食品用カチオン性抗菌剤ε-ポリリジンはCD-1マウスの腸内細菌群集を一過性に変化させ、メタゲノム機能を予測する。1 マウス

A cationic antimicrobial biopolymer influences murine gut community diversity

40 female and 40 male 6week old CD-1 mice were randomly divided into four groups and segregated by sex (i…マルトデキストリン単独（MD）、マルトデキストリン＋ε-ポリリジン（PL）、マルトデキストリン＋ペクチン（P）、マルトデキストリン＋ε-ポリリジン＋ペクチン（PL-P）を添加した高脂肪20％飼料を摂取させた。 先行研究では、同居するマウスは類似した腸内細菌群集を示すことが示されている38, 39。そこで、24時間代謝ケージで各ケージの糞便ペレットをプールし、第1週（ベースライン）、第5週（中間期）、第9週（最終期）の3点で分析した（図1）。 体重と食物消費量は、処理群にかかわらず、実験期間全体にわたって変化しなかった。

系統的多様性を特徴付けるために、16S rRNA遺伝子V3/V4断片をシーケンスし、フィルタリング後に15,739,734質のリードを得た(40)。 この結果、細菌群集あたりの平均サンプル深度は327,911リードとなった。 群集内のα-多様性を評価するために、重み付けされたUniFracを用いて、観測された操作型分類単位（OTU）の数を計算しました41。 観察されたOTUの希薄化曲線（図S1）は、食餌、サンプリングポイント、および性別に依存しない漸近線に近づいており、配列決定の深さが糞便サンプルから抽出された群集に存在するOTU多様性を十分にカバーしていることを示した。 以前報告されたように42, 43、マウスの腸内細菌叢は、BacteroidetesとFirmicutesの2つの門が比較的大きな寄与をしている（図2）。 これは、ヒトおよび非ヒト霊長類を含む他の哺乳類腸内コミュニティと一致している。44, 45 しかし、Bacteriodetes (p < 0.05) および Firmicutes (p < 0.05) の相対量は、特定の食物バイオポリマーに対応して変化した (multi-way ANOVA) (Fig. 2)。 興味深いことに、ε-ポリリジン-ペクチン複合体を与えたマウスは、Bacteriodetesが8.82%増加し（p < 0.05, multi-way ANOVA Tukey HSD post-hoc）、Firmicutesに割り当てられたOTUが11.13%減少する（p < 0.05, multi-way ANOVA Tukey HSD post-hoc）。 これは、マルトデキストリンを摂取した対照群における群集構造との比較である（表S1）。 さらに、ε-ポリリジン（ペクチン複合体なし）給餌マウスは、研究の中間段階（すなわち5週間）において、ファーミキューテスが相対的に欠乏した群集を呈した。 しかし、9週間後のサンプリング時点では、Firmicutes OTUは初期濃度まで回復していた（ベースライン：55.24％、中間：55.24％）。 34.71％、最終 59.01%, ベースライン対中間：p < 0.05, 中間対最終：p < 0.05, multi-way ANOVA Tukey HSD post-hoc） (Fig. 2 and Table S3). 同じ適応反応を示すBacteriodetes OTUの相対割合は、給餌5週目に一過性に増加し、最終時点では初期濃度に収束した（ベースライン：35.40％、中間地点：0.05％、最終地点：0.05％）。 ベースライン: 51.18%, 中間: 28.82%, ベースライン vs 中間: p < 0.05, 中間 vs 最終: p < 0.05, multi-way ANOVA Tukey HSD post-hoc） (Fig. 2 and Table S3). Verrucomicrobiaの一過性の急増は、ペクチンだけを与えたマウスでも同様に起こり、最終サンプリングポイントでは元のレベルまで低下した（ベースライン：0.59％、中間値：0.05％）。 5.46％、最終。 1.01%, ベースライン対中間：p < 0.05, 中間対最終：p < 0.05 multi-way ANOVA Tukey HSD post-hoc） (Fig. 2 and Table S4). これらの結果は、特定の食品グレードの生体高分子が、ネズミの腸内の植物区表示を一過性に誘導することを示すものである。 これは、ε-ポリリジンとペクチンの両方を個別に取り込んだときに観察された。 しかし、ε-ポリリジンをアニオン性ペクチンと複合化させた場合には、この現象は観察されなかった。 また、Actinobacteria、Deferribacteres、Proteobacteria内の有意な個体数の変動は、食餌に関わらず観察されなかったことは注目に値する（表S5）。

