蛍光タンパク質タグ

はじめに

蛍光タンパク質（FP）は、1990年代半ばから主に細胞生物学や蛍光顕微鏡でタンパク質タグとして使用されてきた。 これらのタグは、ほとんどすべてのタンパク質のイメージングを可能にし、細胞生物学に革命をもたらしただけでなく、生化学的なアプリケーションにも使用されている。 重要な例として、FPタグ付きタンパク質の免疫沈降やアフィニティ精製が挙げられる。これは、ChromoTek社のNano-Traps（https://www.chromotek.com/products/detail/product-detail/nano-traps/）のような収率、純度、親和性に優れたアフィニティ樹脂の開発により可能となった。

このブログでは、

• 緑色蛍光タンパク質
• 赤色蛍光タンパク質
• 自己標識タンパク質についてのレビューをお届けします。 712>

Types of fluorescent proteins

Most researchers use intrinsically fluorescent proteins GFP, mNeonGreen, TurboGFP, RFP, or mCherry. あるいは、非蛍光タンパク質に蛍光分子を共有結合させる必要がある、外来性蛍光タンパク質または自己標識タンパク質が導入されている（例えば、タンパク質タグSNAP、CLIP、Haloなど）。 これらの自己ラベリング蛍光タンパク質は、その蛍光色素の特性により、内在性FPよりもある種の性能上の利点を有する。

図1：蛍光タンパク質の構造。

(A) EGFP、GFP、RFP、mNeonGreen、turboGFPなどの内在性蛍光タンパク質（FP）は、共通の残基はわずかであるが、すべて保存されたβバレル構造に折り畳まれている。 これらの蛍光は、このバレルの中央にある3つのアミノ酸残基（右図参照）の骨格環化と酸化により、2つの環状発色団が形成されることで生じる。 この化学的プロセスは発色団の成熟と呼ばれ、タンパク質フォールドに固有であり、温度や酸素濃度などの環境変数にのみ依存し、追加の酵素には依存しない。

(B) HaloTagのような外部蛍光タンパク質は、基本的なアポ型では非発光である。 適切な活性化蛍光体がHaloTagタンパク質に加えられた場合のみ、この蛍光体はHaloTag残基D106に捕捉され共有結合し、HaloTagが蛍光を発するようになる。 (PDB ID: EGFP, 2y0g; apo-HaloTag, 5uy1; holo-HaloTag, 5uxz.)

Jellyfish Green Fluorescent Protein (GFP) とその派生物は、生物医学研究において未だに最も頻繁に使用されている蛍光タンパク質である。 最近、他の生物に由来する緑色蛍光タンパク質が追加で導入されている。 これらの蛍光タンパク質はGFPと基本的な構造は同じですが、配列レベルでは大きく異なっています。 そのため、抗体などの新しい専用の研究ツールが必要となる。 GFP

緑色蛍光タンパク質は、1962年に下村脩によってクラゲのオワンクラゲから初めて単離されました。 長いストークスシフトの緑色蛍光（ex 395 nm; em 509 nm）を持ちます。 30年後、Douglas PrasherがGFPの塩基配列をクローニングし、Martin Chalfieがこの塩基配列を生体内で発現させることに成功した。 その後、Roger Tsien研究室がGFPを一連の研究ツールとして発展させた。 下村、チャルフィー、ティエンの3人は2008年にノーベル賞を受賞している。 ロジャー・ツィエン氏のノーベル賞受賞記念講演はこちら。 https://www.nobelprize.org/prizes/chemistry/2008/tsien/lecture/.

科学者たちは、さまざまな特性を持つGFPの変異体を数多く開発しました。 これらのFPは機能的、スペクトル的な特性が異なっている。 GFPの最初の重要な改良は、蛍光シグナルの強度と安定性を高める変異（S65T）であった。 主な励起ピークは488 nmにシフトしている（Heim et al.、1995）。 1391>

