反応が見られませんでした。 また、拡大コホートにおいて、推奨される第II相用量の1日2回960 mgの投与を受けたBRAFV600E変異メラノーマ患者32人中26人（81%）が臨床効果を示し、そのうち2人は完全奏効（CR）を達成しました。 PFSの中央値は7カ月で、転移性黒色腫に対するこれまでの治療法に比べて良好な結果が得られています。 さらに、ベムラフェニブによる治療は、BRAFV600E変異を有する腫瘍のリン酸化ERK（pERK）レベルを低下させ、臨床反応と関連させます。 おそらく、このpERKの阻害は、プロアポトーシスBCL-2ファミリーメンバーであるBIMのスプライシングを促進し、それによってBRAFV600E細胞のアポトーシスを促進するのでしょう。
これらの知見により、単剤での第II相試験（BRIM2）と無作為化比較第III相試験（BRIM3）が急速に行われるようになった。 第II相試験では、1回の前治療を受けた進行性メラノーマ患者132名が登録されました。 客観的奏効率（ORR）は53％、CR率は5％で、無増悪生存期間は6.7カ月でした。 第III相試験では、進行性メラノーマ患者675人が、ベムラフェニブとダカルバジンのいずれかに無作為に割り付けられ、前治療として実施されました。 最初の中間解析では、ベムラフェニブによる治療は、死亡のリスク（63％減少）または病勢進行のリスク（74％減少）を大幅に減少させ、さらにORR（48％対5％）を大幅に増加させました。 これらの知見は、2011年8月にFDAがvemurafenibを承認する際の基礎となりました。
5.4. GSK2118436
GSK2118436 は、より強力な2番目のBRAF阻害剤で、かなりの臨床活性を示した。 PLX4032と同様の第I/II相試験において、BRAFV600E変異を有する患者に対し、2つの最高用量（150mg 1日2回および200mg 1日2回）を投与したところ、高い奏効率（10/16例、63％）が得られた。 非BRAFV600E変異（V600K、V600G、K601E）を有する8名の患者には、1日2回100 mg以上の投与で、3名に部分奏効が認められました。 BRAFK601Eを有する患者の両名は、最初の再診断後に進行したことから、600位のBRAF変異を有する患者のみが治療に反応することが示唆された。 MEK阻害剤
RAF活性化の下流メディエーターで、BRAFの唯一の基質として知られているMEK阻害剤は、前臨床試験で有望であり、臨床試験も開始されていくつかの心強い結果が得られています。 MEK阻害剤は、BRAFV600E変異を有する患者において最も有用であると考えられる。マウス黒色腫異種移植モデルにおいて、変異の有無はMEK阻害に対する反応性と強く相関しているためである。 AZD6244
進行性固形癌患者を対象としたAZD6244の2つの第1相試験により、この薬剤はメラノーマ患者において忍容性が高く、ある程度の抗腫瘍活性を有していることが示されました。 最初の試験では、AZD6244を投与された進行性メラノーマ患者8人中3人が部分奏効を達成した。 一方、第 2 相試験では、14 名のメラノーマ患者において 1 例のみ奏効が認められましたが、この被験者は発表時点で BRAF 変異が記録されており、2 年以上完全奏効が続いていました。
さらに、AZD6244はマウスモデルで、特に化学療法との併用で有望な結果を示しており、併用試験の舞台を整えています。 これを踏まえて、進行性メラノーマ患者を対象に、AZD6244とダカルバジン、ドセタキセル、テムシロリムスの併用によるパイロット試験が実施されました。 BRAFとNRASの変異状態がわかっている18名の患者さんが治療対象となりました。 BRAF 遺伝子変異を有する 9 例中 5 例（55%）で臨床効果が認められましたが、NRAS 変異を有する 4 例を含む BRAF 遺伝子変異を有さない 9 例では、いずれも臨床効果が認められませんでした。 また、BRAF遺伝子変異がある患者さんでは、ない患者さんと比較して、無増悪期間（中央値：31週間対8週間）が有意に改善しました
6.2. GSK1120212