門レベルのコミュニティ崩壊に加えて、いくつかの細菌属は、食物生体高分子に反応してシフトしていた。 これには、マウスの腸内で最も頻繁に遭遇する分類群であったバクテロイデス属のメンバーが含まれる（すべてのサンプルにわたって14.32±9.58％）。 合計すると（雌雄およびサンプリング地点の両方において）、Bacteroides属の割合は、バイオポリマーの摂食グループに関して変化した。 バクテロイデス門による反応を反映して、ε-ポリリジン（p < 0.05, マルチウェイANOVA Tukey HSD post-hoc） およびε-ポリリジン-ペクチン複合体処理（p < 0.05, マルチウェイANOVA Tukey HSD post-hoc） により、マルトデキストリン対照群に比べ、バクテロイデス属がそれぞれ 7.95 および 7.46% 増加した（図 3 および表 S6）。 給餌レジームによって変化したその他の細菌集団には、Adlercreutzia、Lactobacillus、Turicibacter、およびRuminococcus（マルチウェイANOVA、p < 0.05）が含まれていた。 特に、Adlercreutziaは、バイオポリマーに関係なく、マルトデキストリン給餌群に比べ減少していた。 また、ε-ポリリジン、ペクチン、ε-ポリリジン-ペクチン複合体を与えたマウスでは、それぞれ0.18%、0.22%、0.24%相対的に個体数が減少していることがわかった。 また、Ruminococcus属はε-ポリリジンに対して1.39%の有意な減少を示し、ペクチン群では1.44%の減少を示した。 さらに、ε-ポリリジン-ペクチン複合体飼料はLactobacillusを4.95%有意に減少させ、この群ではFirmicutesが全体的に減少していることを反映している。 これは、ペクチン飼料が他の3つの飼料に比べてTuricibacterに富んでいるのとは対照的である。 バイオポリマー条件への反応において異なる属の完全なカタログは、表S6に提供される。

Maltodextrin is commonly employed as a thickening agent or filler in various nutritional applications.B ベースラインは、MD マルトデキストリンとPL ε-ポリリジンの複合体、P ペクチンとPL+P ε-ポリリジンの複合体である。 この多糖類は、すべての処理飼料の処方において使用され、したがって、マルトデキストリン単独が、d-グルコース残基間のα-1-4グリコシド結合を加水分解する能力を有する細菌を濃縮するかどうかを決定する対照として使用された。 そのため、マルトデキストリンを摂取したマウスの腸内では、コプロコッカス菌の相対的な存在量が増加した。 その結果、ベースラインと中間地点の間、およびベースラインと最終地点の間で有意な増加が見られた（ベースライン：0.56％、中間地点：0.05％、最終地点：0.05％）。 0.98％、最終。 ε-ポリリジン処理群では、バクテロイデスの相対量が一過性に増加し、門レベルでの振動と一致した（baseline: 8.85%, intermediate: 0.98%, final: p < 0.05 ）（図3および表S7）。 34.40%, 最終 8.74%, ベースライン vs. 中間: p < 0.05, 中間 vs. 最終: p < 0.05）。 Oscillospiraでも同様の反応が見られた（baseline: 4.96%, intermediate: 2.51%, final: 6.13%, ベースライン vs. 中間: p < 0.05, 中間 vs. 最終: p < 0.05)。 これは、Ruminococcusに割り当てられたOTUの一過性の減少とは対照的である（ベースライン：2.17％、中間：0.05％、中間：0.05％）。 ベースライン：2.17%、中間：0.97%、最終：2.10%、ベースライン vs. 中間：p < 0.05、中間 vs. 最終：p < 0.05）、Adlercreutzia（ベースライン：0.49%、中間：0: 0.24％、final: 0.34％、ベースライン対中間：p < 0.05）（図3、表S8）。 さらに、Coprococcus spp.は、給餌中に持続的な濃縮を示し、ベースラインと最終時点の間で有意に増加した（ベースライン：0.47％、中間値：0.24％、ベースライン vs. 中間値：p < 0.05）。 0.71％、最終 0.91%, ベースライン vs. ファイナル: p < 0.05) (Fig. 3 and Table S8). これは、マルトデキストリン対照群内で観察された同じ傾向と一致する。 しかし、Coprococcusの個体数は、ペクチンおよびε-ポリリジン-ペクチン複合体を与えたマウスでは比較的静止したままである。

