RESULTS
2種類の方法でShewanellaを分類した結果，ほぼ同様の結果が得られた（表1）． 臨床分離株の多く（74％）はGilardi biovar 2（CDC biotype 2）に属し，SS寒天培地および高濃度NaCl培地ではスクロースおよびマルトース陰性であった． Gilardiの分類法（6）とWeyantら（22）の分類法との唯一の大きな相違点は、biovar 3（スクロース、マルトース、SS、NaCl陰性）がCDC biotyping systemではグループ化されていないことであった。 ヒト由来とは対照的に，非ヒト由来ではbiovar 1（CDCバイオタイプ1）が優勢（67％）であった． これらの菌株は，マルトースやスクロースから酸を産生し，高塩濃度寒天培地やSS寒天培地では生育不能であった． 野末ら（15）の分類学上の提案に基づき，バイオバー2（CDCバイオタイプ2）株をS. alga，バイオバー1（CDCバイオタイプ1）株のすべてとバイオバー3株中6株をS. putrefaciens，残りのバイオバー3株はS. algaと同定された． 臨床的にはS. algaが優勢（77％）であったが，非人間分離株の大部分（89％）はS. putrefaciensと確認された（表1）
- View inline
- View popup
Biovar, biotype, and species designations of Shewanella isolates according to various schemata
API 20E, API NFT, RapID NF Plus, and Vitek systemで検査した10株すべての Shewanellaが、S. putrefaciensと同定されたが例外が1つあった。 S. putrefaciens 5株中4株は，API 20Eシステムで許容できないプロファイル番号（0602026および0602006）を示し，5株はS. putrefaciensの珍しいバイオタイプ番号を示した． S. algaはすべてAPI 20EでS. putrefaciensと判定された． API NFTでは、S. putrefaciensの1株を除き、10株すべてがS. putrefaciensと同定され、良好から良好な同定結果が得られた（低判別能、48時間）。 RapID NF Plusは、10株すべてのShewanellaを99.9%の精度でS. putrefaciensと同定した。 同様にVitekでも全株がS. putrefaciensと同定された（97～99%の精度）。ただし、S. putrefaciensの3株は最終同定までに5～9時間の培養を必要としたが、他の7株は4時間の結果であった。 しかし，API 20E，API NFTおよびVitekシステムでの糖質反応（アラビノースおよびマルトース）により，S. putrefaciensと最終同定後に手読みすれば，ほとんどの菌株を関連分類群（S. putrefaciensおよびS. alga）に正しく割り当てることができる。
Shewanella種の生化学および酵素的特性を比較するといくつかの相違点が認められた（表2）． Nozueら(15)が報告した羊血液寒天培地上での溶血は，すべてのS. alga株で検出されたが，S. putrefaciensは数株のみであった． ほとんどのS. alga株がこの表現型を示したのは、長時間の培養（48〜72時間）の後であり、溶血の領域は不規則で検出が困難であることが多かった。 その他、42℃での生育、高塩濃度（6.5%）の培地での生育、l-アラビノース、スクロース、マルトースからの酸生産など、これまでS. algaとS. putrefaciensの分離に役立つとされてきた活性が確認された。 SS寒天培地で生育するS. putrefaciensの株数は、これまでの報告より大幅に多く、そのほとんどが非ヒト由来であることが判明した。 S. putrefaciensは、リボースを除き、糖質酸化による酸の産生に特異的な性質を持っていた。 しかし、糖のパターンは、アラビノース、マルトース、スクロースを陽性とするもの、マルトースのみを陽性とするもの、非糖分解性を示すもの（biovar 3株）など、分離株によりかなり異なっていた。 また、Shewanella属の分離株には、これまでに報告されていない新しい酵素活性が検出された。 チロシナーゼ、アルキルスルファターゼ、キチナーゼ、エラスターゼ活性などであり（表2）、これらの酵素の多くはS. putrefaciensの非人間分離株で検出されたものである。 S. algaとS. putrefaciensのほとんどの株がシデロフォアを産生した（Chrome Azurol S assayによる）。 この活性は弱く、5株（S. alga 3株、S. putrefaciens 2株）はこの培地で生育できなかった。
- View inline
- View popup
S. alga and S. putrefaciens