GSK1120212 は、MEK1/MEK2 の可逆的選択的阻害剤で、第I相試験において、進行したBRAFV600E 変異メラノーマ患者に単剤で有効であることが示された。 特に、GSK2110212を投与されたBRAF変異型メラノーマの患者さん20人中8人が奏効を確認し、2人がCRを達成しました。 興味深いことに、BRAF野生型患者22名のうち2名が治療によりPRを示したことから、一部のメラノーマはBRAF変異がないにもかかわらず、ERK/MAPキナーゼシグナルに依存していることが示唆された
6.3. PD-0325901
PD-0325901の第I相試験には、進行性メラノーマ患者48人が登録され、そのうち3人（6%）がPRを確認し、10人（21%）が4カ月以上病勢安定で、合計15人（31%）がKi-67腫瘍染色の減少を示した …。 なお、これらの患者の変異解析データは提供されていない。 AS703026
同様の結果は、強力なMEK1/2阻害剤であるAS703026でも最近報告されている。 第I相試験では、8人中3人が2つの治療スケジュールのうち1つの治療で部分奏効を示しました . MEK阻害剤の臨床データは心強いものではあるが、かなり予備的なものである。 これらの薬剤の真価は、BRAF変異メラノーマ患者を対象とした第2相および第3相臨床試験を待たなければならない。 現在進行中のそのような試験のひとつに、BRAF変異を有するメラノーマ患者を対象に、GSK1220212と化学療法（ダカルバジンまたはパクリタキセル）を比較する無作為化第III相試験がある（NCIT01245062）。
7 BRAF阻害剤に対する新たな耐性メカニズム
重要なことは、PLX-4032単剤で治療した患者の大多数は、治療初期にBRAFV600Eの阻害に成功し高い客観的奏効率を示したとしても、最終的に疾患の進行を示すと思われることである。 予備的研究では、PLX-4032に対する耐性は、非小細胞肺がん、慢性骨髄性白血病、消化管間質腫瘍などの他の悪性腫瘍の標的治療で注目されている、治療薬とBRAFの結合を阻害する2次変異の発生とは無関係であることが示唆された。
BRAF阻害剤に対する獲得耐性を示すように作られたBRAFV600E変異細胞のin vitro研究により、BRAF変異細胞がどのようにBRAF阻害剤を生き残ることができるのかについての最初の手がかりが得られました。 BRAF阻害剤に対する獲得耐性において、MAPKシグナルの再確立が重要な変数であることは明らかである(BRAF阻害剤に対する獲得耐性)。 これは、受容体チロシンキナーゼ（すなわち、PDGFRB、ERBB2）のアップレギュレーション、RASの活性化、CRAFのアップレギュレーション、 Ser/Thr MAPKキナーゼ（COT）の活性化、および MEKにおける二次活性化変異の発現によって達成することができる。 さらに、インスリン成長因子受容体1（IGF-1R）によって開始されるPI3K経路を介したシグナル伝達も、後天的耐性の代替メカニズムとして報告されている。 注目すべきは、これらのメカニズムのそれぞれが、抵抗性発生時に生検を行った患者の少数の腫瘍サンプルで調査され、裏付けされていることで、これらのアップレギュレートまたは変異したシグナル伝達メディエーターへの依存性は証明されていない。
BRAF阻害剤に対する一次耐性は、vemurafenibで治療したBRAF変異メラノーマ患者の10％未満で見られる。 BRAF阻害剤が効かない患者を特定するのに役立つ臨床サンプルからのデータはありませんが、前臨床研究では、治療前のCRAFレベルの上昇、および下流のサイクリンD1の過剰発現とCDK4発現の増強をもたらす腫瘍のベースラインCCND1増幅が、さらなる調査に値する有望な治療前バイオマーカーであることが示唆されています。
BRAF野生型（BRAFWT）メラノーマ細胞では、ベムラフェニブ（および類似のPLX4720）によりMAPKキナーゼ経路が活性化し、MEKおよびERKのアップレギュレーションと増殖の促進を引き起こします。 これは、BRAFWT 細胞において予想される発がん性の結果をもたらす MEK および ERK を介した下流シグナル伝達と CRAF の活性化によって二次的に起こるようである。 さらに、このCRAFの活性化は、BRAFWTタンパク質および/またはRAS変異細胞で最も明白であるCRAFホモダイマーとのヘテロダイマーの形成によって媒介されるようである。 