Cell lines
Cell lines and their sources are following: 293T (ATCC CRL-11268), 786-O (ATCC CRL-1932), およびHK-2 (ATCC CRL-2190). THP-1細胞は、中国科学院幹細胞銀行から好意的に提供された。 細胞は、DMEM（293Tおよび786-O用）、MEM（HK-2用）またはRPMI1640（THP-1）培地に10％牛胎児血清および2mM l-グルタミンを加え、37℃、5％CO2の存在下で増殖させた。 細菌による感染、タンパク質による処理、または走化性分析の前に、培地を無血清培地に変更した。
細菌株およびプラスミド
本研究で用いた細菌株およびプラスミドを補足表S3に示す。 大腸菌はLuria-Bertani（LB）培地を用いて37℃で12時間静置培養し、必要に応じて適切な抗生物質を以下の濃度で投与した。 カナマイシンを50μg/ml、アンピシリンを100μg/ml、クロラムフェニコールを15μg/mlとした。 ΔhlyA株は、λ-Redリコンビナーゼを用いてhlyAをcat遺伝子に置換することにより作製した。 μhlyA p-hlyA株の作製は、UPEC株CFT073の染色体からhlyA遺伝子をPCRで増幅し、KpnIとXbaI酵素サイトでpTRC99Aにライゲートし、そのプラスミドをエレクトロポレーション法によりΔhlyAに形質転換させたものである。 CFT073由来のhlyCとhlyA遺伝子、あるいはNectin-2をコードする相補的DNA（cDNA）をPCRで増幅し、pET-28a ( + )にクローニングし、活性型FLAGあるいはHAタグ付きHlyAあるいはNectin-2リコンビナントタンパク質を作製した。 不活性型FLAGタグ付きHlyA (pro-HlyA)を製造するために、CFT073からhlyCを除いたhlyA遺伝子をXbaIとXhoI酵素部位でpET-28a ( + )にクローン化した。 Mycタグ付きNectin-2をpLenti-Hygroベクターに組み込んでトランスフェクションを行った。
HlyA, pro-HlyA, ヒトNectin-2組換えタンパク質発現と精製
HlyAまたはpro-HlyA組換え発現は大腸菌BL21 (DE3), Nectin-2の発現はロセッタ (DE3) で実施された。 100 μM IPTGで誘導する前に、細菌を37℃でOD600が0.6から0.8になるまで培養した。 IPTGを含むLBで16℃、12時間誘導した後、遠心分離（8000×g、5分間、4℃）により培養した菌体を回収した。 菌体をリゾチームと超音波で溶解し、上清を遠心分離して微粒子を除去した（18,000 ×g, 30 min at 4 ℃）。 その後、Ni-NTA Purification System (GenScript, Nanjing, China)を用いてタンパク質を精製した。 タンパク質は 250 mM イミダゾールで溶出した。 HlyA断片を含む画分をプールし、150 mMイミダゾール、50 mMイミダゾールで透析し、PBSで2回透析した。 その後、目的のタンパク質を含む画分をAmicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units (Millipore, Burlington, MA, USA)を用いて500μlまで濃縮した。 精製HlyAタンパク質と同様のイオン環境を有する最後の透析バッファーを、実験における精製タンパク質のコントロールとして使用した。 最終的なタンパク質濃度は、BCA Protein Assay Kit (23225, Thermo Scientific)を用いて分光光度法 (Nanodrop-2000, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) により測定した。
マウス腎盂腎炎モデル
すべての動物実験は中国、天津医科大学の動物飼育・使用委員会により確認、承認されたものである。 動物の苦痛を最小限に抑え、使用する動物の数を減らすように努めた。 6～8週齢の雌のC57BL/6Jマウスは、軍医科学院（中国・北京市）から購入した。 急性腎盂腎炎マウスモデルは、以前に記載したように確立した53。細菌は、静置LB培地で37 ℃で一晩培養した。 培養した細菌を遠心分離（5000×g、5分間、4℃）によりペレット化し、2×1010CFU/mlの密度となるようにPBSに再懸濁させた。 12, 24, 48 時間後にマウスを犠牲にし、腎臓を無菌的に取り出して 0.025% Triton X-100 を含む PBS 1 ml でホモジナイズし、連続希釈して菌数を計測した。 24時間後、腎臓組織はフローサイトメトリー、組織学、および炎症性サイトカイン分析にも使用した。
フローサイトメトリー分析
