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横山真帆博士によるレビュー Christian Zerfaß, Ph.D. Skip to:
- How does SMRT Sequencing Work?
- 細菌のDNAメチル化の研究：SMRTシーケンシングの応用
DNAシーケンシングは、DNAポリメラーゼを使って、テンプレートに塩基を付加することで行われます。 DNAの塩基配列決定には、いくつかの技術がある。
DNA配列の透明なスライドを検査する研究者。 Credit: Shawn Hempel /SMRTシーケンスの仕組み
他のDNAシーケンス技術と同様、DNA抽出後の最初のステップは「ライブラリ」の準備です。 この工程では、DNAを配列決定のために準備します。この場合、二本鎖DNA分子の両端にアダプターを付加し、DNAを一本鎖の円形テンプレートにすることが効果的です。 このDNAライブラリー、つまり鋳型DNAは、次に、DNAポリメラーゼが一端に固定された「ゼロモード導波管」を持つDNAシーケンサーに入れられます。 すると、DNAポリメラーゼが、鋳型DNAに相補的に合成されたDNA鎖に新たなヌクレオチドを付加し始めます。 このヌクレオチド中の塩基は標識されており、この塩基が成長中のDNA鎖に取り込まれることで発光が起こる。 この発光はリアルタイムで読み取られ、各塩基からの発光が異なるため、特定の塩基を特定することができる。
SMRTシーケンスの最大の利点は、高精度の長いシーケンシングリードを生成し、全ゲノムの組み立てを向上させることができる点である。
Studying DNA Methylation in Bacteria; an Application of SMRT Sequencing
DNAメチル化とは何か
DNAにメチル基を付加することは、メチル化として知られており、すべての生物界で起こっています。 真核生物にも存在するm5C（C5-メチル-シトシン）、m6A（N6-メチル-アデニン）、m4C（N4-メチル-シトシン、バクテリアにのみ存在）の3つのメチル化ヌクレオチドがバクテリアに存在しています。 メチル化は、新しい DNA 鎖が合成された後に、特定のヌクレオチドで起こります。
メチル基は DNA 二重らせんから突き出ているため、DNA と DNA 結合タンパク質間の結合に影響を与える可能性があります。
Epigenetic mechanisms: The methylation or acetylation of the dna can activate or not the gene transcription.エピジェネティックなメカニズムは、DNAのメチル化やアセチル化によって、遺伝子の転写が活性化されたりされなかったりする。 Image Credit: ellepigrafica /なぜ細菌ではDNAのメチル化が重要なのか
細菌はウイルスに感染するため、ウイルス感染を克服するための防御機構が必要である。 このシステムは、特定の部位でDNAを分解する制限酵素と、アデニン（A）またはシトシン（C）にメチル基を付加するDNAメチルトランスフェラーゼで構成されています。
大部分の制限修飾システムにおいて、DNAメチルトランスフェラーゼは制限酵素から細菌のDNAを保護する働きを担っています。 DNAメチルトランスフェラーゼの存在は、細菌のDNAがメチル化される一方で、感染するウイルスのDNAはメチル化されないことを意味する。 つまり、ウイルスDNAは制限酵素によって分解されるが、細菌DNAは制限酵素がメチル化されたDNAに作用しないため、保護されることになる。 しかし、修飾されたDNAに作用する制限酵素もあることに留意すべきである。
最近の研究では、制限修飾系にさらなる役割がある可能性が示唆されている。 例えば、ある制限修飾系をノックアウトすると、遺伝子発現が変化し、これはDNAメチル化の違いに関連している。 また、制限修飾系は二本鎖切断やC-T変異を引き起こし、細菌の進化に影響を与える可能性もある。 最近では、「メチローム」と呼ばれる細菌ゲノム全体のメチル化を決定できる技術が開発されています。
SMRTシーケンスを用いたメチロームの決定方法
SMRTシーケンスはリアルタイムに結果が得られるため、メチル化を含むDNA修飾の検出に使用することが可能です。 DNAポリメラーゼは一定の速度でヌクレオチドを取り込みますが、鋳型のヌクレオチドが修飾されていると、この速度が変化してしまうことがあります。 このことは配列決定プロセスで指摘できる。
BlowらはSMRT配列決定を用いて、230の微生物におけるDNA修飾をマッピングした。 彼らが探した修飾は、m5C、m6A、m4Cなどであった。 著者らは、これらの微生物の93％がDNAのメチル化を示し、また、メチル化された834のモチーフを発見した。 興味深いことに、著者らは、研究対象の生物の 48% が DNA メチル化酵素を持つ一方で、制限酵素が存在する証拠がないことに注目しました。 したがって、DNAメチル化は、ゲノム制御において重要な役割を果たしているか、あるいは、まだ特定されていない微生物における別の重要な役割を果たしている可能性があります。
ソース
- PacBio. SMRT sequencing brochure www.pacb.com/…/…-long-reads-to-drive-discovery-in-life-science.pdf
- PacBio. SMRT sequencing – how it works www.pacb.com/…/Infographic_SMRT-Sequencing-How-it-Works.pdf
- Sánches-Romero, M. A. et al., DNA methylation in bacteria: from the methyl group to the methylome. カレント・オピニオン・イン・マイクロバイオロジー 2015, 25, 9-16. https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1369527415000399
- PaBio. SMRTシークエンス Epigenetics https://www.pacb.com/smrt-science/smrt-sequencing/epigenetics/
- Blow, M. J. et al. The Epigenomic Landscape of Prokaryotes. PLOS Genetics 2016, 12 (2), e1005854. journals.plos.org/plosgenetics/article?id=10.1371/journal.pgen.1005854.
Further Reading
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- 高効率DNAシーケンス技術
Written by
Dr. Yokoyama
横山真帆先生は、研究者、サイエンスライターとしてご活躍されています。 英国バース大学にて、黄色ブドウ球菌の機能ゲノム解析に関する論文を発表し、博士号を取得しました。 博士課程では、他の研究者と共同研究し、いくつかの論文を査読付き科学雑誌に発表した。 彼女はまた、世界中の学術会議で自分の研究を発表しました。
Last updated Sep 3, 2019Citation
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Yokoyama, Maho. (2019, 9月 03)である。 1分子リアルタイム（SMRT）シーケンサーとは. ニュース-メディカル. 2021年3月26日取得 https://www.news-medical.net/life-sciences/What-is-Single-Molecule-Real-Time-(SMRT)-シークエンス.aspx.
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Yokoyama, Maho. “1分子リアルタイム（SMRT）シーケンサーとは？”. ニュース-メディカル. 2021年3月26日. <https://www.news-medical.net/life-sciences/What-is-Single-Molecule-Real-Time-(SMRT)-Sequencing.aspx>.
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シカゴ
Yokoyama, Manho. “1分子リアルタイム（SMRT）シーケンサーとは？”. ニュース-メディカル. https://www.news-medical.net/life-sciences/What-is-Single-Molecule-Real-Time-(SMRT)-Sequencing.aspx. (accessed March 26, 2021).
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ハーバード大
横山真帆. 2019. 1分子リアルタイム（SMRT）シーケンサーとは？ News-Medical, 2021年3月26日閲覧, https://www.news-medical.net/life-sciences/What-is-Single-Molecule-Real-Time-(SMRT)-Sequencing.aspx.
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