Brca1-mutant cancer cellsのCSCs mediate cell migration in vitro
我々はこれまでに、Brca1-mutantマウスで発症した乳腺原発腫瘍や培養細胞株からがん開始細胞やCSCsに富むCD24+CD29+細胞、CD24+CD49f+細胞等を単離している。 (W0069）、Brca1乳腺腫瘍に由来するものである。39 これらの細胞の転移における役割を調べるために、先に示したように CD24+CD29+ 細胞を約 15% 含む W0069 細胞株から CD24+CD29+ 細胞 (CSC とする) と CD24-CD29- 細胞 (non-CSC) を選別し39 、創傷治癒とトランスウェルアッセイの両方を用いて移動能 を調べた。 24 時間後、CD24/CD29 二重陽性細胞は、二重陰性細胞に比べて良好な移動能力を示し、傷の大きさによって明らかになった（図 1a）。 トランスウェル移動アッセイでも、フィルター下面（175.6±19 vs 54.2±18.1, **P<0.01） とトランスウェル下室（82.3±5.5 vs 4.3±2.1 colonies, **P<0.01） で移動した細胞数に有意差が見られた（図1b）。 同じ細胞株から得られた異なるサブクローンを、CSCの存在について陽性または陰性で調べた場合も、同様の結果が得られた（データは示さず）。 CSCが運動性を高めていることを確認するために、異なる量のW0069細胞とW0069細胞株から選別したダブルネガティブ細胞とを混合した。 図1cに示すように、CD24-CD29-細胞の数を増やすことで使用する総細胞数は安定するが、二重陽性細胞の数を減らすと移動能は低下した。 5×104個のW0069細胞からスタートすることで、移動した細胞は下部のチャンバーで52.6±15.5個のコロニーを形成することが確認された。 4×104 W0069細胞と1×104 double-negative細胞を混合した場合、コロニー数は16±2.6に減少した。 W0069細胞の数を減らし、CD24-CD29-細胞の数を増やし続けると、コロニー数はさらに減少した（図1c）。 W0069細胞とCD24-CD29-細胞のみを持つサブクローン（W0069-202）を混合した場合も同様の結果が得られた（補足図1a、b）。 逆に、使用するCD24+CD29+細胞の数を徐々に増やすと、コロニー数が増加することを実証した（補足図S1c）。 さらに、移動におけるCSCの役割を検証するために、CSCの存在を陽性とするW0069-緑色蛍光タンパク質標識細胞を用い、ソートした非標識CD24-CD29-細胞と混合した。 陽性細胞の数を増やすことで、遊走した細胞が形成するコロニー数の増加に気づいた。形成されたコロニーは、蛍光顕微鏡で確認するとすべて緑色であり、CD24+CD29+細胞が細胞培養中に存在する場合にのみ遊走が見られることを示唆している（図1dおよびe）。 これらのデータを合わせると、Brca1変異癌細胞株においてCSCが増強された運動性を示すことが示唆される。
Brca1変異細胞からのCSCsは増強した移動能力を示している。 (a)CD24/CD29二重陽性細胞および陰性細胞において、創傷治癒アッセイによりCSCの存在について細胞移動を分析した。 黒線は、実験終了時（t=24 h）に移動している細胞の境界を示す（上：低倍率、下：高倍率）。 1つの条件につき3つのウェルを使用した。 (b) CSCs陽性細胞（上段）および陰性細胞（下段）のトランスウェル移動アッセイ。 フィルター下部の移動した細胞（左）および下部チャンバー内の移動した細胞からのコロニー（右）の特徴的な写真。 フィルター底部およびプレート下部のチャンバーにおける移動した細胞の定量化を示す（**P<0.01）。 (c) 減少した陽性細胞と増加した陰性細胞を混合した後の細胞の移動能力(P/N)。 コロニーからの写真は3つの異なる実験の代表的なものである。 数字（50, 40, 30, 20, 10, 0）は、この実験で使用した陽性細胞または陰性細胞のいずれか数千個を示す。 (d, e) トランスウェル運動性アッセイは、GFP標識陽性細胞の数を増やし、非標識陰性細胞の数を安定させることにより行った(d)。 コロニーは蛍光の存在を確認した（e）。