Green Fluorescent Protein GFPはavGFP、wtGFP、gfp10としても知られ、EGFPはenhanced GFP、GFPmut1として知られています。

https://www.fpbase.org/protein/avgfp/

https://www.fpbase.org/protein/egfp/

TurboGFP

2004年に報告されたTurboGFPは、橈脚類のPontellina plumata由来のCopGFPから得られた高速成熟で明るい二量体のグリーン蛍光タンパク質である。 橈脚類TurboGFPは、EGFPなどのクラゲ由来の蛍光タンパク質とは進化的に距離があり、一般的に使用されているGFPの変種とは約20%の配列同一性を有しているに過ぎません。 1391>

https://www.fpbase.org/protein/turbogfp/

mNeonGreen

mNeonGreen はイシガイの多量体黄色蛍光タンパク質に由来しています。 mNeonGreenと一般的なGFPの配列の相同性は約20%に過ぎません。 配列の類似性が低いため、GFPの変異体に対するアフィニティツール（すなわち抗体）は、mNeonGreenに結合しないことが予想されます。 確かに、これはChromoTekのアフィニティ試薬（抗GFPナノボディ/ VHHおよび抗体）で示されています。

2013年に初めて発表されたmNeonGreenは、GFPの最大3倍の明るさを持っています。 これは、超解像度顕微鏡を含むイメージングアプリケーション用の、新しい、単量体の多用途の緑/黄色蛍光タンパク質である。 さらに、mNeonGreenは、蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）アプリケーションにおいて、シアン蛍光タンパク質のアクセプターとして機能する。 mNeonGreenは、これまで知られている中で最も明るい単量体の緑色蛍光タンパク質で、成熟速度も速いようです。

https://www.fpbase.org/protein/mneongreen/

GFP, TurboGFP.の比較。 mNeonGreen

との塩基配列同一性の研究。

Property	EGFP (most commonly used GFP derivative)	turboGFP	mNeonGreen
Discovery/ja 。 初出
起源	クラゲからのGFP Aequorea victoria	COPGFP from copepod Pontellina plumata	lancelet Branchiostoma lanceolatum
成熟速度（37℃）	25 min	25 min min	10 min
EGFP	(100%)	~20%
GFP 由来か？	Yes	No
Structure	Weak ダイマー	Dimer
Common variants	AcGFP.Dimer	Monomer	Monomer クローバー、eGFP、エメラルド、GFP、GFP5、GFPエンビー、GFP S65T、mGFP、mPhluorin、PA-GFP、スーパーフォルダーGFP、タグGFP、タグGFP2、モノマーeGFP A206K, CFP, eCFP, mCerulean, YFP, Citrine, eCitrine, eYFP, Venus, Ypet, BFP	TurboGFP, CopGFP	mNeonGreen
励起/発光最大	488nm/ 509nm	482 nm/ 502 nm	506 nm/ 517 nm
長さと分子量 (MW)	239 amino acid.を含む。 26.9 kDa	2x 232 amino acids, 2x 26 kDa	237 amino acids, 26.6 kDa
ChromoTek が提供するリサーチ ツール Immunoprecipitation: GFP-Trap Immunofluorescence: GFP-Booster, Rabbit anti-GFP antibody PABG1 Western blot: Rat anti-GFP antibody Control: 精製EGFPタンパク質	Immunoprecipitation: TurboGFP-Trap	免疫沈降：mNeonGreen-Trap 免疫蛍光を示す。 マウス抗mNeonGreen抗体 Western blot: Mouse anti-mNeonGreen antibody

Red fluorescent proteins (RFPs) は赤-オレンジ色の蛍光を発するFPであり、このRFPsは赤色蛍光を発する。 最初に実用化されたRFPはDsRedである。 1999年にDiscosoma sp.のイソギンチャクから誘導された。 (i) 成熟時間が約24時間であり、短時間の実験には使えない。 (ii)4量体であるため、結合しているタンパク質の機能を損なう可能性がある。 (iii)光安定性が低い。

その結果、DsRedは部位特異的変異導入により、遺伝的にコードされた融合タグとして一般に使用できるようになった。 その結果、蛍光性能（輝度、光安定性）が高く、成熟効率の高い単量体RFP誘導体が作製された。 さらに、橙色、赤色、遠赤色の蛍光を発する誘導体も作製された。 これらのRFPの単量体化体は、mCherry、mOrange、mRaspberry、mPlum（mFruits）、mKO、mRFP（a.k.a. mRFP1）、mRFPruby、mRuby、tagRFP、mKate2、DsRed-Expressなど。

他のアントゾアン（すなわち、アネモネやサンゴ）で追加のRFPが確認されたが、これらのタンパク質もほとんどが4量体であった。

mRFP (mRFP1)

