Abstract
目的 フェムト秒レーザー支援白内障手術（FLACS）と標準的な超音波乳化吸引術後の前嚢の形態的特徴と上皮細胞におけるアポトーシス誘導を比較評価する。 方法 グループ1：FLACS前嚢切開術30例、グループ2：手技による前方連続カーヴィル披針術30例。 全例が同じ経験豊富な外科医によって手術された。 前方被膜の形態学的特徴と上皮細胞におけるアポトーシス誘導を評価した。 結果 全例が術後3ヶ月で平均最高矯正視力（BCVA）の有意な改善を示し、術中および術後の重大な合併症は生じなかった。 両群とも被膜上皮は保存されているように見えた。 走査型電子顕微鏡による解析では，第1群の被膜は不規則な鋸歯状のエッジを有していたが，第2群の被膜は規則的で滑らかなエッジを有していた． アポトーシスの下流エフェクターであるcleaved caspase 3は、グループ1で統計的に有意に高い発現が認められた。 結論 鋸歯状の外観は、カプセルに対するレーザーパルスの漸進的なシーケンスに起因すると考えられる。 レーザーパルスの低エネルギー/高周波特性は、パルスパターンの重なりと相まって、カプセルエッジの高度に連続的な形態をもたらした。 FLACS群で高いアポトーシス誘導が見られたのは、光崩壊によるプラズマの発生とキャビテーション気泡の形成によるものと思われた。 白内障手術は、世界で最も多く行われている手術であり、WHOの推計によると、年間2400万件まで増加している。 B-MICS（Bimanual Microincision Cataract Surgery）は、従来の同軸乳化吸引術の低侵襲化であり、1.4mmの角膜切開を可能にし、前房の高い安定性と手術中に左右両手を使える分離灌流チョッパー付きスリーブレスファコチップが使用されています
白内障手術の最新の更新は、Festosecond Laser技術の導入でした。 屈折矯正手術の角膜フラップを作る目的で角膜手術用に最初に導入されたフェムト秒レーザーから始まり、最新世代のフェムト秒レーザーのほとんどは、最大10～15μJのエネルギー範囲と160kHzの繰り返し率で白内障手術に使用されています。
光破壊の原理に基づいて、そのようなタイプのレーザーは、手作業のアプローチと比較して、より正確で再現性の高い結果を提供することに加えて、カプセルトミー、核破砕、角膜切開などの手順の中で最も難しい部分の一部を最適に標準化することができます。
フェムト秒レーザー技術の出現まで、手動連続カーヴィリニア嚢切開法（mCCC）は、白内障手術または屈折レンズ交換における前嚢の開放のための標準的な方法でした。 フェムト秒レーザー支援白内障手術（FLACS）は、この重要な手術ステップに革命をもたらし、予測可能で曲線的な被膜切開を行うことにより、手作業よりも被膜と眼内レンズ（IOL）の重なり、IOLの中心性と位置が改善されました。 特に、以前の発見は、FLACSカプセルロトミーが再現可能で正確なサイズを持ち、中央に配置され、その結果、より良いIOLの中心とIOLチルトの確率を減少させることを実証した。
いくつかの研究では、特定のレーザー波長、パルスエネルギー、パルス時間、パルスパターン、繰り返し率、スポットサイズによって作られるエッジの形態とFLACSカプセルロトミーの滑らかさが調べられた。 カプセルの予備的な分析では、著しい粗さを持つ郵便切手の様相を示し、おそらくカプセロトミー作成に使用されたレーザーエネルギーを含むいくつかの要因によって引き起こされたものです。 PCOの発症に影響を与える要因として、眼内レンズの設計、治療薬の投与、手術手技そのもの、後嚢を洗浄する他の手術手技などを定義するために、これまで多くの研究が行われてきた。