CSCs in Brca1-mutant cancer mediate cancer metastasis in vivo
次に、CSCのin vivoでの転移の役割の可能性について評価した。 W0069細胞株から新鮮なCD24+CD29+およびCD24-CD29-細胞、ならびに同じマーカーに対して陽性または陰性のサブクローンを選別し、6-8週齢のバージンアチミック（ヌード）マウスの乳腺に移植した。 これは、この集団が CSCs を豊富に含むという考え方と一致する。39 CSCs の存在について陽性または陰性のサブクローンを使用した場合にも、同様の結果が得られた（データは示されていない）。 CD24+CD29+細胞を注入したマウスは、CD24-CD29-細胞を注入したマウス（60-69日目）よりも腫瘍量が多いため早く殺さなければならなかったが、CD24+CD29+細胞を注入したマウス群では転移の存在が有意に増加した。 特に、陰性細胞株を移植した3/15匹のマウスは、1匹あたり肺に1つの小さな腫瘍結節を有していた（図2cおよびd）。 一方、陽性細胞株を移植したマウスでは、13/18匹が肺に転移性結節を有し、合計100個以上（ほとんどの結節の大きさはもっと大きく、一つの肺に結節が多すぎると正確に数えることができないのでこの数は過小評価されているかもしれない）（図2c、d）。 陽性と陰性で原発巣の大きさに約7倍（5000mm3/700mm3）の差があったことから、転移の差は腫瘍の成長の差に起因する可能性も考えていた。 しかし、腫瘍の転移は、腫瘍が大きくなった後期よりも、腫瘍が小さい初期に始まることが知られており40、この可能性は否定的である。 さらに、結節数の差は約33倍（100/3）であり、二重陽性細胞由来の結節は二重陰性細胞由来の結節よりもはるかに大きく、このことは2つの亜集団の転移能力の違いを浮き彫りにしている。 3つの転移性結節の起源については、二重陰性の集団には、癌の発生や転移の能力が低い細胞がまだ含まれている可能性がある。 あるいは、CD24-CD29-細胞の一部は、脱分化によってこれらの能力を獲得しているかもしれない。
CSCs mediate metastasis in vivo.
CSCs mediate metastasis in vivo.
CD29 および CD49f は、がん転移の仲介に重要な役割を果たす
興味深いことに、CD24 および CD29 マーカーを用いた蛍光活性化細胞選別分析によってこれらの転移性腫瘍のプロファイリングを行うと、二重陽性細胞株からのものは原発腫瘍または元のがん細胞株と同様のプロファイルを持っていた（図 3a、左）。 腫瘍内のCSCのみが元の腫瘍の不均一性を再現できるため、これはCSCが転移し、転移性腫瘍の形成を促進することを示している。 一方、陰性細胞株由来の腫瘍では、蛍光活性化セルソーティング分析で明らかになったように、転移した後もCD24とCD29の二重陽性細胞は検出されなかった（図3a、右）。 さらに、CD24+CD29+細胞を移植して開始した腫瘍から肺の転移結節において免疫蛍光染色によりCD24+CD29+細胞を検出することができたが（図3b）、CD24-CD29-細胞を移植して開始した腫瘍からは検出できなかった（データ示さず）。 CD24+CD29+細胞はCD24-CD29-細胞よりも高い移動度を有するという観察と一致して、CD24およびCD29に対する抗体による染色は、創傷治癒アッセイ中に移動する細胞中のCD24+CD29+細胞も検出した（図3c）。 これらの結果は、CSCがin vitroおよびin vivoの両方で強化された運動性を示し、Brca1変異乳腺腫瘍の転移能を推進する上で重要な役割を担っているという考えを支持する。