Roger Tsien の研究室で遺伝子操作された dsRed の最初の単量体変異体は、単に mRFP (mRFP1) 、すなわち単量体赤色蛍光タンパク質と名づけられました。 mRFP1は、dsRedと比較して、吸収率、量子収率、光安定性のレベルがやや低いことが特徴である。 しかし、その成熟速度はDsRedの約10倍であり、生細胞で発現させた場合の実効輝度は同等である。

https://www.fpbase.org/protein/mrfp1/

mCherry

mCherry はおそらく最もよく使われているRFP variantである。 単量体の赤色蛍光タンパク質で、様々な細胞種で融合タンパク質として幅広く適用できます。 他のmFruit RFPと同様に、mCherryはRoger Tsienの研究室によって、dsRed変異体であるmRFP1から有向進化で派生したものである。 他のmFruitと比較して、mCherryは最も高い光安定性、最も速い成熟速度、および優れた耐pH性を有しています。 しかし、量子収率は mRFP1 よりも低い。

https://www.fpbase.org/protein/mcherry/

mPlum

Roger Tsien 研究所は mRFP1/dsRed の遠赤色単量体も生成し、mPlum と名付けている。 遠赤色蛍光体は、水、脂質、ヘモグロビンなどの主な組織吸収体が650-900 nmの発光範囲ではほぼ透明であるため、全身を画像化するアプリケーションに有益である。 ほとんどの赤色シフトRFPと同様に、mPlumは拡張ストークスシフトを特徴とする。

https://www.fpbase.org/protein/mplum/

mCherry, mRFP (mRFP1)の比較。 mPlum

の順。

特性	mCherry	mRFP (mRFP1)	mPlum
発見/初公開 publication
Origin	DsRed from Sea Anemone Discosoma sp.	イソギンチャク Discosoma sp.由来DsRed	イソギンチャク Discosoma sp.由来DsRed	イソギンチャク Discosoma sp.
成熟速度（37℃）	15 min	60 min	100 min
構造	モノマー	モノマー
集合	集合	no	no
励起/発光最大	587 nm/ 610 nm	584 nm/ 607 nm	590 nm/ 649 nm
Length/ molecular weight (MW)	236 amino acid.の長さは、1,000 nmです。 26.7 kDa	228 amino acids, 25.4 kDa	229 amino acids, 25.6 kDa
ChromoTek提供リサーチツール	Immunoprecipitation: RFP-Trap 免疫蛍光法。 RFP-Booster、ラット抗RFP抗体 Western blotting。 マウス抗RFP抗体	Immunoprecipitation: RFP-Trap 免疫蛍光法。 RFP-Booster、ラット抗RFP抗体 Western blotting: マウス抗RFP抗体	Immunoprecipitation: RFP-Trap 免疫蛍光法。 RFP-Booster、ラット抗RFP抗体 Western blotting: マウス抗RFP抗体

extrinsically fluorescent protein tags Halo, SNAP, and CLIPは、蛍光タンパク質に変わるために小さな蛍光リガンドを共有結合的に捕らえる必要があります。 このため、これらの自己標識タンパク質タグは、化学結合の形成を触媒する酵素に由来する。 SNAPタグとCLIPタグはO6-アルキルグアニン-DNAアルキルトランスフェラーゼの変異体で、それぞれベンジルグアニン誘導体とベンジルシトシン誘導体と反応する。 HaloTagはハロアルカンデハロゲナーゼに由来し、アルキルハライドと反応する（図1）。

一般に、内在性および外来性の蛍光タンパク質は、その細胞イメージングや検出を可能にするために、目的のタンパク質に融合される。 しかし、外来蛍光タンパク質は、反応性蛍光体の添加を必要とし、これにはいくつかの利点がある。

• 高い量子収率と光安定性
• 生細胞および固定細胞の両方で強い蛍光
• 蛍光色素の幅広い選択
• 単一の遺伝子構築により、マルチカラーのための異なる蛍光体の選択が可能になる imaging/multiplexing
• Fluorescence only initiated upon addition of label