ペクチンは、Akkermansia属に一過性に富み（ベースライン： 0.59%, 中間。 5.46％、最終 また，ペクチンはAkkermansia属に一過性に濃縮され，Verrucomicrobia属の中間的な増加の一因となった（ベースライン：0.59%，中間：5.46%，最終：1.01%）． 一方、Adlercreutziaは中間地点で減少し、最終地点では減少したままであった（Adlercreutzia baseline: 0.48%, intermediate: 0.23％、最終 0.26％、ベースライン対中間：p < 0.05）。 候補属のrc4-4 OTUの割合は、比例して減少したが、初期状態への回復は不完全であった（rc4-4 baseline: 1.94%, intermediate: 1.04％、最終 ベースライン：1.94%、中間：1.04%、最終：1.62%、ベースライン vs 中間：p < 0.05） （図3および表S9）。 興味深いことに、Ruminococcus spp.は、ベースラインと最終時点の間に有意差をもって、摂食試験全体にわたって減少の軌跡を維持した（ベースライン：2.32％、中間時点：1.04％、ベースライン vs. 中間時点：p < 0.05）。 1.63％、最終。

ほとんどの属はε-ポリシン-ペクチン複合体に反応して変化しなかったが、Ocscillospiraは初期レベルを下回る前に一過性に増加した（ベースライン：3.56％、中間：0.05）。 ベースライン：3.56％，中間：4.70％，最終：2.44％，中間 vs. 最終：p < 0.05）。 一方、パラバクテロイデス類は、いずれの食餌療法によっても概ね抑制された（ベースライン：3.44％、中間値：4.70％、最終値：2.44％）。 0.79%, final: 0.55%, ベースライン vs. 中間: p < 0.05, ベースライン vs. 最終: p < 0.05）。 これは、rc4-4（ベースライン：2.82％、中間：0.55％）と同様である。 0.77％、final: 0.48％、ベースライン対中間：p＜2044＞0.05、ベースライン対最終：p＜2044＞0.05）。 全体として、腸内細菌叢の属は、属レベルで食品グレードの添加物、特にε-ポリリジンに反応する（図3および表S10）

特定の分類群に影響を与える食物バイオポリマーに加えて、コミュニティの構造組成は、集合的に識別可能でランダムではない変化を有していた。 999個の並べ換えを用いたANOSIM46を使用して、重み付けされたUniFracに基づくサンプルグループ間の有意差を検定した41。予想通り、マルトデキストリンは、雌または雄マウスのいずれにおいても、この対照を与えたマウス腸内細菌群集を著しくシフトしなかった（図4a、999個の並べ換えによるANOSIM、p > 0.05）。 したがって、ペクチン（図4c、999通りの並べ換えによるANOSIM、p＜2488＞0.05）およびε-ポリリジン-ペクチン複合体（図4d、999通りの並べ換えによるANOSIM、p＜2488＞0.05）は、コミュニティ内の有意なシフトを促進しなかった。 これは、ε-ポリリジン単独で一過性に変化した腸内細菌叢とは著しい対照をなしている。 門や属のレベルで特定の分類群に見られるように、群集構造は5週間の時点で乱れ、その後、最終的なサンプリング時点で解消された。 これは、継続的に供給されるバイオポリマーへの適応により、個体群構成が初期状態に修正されたことを示唆している（Fig. 4b, ANOSIM with 999 permutations, p < 0.05）。 これは、ε-ポリリジン-ペクチン複合体処理マウスでは観察されず、微生物群集との遮蔽相互作用を示唆するものである。 4

ε-ポリリジンはメタゲノム機能の予測を一時的にシフトする

16S rRNA系統樹データに基づいてPICRUSt（Phylogenetic Investigation of Communities by Reconstruction of Unobserved State）によって腸内細菌群固有のメタゲノム可能性が推測された。 その結果、48の腸内細菌群集を網羅する254の機能性パスウェイに分類されました。