単細胞懸濁液を、PBS中1.5 mg/ml コラゲナーゼ IV (C5138, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) および100 ng/ml DNase Iで37℃、軽度振とう下30分消化し、生成させた。 消化された細胞懸濁液を70-μmセルストレーナー（352350, BD Biosciences, San Jose, CA, USA）で濾過し、単細胞懸濁液とした。 CD16/32（101319、Biolegend、San Diego、CA、USA）を用いてFc受容体をブロックし、次に単細胞懸濁液を以下の抗体とインキュベートした。 APCに結合した抗CD11b（17-0112-82、Thermo Fisher Scientific）、PEに結合した抗Ly6G（127608、Biolegend）、FITCに結合した抗F4／80（11-4801-82、Thermo Fisher Scientific）、PEに結合した抗CD11c（127608、Biolegend）、PerCP／Cy5と結合した抗CD206と一緒にインキュベートした。5 (141716、Biolegend)に結合させた。 細胞はFACSCanto II Flow Cytometer (BD Biosciences) でFlow Joソフトウェア (FlowJo, Ashland, OR, USA) を用いて解析した。
H&E staining and immunohistochemistry
キドニーは少なくとも24時間10% phosphate-buffered formalinで固定し、固定組織をパラフィンに埋め込んで5-μm切片に切断した。 スライドはヘマトキシリンとエオシンで染色した。 腎臓の病理組織学的変化は，0，1，2，3 が正常，軽度，中等度，重度の組織学的病変（病理学的損傷は主に髄質内と皮質-髄質接合部に位置する），4，5，6 が軽度，中等度，重度の組織学的病変（病理学的損傷は主に腎臓の多くの部位にある）を示す 6 点法で評価された． 56,57 免疫組織化学分析では、切片を抗ネクチン-2抗体（27171-I-AP, 1:200, Proteintech, Chicago, IL, USA）で染色した。 画像は顕微鏡（BX46, Olympus, Tokyo, Japan）で取得した。
組織および細胞の免疫蛍光分析
腎臓は液体窒素でOCT化合物に包埋した。 凍結ブロックを5μmの切片に切り出し、室温で1時間風乾した後、冷アセトンで10分間固定した。 その後，凍結切片を直ちにメタノールに20分間浸漬し，さらに3%過酸化水素を含むメタノールに10分間浸漬した． 組織を5％ウシ血清アルブミン（BSA）で1時間ブロッキングし、抗F4/80抗体（ab6640、Abcam、1：200）、抗Ly6G抗体（ab210402、Abcam、1：200）、Nectin-2抗体、（ab135246、Abcam、1：200）とブロッキングバッファで、必要時に4℃にて一晩インキュベートした。 その後、スライドをPBSで5回洗浄し、Alexa Fluor 488/549標識二次抗体（Proteintech, 1:200）と共に室温で1時間インキュベートした。 核を可視化するために、組織切片はDAPIで対比染色した。 画像は蛍光顕微鏡（IX73、Olympus）で取得した。 pLenti-Hygro-Myc-Nectin-2 をトランスフェクトした293T細胞をLab-Tekチャンバーカバーグラス上で培養し、75nM HlyAで6時間処理し、4％パラホルムアルデヒドで15分間固定し、抗MYC-タグ抗体 (66003-2-Ig, 1:25, Proteintech) と HA-タグ抗体 (2367S, 1:200, CST) で4℃一晩免疫蛍光染色を行った。 Alexa Fluor 488/594標識2次抗体（Proteintech）を室温で1時間インキュベートして使用した。共焦点蛍光顕微鏡（FV1000-D、Olympus）を用いて細胞を画像化した。
腎上皮細胞へのUPEC株感染
UPEC感染24時間前にヒト腎上皮細胞（786-O or HK-2）を24穴プレートに播種した。 ADAM10阻害のため、感染前20時間、ADAM10阻害剤GI254023X（Sigma-Aldrich）と共に細胞をプレインキュベーションした。 細胞は、指示された感染倍率（MOI）で6時間細菌に感染させるか、指示された濃度の精製HlyAまたはpro-HlyAで12時間刺激した。いくつかの実験では、細胞に∆hlyA（MOI 0.01）を精製HlyA（75 nM）で6時間スパイクした。浸潤アッセイでは、6時間感染後、細胞をPBSで5回洗浄し、200 μg/mlのゲンタマイシンで1時間処理して細胞外細菌を死滅させた。 その後、細胞をPBSで2回洗浄し、PBS中0.2％triton X-100を500μl加えて溶解し、LB寒天培地プレートにプレーティングして細胞内細菌を計数した。
酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）
感染した786-O細胞、HlyA/pro-HlyA処理した786-O細胞、または感染後の腎臓のホモジネートからの上清中のGM-CSFレベルは、ELISA開発キット（中国、深セン市のNeobioscience Technology Company）を用いて製造者の説明書にしたがって測定された。 マウスの腎臓を取り出し、1％ Triton X-100および完全ミニEDTAフリープロテアーゼインヒビターカクテル錠（11697498001、Roche、Indianapolis、IN）を含むPBS中でホモジェナイズした。 次に、ホモジネートを氷上で30分間インキュベートし、4℃で10,000×gで10分間遠心分離した；上清を集め、製造者の指示（Neobioscience Technology Company, Shenzhen, China）に従ってGM-CSF、IL-1β、TNF-α、IL-6およびMIP-2のELISAアッセイに使用した。