基質/リガンド特異性の異なる3種類の外来性蛍光タンパク質があり、多重実験に直交して使用することができます。 また、内在性FPとの併用も可能です。

実験の必要性に応じて、テトラメチルローダミン（TMR）、オレゴングリーン、diAcFAM、クマリンなどの細胞膜を容易に透過するリガンドを使用して、細胞内タンパク質を標識することができます。 また、Alexa Fluor® 488や660のような不透過性の蛍光色素を用いた細胞不透過性リガンドを適用して、細胞表面の迅速な標識化を行うことも可能である。

HaloTag、SNAP-Tagの比較。 およびCLIP-Tag

。

由来ハロアルカンデハロゲナーゼ

。 ビーズ

プロパティ	HaloTag	SNAP-Tag	CLIP-…タグ
発見・初公開
起源	Rhodococcus rhodochrous	ヒトO6-…アルキルグアニン-DNA-アルキルトランスフェラーゼ	ヒトO6-アルキルグアニン-DNA-アルキルトランスフェラーゼアルキルトランスフェラーゼ
構造	モノマー	Monomer	モノマー
反応性	クロロアルカン誘導体	O6-」とある。ベンジルグアニン誘導体	ベンジルシトシン誘導体
リガンド	細胞透過性または非透過性の染料。 蛍光色素、ビオチン、ビーズ	細胞透過性または非透過性の色素、蛍光色素、ビオチン、ビーズ	細胞透過性または非透過性の色素、蛍光色素、ビオチン、ビーズ
励起/発光最大値	カップル蛍光体による	カップル蛍光体に依存する。	Depends on coupled fluorophore
Length/ molecular weight (MW)	297 amino acids.LONG/ MW (Long)です。 33.6 kDa	182 amino acids, 19.4 kDa
ChromoTek が提供するリサーチツール	Immunoprecipitation: Halo-Trap ウェスタンブロッティング：マウス抗HaloTag抗体	Immunoprecipitation: SNAP/CLIP-tag-Trap Western blotting: ラット抗SNAP/CLIP-tag®抗体	Immunoprecipitation: SNAP/CLIP-tag-Trap Western blotting: rat anti-SNAP/CLIP-tag® antibody

HaloTag

自己標識HaloTagはRhodococcus rhodochrous由来のハロアルカン脱ハロゲン化酵素DhaAから派生しています。 その活性部位は、クロロアルカンリンカー基質と不可逆的に結合するように遺伝子改変されています。 このような自殺的阻害のため、さらなる脱ハロゲン化のための触媒部位の再生はもはや不可能である。 選択された基質に応じて、HaloTagは蛍光タンパク質タグに変換されるか、または例えばアガロースビーズに固定化される。

ハロアルカンデハロゲナーゼは真核細胞およびE.を含むほとんどの原核生物に存在しないため、ハロアルカンデハロゲナーゼを選択することはできない。

ハロアルカンデハロゲナーゼは真核細胞や大腸菌を含むほとんどの原核生物に存在しないため、バックグラウンドでの標識はありません。

SNAP-tag

自己標識タンパク質タグSNAP-tagはヒトO6-アルキルグアニン-DNA-アルキル転移酵素（hATG）に由来し、野生型タンパク質として、DNAからアルキル化ダメージを除去するものである。 SNAPタグとして用いられるhAGTは、O6-ベンジルグアニン誘導体（グアニンまたはクロロピリミジン残基とベンジルリンカーを介して結合した蛍光ラベル）と不可逆的かつ高い特異性で共有結合し、反応させることができる。

CLIP-tag

CLIP-tag はSNAP-tagの改良型で、ベンジルグアニン誘導体ではなくベンジルシトシンと反応するように設計されたものである。 SNAP-tagと併用することで、CLIP-tagは同一細胞内で同時に2つのタンパク質を直交かつ相補的に標識することができます。

A guide to choosing fluorescent proteins
Shaner N.C, Steinbach P.A. and Tsien R.Y. (2005)
Nature Methods 2(12), 905-909 doi: 10.1038/nmeth819
http://www.tsienlab.ucsd.edu/Publications/Shaner%202005%20Nature%20Methods%20-%20Choosing%20fluorescent%20proteins.pdf1391>

グリーン蛍光タンパク質：
The green fluorescent protein
Tsien R．Y. (1998)
Annual Review of Biochemistry, 67(1), 509-544. doi: 10.1146/annurev.biochem.67.1.509.8387＞＜1391＞＜5386＞改良型緑色蛍光＜8387＞Heim，R． Cubitt A.B. and Tsien R.Y. (1995)
Nature, 373, 663-664. doi: 10.1038/373663b0

Structural basis for the fast maturation of Arthropoda green fluorescent protein
Evdokimov A.G.., Pokross M.E., Egorov N.S., Zaraisky A.G., Yampolsky I.V., Merzlyak E.M., Shkoporov A.N., Sander I, Lukyanov K.A and Chudakov D.M. (2006)
EMBO reports, 7(10), 1006-1012・ doi: 10.1038/sj.embor.7400787..