細胞株、原発および転移癌におけるCD24+CD49+細胞の分析。 (a) CSCマーカー（CD24、CD29）に対する転移性腫瘍、原発性乳腺腫瘍およびオリジナル細胞株のプロファイリング。 CSCに対して陽性（左）または陰性（右）のいずれかの細胞を注射したマウスの原発性および転移性腫瘍の代表例。 (b) CSCsのマーカーとしてCD24とCD29を用いた、転移性肺腫瘍における免疫蛍光法。 (c) 試験管内で移動する細胞は、CSCマーカーに陽性である。 W0069 Brca1-mutant癌細胞株を用いて創傷治癒アッセイを実施した。 移動した細胞は、CSCマーカーであるCD24とCD29に対する抗体で免疫蛍光染色した。 (d) W0069細胞は、CSCを濃縮するために腫瘍球として低付着条件で培養し、CD24およびCD29に対する抗体で免疫蛍光染色を行った。 FACS解析のために、100μlの緩衝液（PBS pH 7.2, 0.5% BSA, 2mM EDTA）あたり1×106細胞の濃度で、CD24（抗CD24-PE, BD Pharmingen）、CD29（抗CD29-FITC, Chemicon）およびCD49f（抗 CD49f-FITC, BD Pharmingen）に対する抗体で細胞を染色した。 4℃で25分間インキュベートした後、FACSCaliburフローサイトメーター（Becton Dickinson社製）を用いて解析を行った。 異なる細胞集団を選別するために、同じ手順に従い、FACSAria Cell Sorter（Becton Dickinson）を用いて選別した。
CD29（β1インテグリン）およびCD49f（α6インテグリン）は、ともにインテグリンのサブユニットで、細胞外マトリックスの受容体として機能する41。 細胞外マトリックスは、細胞の移動と癌の転移に関与していることから41、我々は、CD29とCD49fがCSCsのマーカーとしてのみ機能するのか、それとも実際に癌転移の仲介に重要な役割を持つのかを明らかにすることに興味をもった。 まず、CD29 のオープンリーディングフレームを標的とした個々の低分子干渉RNA (siRNA) を用いて、W0069 およびCD24+CD29+細胞のCD29 をノックダウンした。その結果、対照細胞と比較してsiCD29細胞の細胞移動が顕著に減少したが、統計的には減少していないことがわかった（図4aおよびb）。 CD29とCD49fはヘテロダイマーを形成していることから、CD29の発現が低下した場合、CD49fが何らかの機能を補うのではないかと考えられた。 このことを調べるために、次に、これらの細胞でCD49fをsiRNAでノックダウンした（図4a）。 その結果、CD49fをノックダウンするだけでも、siCD29で処理した細胞と同程度の細胞移動能力がわずかに低下することがわかった（図4b）。 しかし、両者を同時にノックダウンすると、細胞生存率ではなく、細胞移動の著しい減少が観察された（図4a-d）。 これらの遺伝子のオープンリーディングフレーム中の4つの異なる領域に対するsiRNAのプールを使用しても、同様の結果が得られた（補足図2a-c）。 また、CD29とCD49fをノックダウンした後に、4つの関連するインテグリン（インテグリンα5と7、インテグリンβ2と3）の発現を確認したが、これらのsiRNAが他のインテグリンに対する交差阻害活性を持たないことを示すデータが得られた（補足図2d）。 これらの結果は、integrin α6とβ1がCSCsの移動において、重複しながらも重要な機能的役割を担っている可能性を示唆している。 したがって、インテグリンα6およびβ1をマーカーとして使用して細胞を選別することにより、これらのタンパク質がin vitroでの細胞移動およびin vivoでのがん転移を媒介する機能的役割を有する可能性がある細胞を実際に濃縮する。