細胞毒性アッセイ
精製タンパク質または透析バッファによって12時間処理した786-O細胞の細胞培養上清を集め、CytoTox-96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay Kit（G1780, Promega, Madison, WI, USA）を用いて乳酸脱水素酵素（LDH）について検出を行った。
患者の尿サンプル
天津医科大学第二病院で治療を受けたUPEC株感染患者から尿サンプルを採取し，個々の患者の尿から分離したUPEC株におけるhlyA遺伝子の存在をPCRにより決定した（補足表S2およびS4）。 尿はAmicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units（UFC901024, Millipore）を用いて200μlに濃縮し、濃縮液をELISA開発キット（Neobioscience Technology Company）により検出した。 患者サンプルに関連する研究は、天津医科大学倫理委員会の承認を受け、すべての患者から書面によるインフォームドコンセントを得た。
RNA抽出とqRT-PCR
786-O 細胞に CFT073, △hlyA または△hlyA p-hlyA (MOI 0.01) を4時間感染させた。 RNAはTotal RNA Extraction Kit (Solarbio, Beijing, China)を用いて製造者のプロトコルに従って抽出し、RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Fisher Scientific) を用いて逆転写した。 qRT-PCRは7900 Fast Real-Time PCR System (Roche, Basel, Switzerland)でFastStart Universal SYBR Green Master Mix (Roche)を用いて実施した。 PCR サイクリング条件は、95 ℃ 5 分、95 ℃ 20 秒、60 ℃ 20 秒、72 ℃ 20 秒を 40 サイクル行った。β-アクチンを内因性対照として用い、データは野生型の β-actin の転写レベルを基準に正規化し、比較臨界閾サイクル 2-∆∆Ct 法で定量した。 使用したプライマーを補足表S4に示す。
化学走性アッセイ
細胞移動アッセイは、トランスウェルチャンバー（孔径5μm、Costar、コーニング3421、コーニング、ニューヨーク、米国）を用いて実施した。 THP-1細胞（200μl中2×106個）を無血清RPMI1640培地に再懸濁し、上部チャンバーに添加した。 感染した786-O細胞の上清を、ヒトGM-CSFに対する1μg／ml中和抗体（502203、BVD2-23B6、Biolegend）またはコントロールIgG2a（400515、Rat IgG2a、Biolegend）と混合し、30分間インキュベートした。 その後、上清を含む培地600μlをケモアトラクターとしてロワーチャンバーに添加した。 マクロファージを排除するために、感染の24時間前に200μlのPBSまたはクロドロネートリポソームをマウスに静脈内投与した32,33。 GM-CSFを中和するために、GM-CSFに対する中和抗体（505408, MP1-22E9, Biolegend, 250μg）またはコントロールIgG2a（400533, Rat IgG2a, Biolegend, 250μg）を感染の1時間前にマウスに静脈内注射しました33, 58
抗体およびウェスタンブロッティング
抗体は以下の会社から入手した：モノクローナル抗FLAG抗体（F1804、Sigma-Aldrich）、抗MYC-Tag抗体（66004-Ig、Proteintech、シカゴ、IL、米国）および抗Nectin-2抗体（ab135246、Abcam、ケンブリッジ、英国）。 全細胞溶解液は、完全なプロテアーゼ阻害剤（Roche, Basel, Switzerland）を含むRIPA溶解バッファー（Millipore）を用いて調製した。 BCA Protein Assay Kit (Thermo Fisher)を用いてタンパク質濃度を測定した。 抗体結合を明らかにするために、HRP結合抗ウサギIgG（1：10000、シグマ-アルドリッチ）または抗マウスIgG（1：10000、シグマ-アルドリッチ）が使用された。 免疫反応性複合体は、Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate (Millipore) を使用して検出し、GE Amersham Imager 600 マシンで露光した。
ファーウェスタンブロッティングおよびLC-MS/MS分析