Branchiostoma lanceolatum由来の明るい単量体緑色蛍光タンパク質
Shaner N.C., Lambert G.G., Chammas A., Ni Y., Cranfill P.J. Baird M.A., セル・ビー・アール、アレン・J・R、デイ・R・N、イズラエルソン・M、デビッドソン・M・W、ワン・J (2013)
Nature Methods, 10(5), 407-409.doi: 10.1038/nmeth.2413

赤色蛍光タンパク質：
Discosoma sp.由来の改良型単量体赤色、オレンジ、黄色蛍光タンパク質
Shaner N.C., Campbell R.E., Steinbach P.A., Giepmans B.N.G.., Palmer A.E. and Tsien R.Y. (2004)
Nature Biotechnology, 22(12), 1567-1572. doi: 10.1038/nbt1037

A monomeric red fluorescent protein
Campbell R.E., Tour O., Palmer A.E., Steinbach P.A.., Baird G.S., Zacharias D.A. and Tsien R.Y. (2002)
PNAS, 99(12), 7877-7882. doi: 10.1073/pnas.082243699

Evolution of new nonantibody proteins via iterative somatic hypermutation
Wang L.A. (2002)Avolution of new nonantibody proteins by反復体細胞突然変異
Wang L. (2002)12, 7877-7882, Jackson W.C., Steinbach P.A. and Tsien R.Y. (2004)
PNAS, 101(48), 16745-16749. doi: 10.1073/pnas.0407752101.Recovery of Red Fluorescent Protein Chromophore Maturation Deficiency through Rational Design
Moore M.M., Oteng-Pabi S.K., Pandelieva A.T., Mayo S.L. and Chica R.A. (2012)
Plos ONE, 7(12), e52463.doi：10.1371/journal.pone.0052463.まで。.

Halo, SNAP, and CLIP:

Releasable SNAP-tag Probes for Studying Endocytosis and Recycling
Cole N.B. and Donaldson J.G. (2012)
ACS Chemical Biology,7(3): 464-469, doi: 10.Halo, SNAP, and CLIP.CLIP:Releasable SNAP-tag Probes for Study Endocytosis and Recycling:Cole N.B. and Donaldson J.G.1021/cb2004252

Site-Specific Protein Labeling with SNAP-Tags
Cole N.B. (2013)
Current protocols in protein science / editorial board, Coligan J.E. et al.編).に掲載された。 73: 30.1.1-30.1.16., doi: 10.1002/0471140864.ps3001s73

生細胞における多タンパク質標識のための人工タンパク質タグ
Gautier A., Juillerat A., Heinis C, Corrêa I.R., Kindermann M., Beaufils F. and Johnsson K. (2008)
Chemistry and Biology 15 (2): 128-136, doi: 10.1016/j.chembiol.2008.01.007

HaloTag: 細胞イメージングとタンパク質解析のための新しいタンパク質標識技術
Los G.V., Encell L.P., McDougall M.G., Hartzell D.D., Karassina N., Zimprich C, Wood M.G., Learish R, Friedman-Ohana R, Urh M., Simpson D., Mendez J., Zimmerman K., Otto P., Vidugiris G., Zhu J., Darzins A., Klaubert D.H., Bulleit R.F. and Wood K.V. (2008)
ACSケミー（化学）。 Biol. 3(6): 373-382 doi: 10.1021/cb800025k

A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo.
Keppler A., Gendreizig S., Gronemeyer T., Pick H., Vogel H. and Johnsson K (2003)
Nat. Biotechnol. 21: 86-89, doi: 10.1038/nbt765

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging
Provost C.R. and Sun L.。 (2010)
Visualized Exp. 39: 1876, doi: 10.3791/1876

研究用途のみ。

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