文献に報告されているように、嚢切開または嚢切除を行った場合、水晶体は機械的または光分解性の損傷を受けて、結果として上皮細胞は死滅している。 本研究の目的は、白内障手術後のヒトの水晶体嚢の形態的特徴を、超微細構造レベルでも評価することであった。 さらに、前嚢の下にある単層上皮でアポトーシスが誘発されるかどうかを、2つの手術アプローチで調べた。 材料と方法
実験研究は、モデナ・レッジョ・エミリア大学（イタリア、モデナ）のヒト研究倫理委員会の承認を受け、モデナ・レッジョ・エミリア大学眼科研究所でヘルシンキ宣言に従って実施された。 白内障LOCS III度2または3、矯正距離視力5/10以下の患者を本研究の対象とした。 眼外傷、偽剥離症候群、その他の眼科合併症がある場合は患者を除外した。 本研究は、従来の手動白内障摘出術（B-MICS）またはフェムト秒レーザーZiemer LDV Z8を用いたフェムト秒レーザーアシスト白内障手術を受ける患者の書面による同意を得て実施された。 すべての手術は、同じ経験豊富な外科医（G.M.C.）によって行われた
2.1. 手術手技
10%フェニレフリンと1%シクロペントレートを点滴して一定の散瞳を得、肋骨周囲ブロックによる局所麻酔を行った（リドカイン2%、ブピバカイン0.5%を1.5mL）
2.1.1． FSL-Assisted Technique
使い捨ての吸引リングを、辺縁を中心に、眼球に注意深く装着しました。 吸引リングは液体界面を作るためにバランス塩溶液（BSS）で満たされ、レーザーシステムの可動アームは角膜頂点上にドッキングされた。 眼球構造は統合された光コヒーレンス・トモグラフィー（OCT）システムによって示され、治療パラメータはレーザープラットフォームの設定ウィザードを使用することによってカスタマイズされた方法で決定された。 エネルギーと周波数のレーザーパルス設定は、被膜切断は900mW、1MHz、ファコフラグメンテーションは950-1000mW、2MHz、角膜切開は1200-1300mW、2MHzであった。 レーザー治療は8枚のパイカットパターンで水晶体の破砕から始まり、その後直径5.2mmの前嚢切開を行った。 最後に、レーザーで10時方向と2時方向にそれぞれ1.4mmの角膜マイクロインシジョンを2回行った。 最後に、吸引リングを眼球表面から取り外し、フェイコープロシージャーの手順を進めました。 術者は、滑らかなヘラを用いて、まず辺縁の傾きに対して垂直な傾きで、次に切開部に沿って左右に完全に開くように穏やかに動かして、CCIの開存性を確認した。 390>
ハイドロダイセクションおよびハイドロダイネーションを26ゲージカニューレを用いて行い、気泡の動きに注意しながら前嚢端下にBSSを注入し、後嚢ブロックおよび破裂を回避した。 バイマニュアル乳化吸引術では、20ゲージ30度角のスリーブレスプローブと19ゲージ潅流用チョッパー（Oertli-Instruments AG）を用いて核の吸引を行った。 最後に、楕円形の断面を持つ2本の21ゲージプローブ（21ゲージirrigation handpiece smooth, 21-gauge aspiration handpiece rough, Bausch & Lomb）を用いて残存皮質のバイマニュアルイレーション/アスピレーションを行い、続いて後嚢のポリシングを行った。 すべての眼内レンズは合併症なくカプセルバッグに入れられた。 手動前嚢切開またはFSLアシスト前嚢切開のいずれかを行った後の水晶体前嚢除去を図1に示す。
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(b)
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2.1.2. Standard Technique