合計で、マウスがε-ポリリジンを摂取している間に一過性に有意にシフトすると予測されたパスウェイは44個ありました（ボンフェローニ補正付き ANOVA、p < 0.05） （図5）。 分類学的構造の変化と同様に、5週間後に採取した中間サンプルは、ベースラインおよび最終サンプリング時点と比較して、有意に異なるプロフィールを示していた。 これら44のパスウェイまたはネットワークのうち、42のパスウェイは細菌の代謝に関与しているか、さもなければ宿主-微生物相互作用を媒介すると予測され、3つのサンプリングポイントの平均に基づく相対存在量0.5%のパスウェイが18本存在した（図5）。 このうち、8つのパスウェイは5週間後に減少し、最終サンプリング時にはベースレベルに戻ると予測された。 逆に、10個のパスウェイは、一時的に存在量が増加することが予測された。 その結果、一般溶質輸送（ベースライン：7.53%、中間：5.88%、最終：7.68%、p < 0.05）、ABCトランスポーター（ベースライン：3.35%、中間：2.76%、最終：3.44%、p < 0.05）に関する遺伝子およびそのパスウェイは中間群集状態で抑制されて、結局ベースラインのレベルまで戻ってきた。 このことは、微生物相の構造が回復する前に、代謝の必要性や望ましい溶質の環境中濃度が一時的に低下する可能性があることを示唆している。 さらに、宿主がε-ポリリジン強化食を摂取している間、炭水化物およびタンパク質代謝に関わる中心的な代謝過程が可逆的な状態へと移行することが予測された。 これは、解糖/発酵経路（ベースライン：1.05%、中間：1.13%、最終：1.08%、p < 0.05）、ピルビン酸代謝（ベースライン：1.01%、中間：1.07%、最終：1.02%、p < 0に反映される。05）、フルクトース・マンノース代謝（ベースライン：0.085％、中間：0.099％、最終：0.089％、p < 0.05）、酸化的リン酸化関連遺伝子（ベースライン：1.12％、中間：1.23％、最終：1.08％、p < 0.05 ）が挙げられます。 後者のKOは嫌気性呼吸に関与している可能性が高く、中間点で一過性に濃縮された。 糖鎖異化作用に加え、アミノ糖・ヌクレオチド糖代謝（ベースライン：1.47%、中間：1.60%、最終：1.50%、p < 0.05）、ヒスチジン代謝（ベースライン：0.062%、中間：0.067%、最終：0.061%、p < 0.05）など窒素フラックスに関するパスウェイも5週間目にシフトしていることが確認された。 我々は当初、PLまたはPL-P飼料でε-ポリリジンを与えたマウスの予測メタゲノムには、リジン異化作用の特徴が濃縮されていると仮定していた。 しかし、このシグナルはPICRUSt解析では観察されず、ε-ポリリジンはリジン異化能を高める細菌集団を選択しなかったことが示唆された。

予測メタゲノムが飼料ε-ポリリジンに反応したのに対し、他の3つの摂食グループでは有意差は検出されませんでした。 これにはペクチンと複合化したε-ポリリジンを与えたマウスも含まれ、ε-ポリリジンの抗微生物作用を緩和する静電シールドのさらなる裏付けとなった。 ペクチン単独では、群集構造や予測される機能は変化しない。

宿主の性別は、基礎マイクロボームに影響を与えるが、反応の軌道には影響しない

マイクロバイオーム内の生体高分子活性が性別に依存するかどうかを調べるために、オスとメスのマウスを観察した。 その結果、いくつかの細菌分類群が雄と雌の動物に非対称に、かつ非ランダムにコロニーを形成した。 これには、集合的にオスよりもメスマウスでより高い濃度で見つかったVerrucomicrobia門が含まれる（メス：24サンプルの4.96％、オス：24サンプルの2.63％、p < 0.05, multiway ANOVA）（表S11）。 この多くは、Akkermansiaの個体数の違いによって説明されるかもしれない（雌：4.50%、雄：2.63% p < 0.05）。 また、メスマウスはParabacteroides属（メス：2.47%、オス：0.5%、p < 0.05）およびBilophila属（メス：2.13%、オス：0.01%、p < 0.05）の細菌集団を著しく多く保有することが判明した。 一方、雄マウスには、Odoribacter（雌：0％、雄：0.92％、p < 0.05）、Turicibacter（雌：0.02％、雄：0.21％、p < 0.05）、Clostridium（雌：0.01％、雄：0.10％、p < 0.05）と候補属rc4-4（雌：0.分類学的な違いに加え、図6aの主座標分析（PCoA）で可視化したUniFrac距離では、動物の性別に起因する群集の構造的な違いがあることが明らかになった。 したがって、雌雄のマウスで観察された腸内細菌叢は、性別によってクラスタリングされ、それぞれの性別内で互いにより似ている（図6a、ANOSIM with 999 permutations、p < 0.05）。 さらに、相対的な存在量に基づくマイクロバイオームと細菌属の階層的クラスタリングでは、同じ性内の細菌群集がクラスタリングする傾向があるという同様のパターンが示された（図S2およびS3）。 雌雄の平均的なグループ内系統多様性は雄マウスよりも小さいが（図6b、t検定、p < 0.05）、観察されたOTUの総数およびChao 1指数では雌雄間の差は観察されなかった（図）。 6324>