CD29（β1 インテグリン）およびCD49f（α6 インテグリン）がCSCsの移動の媒介において重要な役割を果たすことがわかる。 (a)それぞれの遺伝子のオープンリーディングフレームを標的とするThermo Scientific Individual siRNAを用いて、CD29とCD49fを単独または一緒にノックダウンした後のmRNAレベルについてのリアルタイムRT-PCR分析。 インテグリンα6のsiRNAはD-040204-05-0002であり、インテグリンβ1はD-040783-01-0002である。 非標的siRNAをコントロールとして使用した。 (b) W0069細胞のトランスウェル移動アッセイ。 移動した細胞からのコロニーを左側に、移動した細胞の定量を右側に示す。 (c) W0069細胞におけるsiRNAノックダウン24時間後、48時間後、72時間後の細胞増殖アッセイ。 (d) W0069細胞から派生した二重陽性細胞株のトランスウェル遊走アッセイ。 (e, f) E-カドヘリンおよびZO-1の抗体を用いたCD24+CD29+およびCD24-CD29-細胞における免疫蛍光法(e)。 W0069細胞から選別したCD24+CD29+およびCD24-CD29-におけるグラフに記載した遺伝子のプライマーを用いたリアルタイムRT-PCR(f)。
CSCs exhibited epithelial to mesenchymal transition signature gene expression
CSCの転移能増強のメカニズムを理解するために、CD24+CD29+とCD24-CD29-の両方の細胞で形態的および分子解析を実施した。 その結果、CD24-CD29-細胞はCD24+CD29+細胞よりも上皮細胞のマーカーである膜結合E-カドヘリンを顕著に示した（図4e）。qRT-PCR解析でもCD24-CD29-細胞はCD24+CD29+細胞よりもE-カドヘリンの発現レベルが高く検出された（図4f）。 E-カドヘリンの発現レベルの低下と一致して、CD24+CD29+細胞はまた、qRT-PCR（図4f）、およびウェスタンブロット分析（補足図2e）により明らかになったように間葉系細胞のいくつかのマーカー遺伝子の高い発現レベルを呈した。 CD24+CD29+細胞の間葉系細胞としての特徴は、上皮から間葉系への移行を経ていることを示唆しており、in vitroにおける運動性の向上とin vivoにおけるがん転移の分子的根拠を与えている。
以上，Brca1変異乳癌モデルマウスから分離したCD24+CD29+細胞集団に富むCSCの転移能を検討し，CSCが組織培養で非CSCよりはるかに高い移動能を示し，移植ヌードマウスで転移能が増強することを示した。 また、CD24+CD29+細胞は分化能を維持し、転移性腫瘍の異質性を再構築することができたが、CD24-CD29-細胞はそうではないことを明らかにした。 しかし、最も興味深い発見は、マウスの乳腺腫瘍から CSC を分離するためのマーカーとして使用されてきた CD29 と CD49f が、CSC の移動を媒介する上で重複しながらも重要な役割を担っていることである39、42、43。 一方、ヒト乳癌では、α6 インテグリンが高発現し、最初の 2 年間の経過観察に限定した時間依存性の研究により、独立した予後因子と して機能していることが明らかになっている45 。 我々のデータは、β1インテグリンまたはα6インテグリン単独で機能障害を起こすと、両方の遺伝子を同時にノックダウンするよりもはるかに穏やかな効果をもたらすことを示している。 この知見は、両インテグリンが互いにペアとなって、フィブロネクチンやラミニンなどの細胞外マトリックス成分に対してヘテロダイマーを形成することができるという事実と一致している41, 46, 47, 48, 49 悪性社会ネットワークがCSCsとその微小環境間の細胞-細胞接着およびコミュニケーションを媒介することが示唆されている20, 21 我々の研究は、このネットワークの仲介におけるβ1/α6インテグリンの重要な役割を示唆するものであった。 特に、β1/α6インテグリンは、CSCs-間質相互作用を仲介し、細胞外マトリックスシグナルを細胞機構に中継し、生存率、分化、転移の面でCSCsの活性を高めることにつながる可能性がある
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