術者は、10時方向と2時方向にそれぞれ1.4mmの二面台形切開を行い、プレキャリブレーションナイフと手動5mm連続曲線状被膜切開術（mCCC）で行いました。 ハイドロダイセクションは26ゲージカニューレで行い、超音波乳化は20ゲージ、30度角度のスリーブレスプローブと灌流用チョッパー（Bragamele 19ゲージ）を使用した。 乳化吸引はストップアンドチョップ法で行った。 潅流・吸引は楕円形の断面を持つ21ゲージプローブ2本で行った（21ゲージ潅流ハンドピーススムーズステラリス、21ゲージ吸引ハンドピースラフ、ボシュロム＜9898＞）。 いずれの術式も，主切開部を拡大することなく眼内レンズが留置され，切開部はハイドロカットされた。 BunnyLens AF IOL（Hanita Lenses, Israel）は、ViscoJect™ BIO 1.5インジェクターを用いて、1.4mmのマイクロ切開から創傷補助法で移植された。 術後は安全性を考慮し、OVDを除去し、切開部に水分を補給した。
術後療法は、トブラマイシン、デキサメタゾン点眼を1日4回15日間、フルルビプロフェン点眼を1日3回さらに15日間行った。 形態学的評価。 位相差、組織学的、走査型電子顕微鏡による解析
FSLアシスト法または標準法で得られた前水晶体嚢標本は、外科的摘出後すぐにリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で洗浄された。 白内障手術で得られた水晶体嚢の形態と縁を評価するために、位相差顕微鏡、組織学的および走査型電子顕微鏡による分析を行った。 試料の一部はPBS中4％パラホルムアルデヒド（PFA）で室温で20分間固定した。 その後、試料をPBSで3回洗浄し、Nikon Eclipse TE2000-U倒立顕微鏡で観察した。 CCD Hamamatsu ORCA 285カメラで代表的な位相差画像を取得した。 その後、段階的エタノールによる脱水、洗浄、パラフィンへの包埋を行い、組織学的解析に使用した。 各サンプルについて5μm厚の連続切片を切り出し、形態学的詳細を分析し、前嚢の厚さを測定するために、ルーチンのヘマトキシリン／エオシン（H&E）染色を行った。
収集したサンプルの別の部分は、外科処置直後に0.1M pH 7.4 Sorensonのリン酸バッファ（PB）で洗い、0.1M pH 7.4 PB中の1％グルタルアルデヒドで固定させた。 PBで3回洗浄した後，SEM観察を行うまで，前水晶体嚢サンプルを段階的エタノールで脱水した。 SEM画像はNova NanoSEM 450（FEI）走査型電子顕微鏡（SEM）で取得した。
これらの分析の主な目的は、上皮細胞層、カプセルエッジのフリンジの存在、エッジの粗さ/滑らかさの評価である。
2.3. LECsにおけるアポトーシスの評価
B-MICS手術アプローチ後、フェムト秒レーザーによるパルスエネルギー放出後、前水晶体嚢に付着した水晶体上皮細胞においてアポトーシスが生じたかどうかを評価するため、サンプルを共焦点免疫蛍光分析用に処理し、以前に記述したようにした。 簡単に言うと、4%で固定したカプセルをPBSで洗浄し、3%のウシ血清アルブミン（BSA）を含むPBSで30分間室温で飽和させた。 次に、3% BSA を含む PBS で 1:50 に希釈したウサギ抗cleaved caspase 3 一次抗体 (Cell Signaling) と共に、室温で 1 時間インキュベートした。 3%BSAを含むPBSで洗浄後、試料を、3%BSAを含むPBSで1 : 200に希釈したヤギ抗ラビットAlexa546二次抗体 (Life Technologies) と共にインキュベートした。 次に、試料をPBSで洗浄し、PBS中の1 mg/ml 4′，6-ジアミノ-2-フェニルインドール（DAPI）で1分間染色し、次にアンチフェーディングメディウムでマウントした。 蛍光サンプルはNikon A1共焦点レーザースキャン顕微鏡で観察した。 共焦点連続切片をImageJソフトウェアで処理して3次元投影を得、Adobe Photoshop Software .