雌の宿主と雄の宿主のマイクロバイオームの構造の違いとは対照的に、予測されたメタゲノム経路はわずか3つが有意に変化しているのみであった。 これには、転写関連操作（女性：0.0092％、男性：0.0051％、p＜2044＞0.05）、アミノグリコシド抗生物質生合成（女性：0.087％、男性：0.080％、p＜2044＞0.05）、グリセロリン脂質代謝（女性：0.55％、男性：0.52％、p＜2044＞0.05）であった。 これらは、宿主の雌雄間で発現する代謝の違いの背景にあるかどうかは不明である。 性差があるにもかかわらず機能が保存されていることは、以前に他の微生物群集で観察された遺伝的潜在力の冗長性と一致する46, 47

PCoA 分析で示されたように、性差に依存しないバイオポリマー処理の特異的効果は残っていた（図3）。 具体的には、ε-ポリリジンは、性別に関係なく中間サンプリング時点でネズミのマイクロバイオームを一過性に変化させる。 一方、ペクチンまたはペクチンとε-ポリリジンとの複合体は、雌雄マウスの保有する微生物相を変化させない。 また、BacteriodesとFirmictuesの発現がε-ポリリジンに応答して一時的にシフトすることから、門レベルのフラックスにおいても同様の反応経路が明らかになった（Fig. S5）。 また、両性由来の腸内細菌叢は、ペクチン摂取時にVerrucomicrobiaで同様の変化を示した（Fig. S5）。 さらに、マルトデキストリン給与群に比べ、ε-ポリリジン-ペクチン複合体給与群では、性別に関係なくバクテリオデット属が増加し、ファーミキューテス属が減少した。 これらの結果は、性依存的な形質（ホルモンなど）が食餌性生体高分子と相乗的または拮抗的に作用して全体的な、また主要な植物群内の群集構造を変化させないことを示している。

興味深いことに、食餌性生体高分子は性に多少依存する属構成を変えるかもしれない。 Parabacteroides (sex*treatment p < 0.05, multiway ANOVA), Clostridium (sex*treatment p < 0.05, multiway ANOVA), Coprococcus (sex*treatment, p < 0.05, multiway ANOVA) および Bilophila (sex*treatment p < 0.05, multiway ANOVA) の相対存在度には宿主性別へのわずかな依存が見られた（図 S6）. メスマウスでは，ペクチン群で他の3群に比べCoprococcus量が多かった（MD：0.69％，PL：0.63％，P：0.98％，PL＋P：0.65％，MD vs. P：p < 0.05，PL vs. P：p < 0.05，P vs. PL＋P：p < 0.05)． しかし，雄マウスでは，ペクチン群のCoprococcus OTUが他の3群と比較してマイクロバイオームで減少した（MD: 0.94%, PL: 0.77%, P: 0.45%, PL+P: 0.78%, MD vs. P: p < 0.05, PL vs. P: p < 0.05, P vs. PL+P: p < 0.05)． また、ε-ポリリジンを与えた雌マウスでは、ε-ポリリジン-ペクチン複合体飼料に比べてBilophilaが減少したが（MD: 0.51%, PL+P: 1.63%, p < 0.05）、雄マウスのマイクロバイオームはこの性差による集団流動性を示さないことが明らかとなった。 さらに、性、サンプリングポイント、バイオポリマーの相互作用は、観察されたTuricibacter属（p < 0.05）、Clostridium属（p < 0.05）、Coprococcus属（p < 0.05）、候補属rc4-4（p < 0.05）の相対存在量に影響を与えた＜6324＞。