35°C でよく増殖した選択された Shewanella 分離株について、さらに API-ZYM を用いて酵素活性を、MIDI システムを用いて細胞脂肪酸プロファイルを評価した（表3）。 API-ZYMを用いて片方または両方のShewanella種が攻撃する9つの基質のうち、7つの酵素について高い全体活性がS. algaと関連していた。 S. putrefaciensでより強いことがわかった唯一の活性はバリンアリールアミダーゼであったが、この活性はこれらの株でも極めて弱かった。 両種とも一様に強いアルカリ性ホスファターゼ活性を示した。 さらに、すべてのS. alga株がこれら9つの酵素のうち8つを一貫して生産しており、唯一の例外はバリンアリールアミダーゼであった。 一方、S. putrefaciensはより不均質であり、検出された9つの酵素のうち4つはすべての分離株で普遍的に存在するわけではなかった。 14株のShewanellaの分析から、優勢な脂肪酸はi-15:0、17:1ω8c、16:0であり、16:1ω7cを大量（9〜18%）に生産する株もあれば、ごく少量しか生産しない株もあることが示された。 S. algaとS. putrefaciensの間では、ほとんどの脂肪酸ピークがほぼ一致していたが、いくつかの違いが認められた（Table 4）。 ペンタデカン酸とシス-9-ヘプタデセン酸（17:1ω8c）の平均値はS. algaで高く、ヘキサデカン酸とドデカン酸についてはS. putrefaciensでその逆の結果が示された。 ヘキサデカン酸については、S. algaとS. putrefaciensの間で全脂肪酸の範囲に重複は見られなかった。ペンタデカン酸と17:1ω8cについては、S. putrefaciensとS. algaのうち1株だけが他の範囲に入る値を生成していた。
- View inline
- View popup
API-ZYM試験によるShewanellaspeciesの酵素特性
- View inline
View popup
脂肪酸分析によるS. algaとS. putrefaciensの分離
S. putrefacienscの23株はいくつかの表現型の特徴に基づいて3つの別々のグループに分けられることがわかった（表5）。 ATCC 8073を含む8株からなるグループ1は，マルトース，スクロース，アラビノースから酸を生産し，ウロカニン酸を利用した。 グループ1の菌株は，臨床分離株と非ヒト由来株で均等に分けられていた。 ATCC 8071を含むグループ2（n＝6）は，主にスクロースとマルトースを酸化できないことでグループ1株と区別された． これらの菌株の半数は臨床材料から得られている． 第3群（n＝9）は，すべて環境由来（ミシガン湖周辺）で，第1群，第2群とは大きく異なっていた． 35℃では生育不良あるいは生育不能であり，キチナーゼを産生し，トリプトファン寒天培地では無色素性であった． グループ3は9株すべてがα-グルコシダーゼを産生したが、再検査の結果、3株だけが一貫して陽性であった。 マルトースは酸化されたが、スクロースおよびアラビノースは酸化されなかった。 グループ1、2と異なり、ウロカニン酸はエネルギー源として利用されなかった。
- View inline
- View popup
Biogroups of S. putrefaciens
最近、Vogelら（21）は、ペニシリン、アンピシリン、テトラサイクリンを含む特定の抗菌剤に対する感受性のS. alga と S. putrefaciens間の相違を指摘した。 このことは、S. algaの溶血活性とヒトの病気との関連が指摘されていることと相まって、この2種の病原性に違いがある可能性を示唆している（表6）。 そこで、10株（各5株）を選択し、さらに解析を行った。 S. algaのpenicillin，ampicillinおよびtetracyclineに対する感受性は，感受性区分（感受性，中間，耐性）により大きな差は認められなかったが，平均MIC（約200，56，5.0）がS. algaのpenicillin，ampicillinおよびtetracyclineの感受性区分により大きな差があることが判明した．2 μg/ml）は、S. putrefaciensの対応するMIC（それぞれ3、1.3、1.1 μg/ml）より大きかった。
- View inline
- View popup
Virulence properties ofShewanella species
S. putrefaciens 5株中4株がアドヒアランスアッセイでHEp-2細胞に弱く（＋）から強く（＋＋）（表6）接着し、一方、4株がスライドガラス背景に強く接着したものの、同様の接着特性を示したS. alga株はなかった。 また、侵入活性はいずれのShewanella株でも検出されなかった。 羊血液寒天培地では，5株すべてで遅延溶血反応が認められたが（表2），寒天オーバーレイ法およびブロスアッセイではβ溶血は認められなかった（表6）． S. alga 5株すべて（およびS. putrefaciens 1株）において、接着および侵入試験中に弱い細胞毒性反応が観察されることがあった。 この細胞障害反応は，細胞破片（ゴースト）を含む異常な細胞形態を有するHEp-2細胞の出現によって示された． しかし，S. algawのSwiss Websterマウスにおける平均LD50は1.9 × 108 CFUであったのに対し，S. putrefaciensのそれは8.4 × 108 CFU（P＜5133＞0.02）であり，この2種のマウス病原性に違いが見られた。