2.4 を用いて画像レンダリングを行った。 統計解析
データは統計ソフト（GraphPad Prism Software version 7 Inc.、San Diego, CA, USA）により評価した。 2つの実験グループ間の差は、Studentの-testによって分析された。 データは平均値±SDで表した。 各実験評価は3重で行った。 いずれの場合も、有意水準は0.390とした。 結果
3.1. 臨床観察
第1群（FLACS）では、30名（男性10名、女性20名）の患者の30眼（右眼15名、左眼15名）が研究に参加し、平均年齢は74.07±8.48歳であった。 グループ2（B-MICS）では、30人（男性8人、女性22人）の30眼（右眼13人、左眼17人）が研究に参加し、平均年齢は75.72±9.16歳であった。 バニーレンズAF眼内レンズは全眼に挿入した。 手術時間はグループ1が17.89±3.80分、グループ2が12.63±2.10分であり、その差は統計学的に有意であった（）。 また、両群とも術中の重大な合併症や術後の合併症は認められませんでした。
術後3ヵ月後、第1群ではベースライン値に対して0.460 ± 0.249 LogMarの平均BCVA改善が認められました。 同様に、グループ2では、同じ評価時点で、0.417 ± 0.150 LogMarの平均BCVA改善（ベースライン値に対して）が観察された。 390>
乱視と角膜のパチメトリーに関しては、各グループ内および2グループ間のいずれにおいても、ベースラインと術後の値の間にStudentの検定で統計的に有意な差は検出されなかった()。
最後に、内皮細胞数（ECC）に関して、3ヶ月のフォローアップで、グループ1では162.27 ± 225.11細胞/mm2、グループ2では322.52 ± 339.93細胞/mm2の平均内皮細胞減少が見られ、各グループ内または2グループ間のいずれにおいても統計的に有意に減少した（）。 形態学的解析。 位相差、組織学的、および走査型電子顕微鏡による解析
位相差画像では、上皮細胞の核と細胞質がよく保存され、さらに、上皮表面のほとんどで、細胞境界が無傷であることがわかったが、被膜端の近傍では、上皮細胞が基底膜から剥離した（図2（A））。 図2(a)で報告したように、被膜の縁は規則的で滑らかな印象を受けた。 FLACS群の被膜の外観については、上皮細胞はほとんど基底膜に接着していたが、縁はあまり規則的ではなく、鋸歯状のパターンを示した（Figure 2(b)）。 組織学的解析の結果、B-MICS群では上皮層が基底膜から部分的に剥離している試料もあったが、FLACS群ではほとんどの被膜が上皮細胞と基底膜の連続的な接着を示した（図3）。 さらに、2つの実験グループの被膜の厚さを測定したところ、統計的な有意差はなかったが、差があることがわかった。 特に、FLACS法後に得られたサンプルは、B-MICS由来のカプセルと比較して、より高い厚みを示した（データは示されていない）。
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最後に、図4で報告したように、SEM分析により、基底膜への上皮細胞の接着がいかに均一であるか、そしてとりわけ、莢膜縁の出現がより高い定義で明らかにされた。 特に、B-MICS群では、被膜の縁が規則正しく、滑らかで、半透明であった（図4（a））。 それ以外のFLACSで得られた被膜の縁は、明らかに不規則で縁取りのある外観を示していた（図4（b））。
(a)
(b)
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3.3. LECにおけるアポトーシスの評価
共焦点免疫蛍光分析により、図5（a）に示すように、B-MICS群またはFLACS群のいずれかで得られた試料の水晶体上皮細胞においてアポトーシスが発生していることが明らかとなった。 手動手術法で得られた被膜では、主に被膜の縁に近い上皮細胞で切断型カスパーゼ3の存在が観察されたが、FLACS法に従って採取した試料では、上皮層の縁から中核まで、切断型カスパーゼ3に対してより広がった染色が観察された。 切断型カスパーゼ3の疑似カラー画像は、前述と同様に取得し、図5（b）に報告した。 免疫蛍光シグナルで実施したデンシトメトリー分析は、アポトーシスエフェクター切断型カスパーゼ3の発現の半定量データを提供し、これは、B-MICS群に関して、FLACS群で統計的に有意に高かった（図5（b）；）。
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4.考察
フェムト秒レーザーの使用は、2008年に初めて臨床応用されて以来、白内障手術における最新の成果である。 最適な屈折結果への期待に応える必要性が高まっているため、多くの新しい開発が実現されています。