さらに、PLX4720は、NRAS変異メラノーマ細胞において、MAPK経路を介したシグナル伝達の強化により、抗アポトーシスBCL-2ファミリータンパク質であるMCL-1のレベルを向上させる。 BRAFWTメラノーマ細胞（特にNRAS変異を有する細胞）にvemurafenibやPLX4720などのBRAF阻害剤を投与すると、CRAFの活性化とMAPK経路のシグナル伝達が促進されることは明らかですが、このことの臨床的意義は不明確です。 特に、これまでに解析・報告されたすべての腫瘍でBRAFV600E変異の残存が確認されていることから、例えばベムラフェニブに対する臨床的獲得耐性がBRAFWTメラノーマ細胞のサブセットの増殖のみによって生じるとは考えられていない。 実際、BRAFV600E変異細胞における特異的な変化は、BRAF阻害を継続しても新たな増殖をもたらす適応を可能にするようです。 今後の展望
BRAF選択的阻害剤、およびより少ない程度のMEK阻害剤の単剤効果の確立は、BRAF変異陽性メラノーマ患者の治療にとって大きな飛躍となるものである。 これらの薬剤で治療された患者さんの多くは治療中に進行すると予測されますが、上記の耐性メカニズムの解明は、今後の順次治療や併用治療の指針になります。 選択的BRAF阻害によりMAPK経路の活性がメラノーマで再活性化するという知見に基づき、選択的BRAF阻害剤（GSK2118436）とMEK阻害剤（GSK1120212）の最初の併用試験が進行中で、両剤を通常の単剤用量で投与した場合の忍容性が確認された。 この組み合わせに加えて、選択的BRAF阻害剤とIGF-R1拮抗剤および他の受容体チロシンキナーゼ阻害剤との併用または後続の試験が、前臨床試験の耐性モデルの結果から予想されます。
選択的BRAF阻害剤およびMEK阻害剤の効果を高めるもう一つのアプローチは、アポトーシスを増強する薬剤を加えることである。 そのような薬剤の一つは、現在臨床開発中のBH3-mimeticであるABT-263である。 前臨床試験において、生物学的利用能の低い同種のBH3模倣薬ABT-737をMEK阻害剤と併用すると、どちらかの薬剤単独と比較して致死率が高まった。 ABT-263とMEK阻害剤または選択的BRAF阻害剤の併用が臨床結果を改善するかどうかは不明だが、おそらく初期段階の臨床試験で調べる価値がある。
BRAF選択的阻害によって誘導されるシグナル伝達を阻害したりアポトーシスを促進する分子標的薬の併用療法に加えて、BRAFまたはMEK阻害剤の効果を最大限にするもう一つの有望なアプローチは、これらの薬剤と免疫療法を併用するということである。 近年、抗CTLA-4モノクローナル抗体ipilimumabや抗PDモノクローナル抗体MDX-1106などの免疫チェックポイント阻害剤が、転移性黒色腫患者において単剤で有効性を示しています . 重要なことは、MEK阻害剤がヒトTリンパ球（T細胞）の機能に悪影響を及ぼすのに対し、PLX4032は悪影響を及ぼさないようです。 さらに、ベムラフェニブは、メラノーマにおける抗原特異的T細胞による免疫認識を改善することが示されています。 これらの知見は、選択的BRAF阻害とイピリムマブ、MDX1106、そして場合によっては高用量IL2などの免疫療法との併用による安全性と有効性を評価する研究の根拠となる。 結論
メラノーマの発生に関与する分子経路の理解が進み、これらの経路の特異的阻害剤が利用可能になることで、将来の治療法を合理的に開発することが長年にわたって期待されていた。 ベムラフェニブとGSK2118436の出現により、多くの患者さんで腫瘍反応を示す最初の分子標的薬が登場し、メラノーマ治療への新しいアプローチが始まりました。 その結果、進行性メラノーマのすべての患者さんは、全身療法を開始する前にBRAFの変異解析を受ける必要があります。 BRAFに変異がある患者さんでは、2種類の強力なBRAF阻害剤のいずれかを用いて治療を行うよう、あらゆる試みを行う必要があります。 また、BRAF阻害剤の耐性メカニズムが明らかになるにつれて、新規分子標的治療薬の併用療法の開発が期待されますが、前治療や治療中の生検を含む前臨床試験や臨床試験を慎重に行うことによってのみ、さらなる臨床的改善が得られると思われます。 BRAFがメラノーマの最初の脆弱点として確立されたことで、BRAF阻害の限界を分子的に理解することで、さらなる臨床的有用性が期待されます＜370＞。