ファーウェスタンブロッティングプロトコルは以前に記載したように行った59。 786-O細胞を氷冷PBSで2回洗浄し、Membrane and Cytosol Protein Extraction Kit (Beyotime Biotechnology, Shanghai, China) を用いて細胞膜タンパク質を製造者のプロトコルにしたがって単離した。 可溶性膜関連タンパク質は、10%ゲルのドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析した。 その後、タンパク質をポリフッ化ビニリデン（PVDF）膜（Merck Millipore, Darmstadt, Germany）に移した。 その後、メンブレンをTBSTバッファ中の5%脱脂乳で1時間ブロックし、30μg/mlの精製FLAGタグ付きHlyAまたは透析バッファと4℃で一晩インキュベートした。 洗浄後、膜を1：1000に希釈した抗FLAG抗体（Sigma-Aldrich）と共に、TBST緩衝液中の5％脱脂乳中で4℃にて一晩インキュベートした。 その後、メンブレンを十分に洗浄し、HRP標識抗マウスIgG（1:10000, Sigma-Aldrich)
透析バッファ群とFLAGタグ付きHlyA群の差バンドは、Majorbio社（中国、上海）のEksigent nano LC 1D plus HPLCシステムにnanoLC-LTQ-Orbitrap XL mass spectrometer (Thermo, San Jose, CA, USA）を結合して行ったLC-MS/MSを用いて同定しました。 トリプシンペプチドは酵素で完全に消化し、ナノエレクトロスプレーイオン化法を用いてイオン化しました。 最後に、Proteome Discoverer (version 1.4.0.288, Thermo Scientific) を用いてMSデータを解析した。
RNA interference and Nectin-2 overexpression
Small-interfering RNAs (siRNAs) for the targeted genes and a scrambled control siRNA (siScr) was synthesive by GenePharma (Shanghai, China)． pLenti-Hygro-Myc-Nectin-2 は、Lipofectamine 3000 (Invitrogen) を用いて 786-O または HK-2 細胞にトランスフェクトし、Nectin-2 を過剰発現させた。 トランスフェクションの48時間後に、ウエスタンブロッティングを用いて、細胞のタンパク質発現を分析した。 siRNAの配列を補足表S4に示す。
免疫沈降
293T細胞にpLenti-HygroベクターまたはpLenti-Hygro-Myc-Nectin-2をトランスフェクトし、そして48時間培養した。 次に，トランスフェクション後6時間FLAG-tagged HlyA (75 nM) とインキュベートし，ウェスタンブロッティングまたは免疫沈降 (IP) アッセイ用に溶解バッファ (50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 1 % NP-40, 0.2 mM EDTA, 150 mM NaCl) で新たに溶解させた。 786-O細胞はFLAG-tag HlyA (75 nM) または透析バッファと6時間インキュベートした後、タンパク質IPアッセイ用に透析バッファを用いて溶解させた。 細胞上清を抗FLAG M2 beads (A2220, Sigma-Aldrich) または抗Myc M2 beads (A7470, Sigma-Aldrich) と共に4℃で12時間インキュベートし、FLAGタグ付きまたはMycタグ付きのタンパク質IPとした。 Nectin-2タンパク質IPのために、細胞上清を抗Nectin-2抗体 (ab135246, Abcam) と共に4℃で12時間インキュベートし、次にProtein A/G agarose (20241, Thermo Fisher)と共に4℃で2時間インキュベートした。 コントロールとしてNormal Rabbit IgG (2729S, CST)を使用した。 インキュベーション後、沈殿物を遠心分離で集め、溶解バッファーで5回洗浄し、モノクローナル抗FLAG抗体、抗MYC-Tag抗体、または抗Nectin-2抗体を用いたイムノブロッティングにより解析した。
細菌発現精製したFLAGタグ付きHlyA（1μg）を細菌発現精製したNectin-2 1μgと結合バッファ（20 mM Tris-HCl (pH 7.4), 0.1 % Triton-X 100, 100 mM NaCl, 20% glycerin,1% BSA）中で12時間インキュベートし、複合体はFLAGタグタンパク質IPまたはNectin-2タンパク質IPに付されることになる。 最後に、複合化したタンパク質を免疫ブロッティングで解析した。
統計解析
グループ間の差の統計的有意性は、分散分析（ANOVA）解析を用いて検証した。 in vivoの実験ではノンパラメトリックなMann-Whitney検定を用いて統計的有意性を算出した
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