白内障手術へのフェムト秒レーザーの適用は、文献によく示されているように、手術の安全性と有効性を向上させることができました。 実際、これまでの報告では、白内障手術の最も困難な段階を実行する際の高い再現性と精度が実証されており、これには、良好な引張強度で連続したシャープエッジの切断を生成する最適な前嚢切開が含まれています。 後者は、低エネルギー高周波システム（10 MHzまでの高いパルス繰り返し率と100-150 nJの非常に低いエネルギー範囲の組み合わせ）を利用し、被膜切除と水晶体破砕の段階を容易にする液体光学インターフェースを使用するフェムト秒レーザーであるZiemer LDV Z8を使用して収集されたものであった。 これらの特性により、位相差およびSEM解析で示されるように、手動で得られた試料と比較して、上皮細胞が均一に付着した、保存性の高い組織形態を有する前嚢標本を得ることができた。 既存の文献によると、FLACSで得られた前嚢の縁は、手作業で得られた滑らかな縁と比較して、規則性が低く、のこぎり歯状の模様が特徴であった。 FLACS群で観察されたパターンは、フェムトLDV Z8レーザーの高密度パルスラスタと高精度光学系に起因すると考えられ、複数のスポットが重なり、B-MICS法で得られたものに似た連続したきれいなカットが形成されるのです。
FLACS法で得られた前嚢標本は、B-MICS法で得られた前嚢と比較して、より高い厚みを示したが、これはおそらく前嚢に付着した皮質の存在に起因する。
組織形態の特徴に加えて、我々のデータは、両方の外科技術で得られた前嚢の上皮細胞でアポトーシスが起こることを示した。 特に，CLEAVED CASPASE 3の発現はFLACS後のサンプルで有意に高く，陽性染色は切断端に沿った細胞だけでなく，被膜の内核にも広がっており，より広範囲に細胞死を誘導していることが示唆された。 逆に、B-MICS法で採取したカプセル試料に付着している上皮層では、アポトーシスは切断縁に沿ってのみ検出され、これは鉗子を介した前嚢の摘出によって引き起こされた機械的損傷の結果であった。 FLACS後、前嚢の下にある単層上皮に影響を及ぼすこの大きなアポトーシスは、レーザーパルスエネルギー、光崩壊依存性のプラズマ形成、およびその後のキャビテーションバブルの生成に起因すると考えられる。 我々のデータはMayerらの以前の知見と一致しており、特にアポトーシスエフェクターであるcleaved caspase 3の発現の広がりは、一般的に術後の炎症反応と相関する残存上皮細胞の増殖を強く抑制し、被膜の白濁を予防するためのポジティブ予測因子となるかもしれない。 臨床的な観点からは、FLACS群、B-MICS群のいずれにおいても、術後3ヵ月後にベースラインと比較して統計的に有意な視力改善が見られたことが明らかになった。 注目すべきは、内皮細胞数で、FLACS群では角膜内皮細胞の減少が統計的に有意に観察され、これは超音波乳化吸引時間の短縮に起因する事象であった。 これらのデータは、レーザー白内障手術が角膜内皮への外傷が少ないことを示す以前の知見と一致しており、また、外科医にとって、最初の学習曲線を通じて、白内障手術の重要な段階を標準化するためのツールを提供するものである
5. 結論
白内障手術におけるフェムト秒レーザーの使用は、より正確で再現性のある結果をもたらすだけでなく、被膜切除、核破砕、角膜切開など、手術の最も難しい手順のいくつかを最適化することが可能である。 しかし、レーザーエネルギー、繰り返し率、スポットサイズの最適な組み合わせを定義することで、手技とフェムト秒レーザーの明るい面を一致させ、手技によるカプセルヘキシスに匹敵する規則的な刃先を持つより質の高いカプセルトミーを得るため、また眼内の炎症反応を軽減し、水晶体上皮細胞の増殖とカプセルバッグの白濁を防ぐためには、さらなる研究が必要である。
略語
| FLACS: | Femtosecond assisted laser cataract surgery |
| B-MICS: | Bimanual microincision cataract surgery |
| mCCC.B-白内障手術:白内障手術。 | Manual continuous curvilinear capsulorhexis |
| IOL: | Intraocular lens |
| PCO: | Posterior capsule opacification |
| BSS: | Balanced salt solution |
| OCT: | 光コヒーレンス・トモグラフィー |
| OVD: | 眼粘弾性装置 |
| PBS.PBS.PBS(PBS) | リン酸緩衝生理食塩水 |
| PFA: | Paraformaldehyde |
| H&E.E. | |
| Haematoxylin/eosin | |
| SEM: | Scanning electron microscope |
| BSA.E: | Scanning electron microscope | Bovine serum albumin |
| DAPI: | 4,6-Diamidino-2-phenylindole. |
開示
この研究は、20th AICCER meeting 2017 (Associazione Italiana di Chirurgia della Cataratta e Refrattiva), March 9-11, Rimini (Italy), 2017で一部発表されました。
利益相反
著者は金銭的利益相反が存在しないことを宣言しています。