PHMBの細菌細胞膜活性
PHMBの抗菌活性（図1）であれば、その抗菌活性は、細菌の染色体を凝縮させる。 1a）が広く報告されているように膜破壊によるものであるならば、成長阻害濃度および成長阻害以下の濃度で細菌細胞バリアを透過させると予想される。 このモデルを検証するために、まず、大腸菌（K-12株およびMG1655株）およびSalmonella Enterica serovar Typhimurium（LT2株）に対するPHMBの最小阻害濃度（MIC）と時間殺傷性を確立した。 既報2,4と同様に、PHMBは強力な増殖抑制効果および殺傷効果を示した（Supplement Table 2およびSupplement Figure 1）。 また、処理後、細胞を光学顕微鏡で観察した。 予想に反して、成長阻害濃度のPHMBは、明視野顕微鏡で観察したところ、細胞を溶解することはなかった。 顕微鏡では見えない細胞バリアの損傷を評価するために、大腸菌K-12培養物をログ期中期まで培養し、蛍光性膜完全性プローブSYTOX®Greenの存在下でPHMBで処理し、蛍光測定でモニターした。 このプローブは、通常、無傷のバクテリアからは排除され、DNAとの結合によりその蛍光量子収率が増加するため、膜損傷の指標として有用である。 したがって、無傷のバクテリアは低い蛍光を示し、細胞バリアの損傷に伴って蛍光が増加することが予想される16。 予想通り、培養したばかりの大腸菌は、既知の細胞壁破壊剤であるポリミキシンBによる処理、または熱処理によって蛍光が大きく増加した（Fig. 1b）。 しかし、PHMB処理では、予想に反して、蛍光のレベルが比較的低くなった。 最も顕著なのは、PHMBの濃度が高い場合、蛍光がバックグラウンドレベルになったことである。 これらの観察は、膜破壊が主な抗菌メカニズムであるとは一致せず、従って、確立されたモデルに対してさらなる疑念を抱かせるものであった。
細胞膜透過性および細菌への侵入に対するPHMB効果
(a)polyhexamethylene biguanide (PHMB; CAS# 27083-27-8); alternative chemical names: polyhexanide; examples trade names.の構造.PhMBは細菌への侵入のために、細胞膜透過性(epermission)と細菌への侵入(epermission)の両方に作用する。 Vantocil™、Cosmocil™、Baquacil™、Prontosan®など。 詳細は補足表1を参照。 PHMBは、塩基性ビグアニジン単位をヘキサメチレン炭化水素鎖で連結した繰り返し単位からなり、水素結合、静電相互作用、疎水性相互作用の能力が高いカチオン性両親媒性構造である。 PHMB製剤は、通常、アミン、グアニジン、シアノグアニジン末端基を持つ混合長のポリマーからなる（例：平均n = 13.8, 3,035 g/mol44） (b) SYTOX® Greenに対する細胞透過性に対するPHMB、熱、ポリミキシンB（ポジティブコントロール）およびトリクロサン（ネガティブコントロール）の影響。 試験した抗菌剤のMIC値は、上部の色分けされた縦矢印で示されている。 (c) PHMB-FITCが多様な細菌に侵入する様子を蛍光顕微鏡で観察。 PHMB-FITC (2 μg/mL) を細菌培養に添加し、細胞をDAPIで対比染色した。 (d) B. megateriumにおけるPHMB-FITC（緑）の局在を示す共焦点画像。細菌は、Alexa Fluor-555（赤）に結合した膜局在プローブ小麦胚芽アグルチニン（WGA）で対比染色し、生細胞（上）および固定細胞（下）として可視化した；バー＝5 μm。 (e) PHMB-FITCおよびWGA蛍光の細胞内局在の蛍光強度プロファイル解析（白線は解析に使用した断面を示す）。 緑色の線は、FITCのレベルと位置（主に細胞内）を示す。 赤線はWGAのレベルと位置（主に膜内）を示す。
PHMB enters bacteria
PHMBの主要ターゲットが細菌細胞障壁ではない、あるいは細胞障壁のみではない場合、おそらく内部に作用し、これには細胞侵入が必要だろう。 細菌侵入を調べるため、PHMB-FITC結合体を合成し（補足図2a、b）、顕微鏡とフローサイトメトリーでグラム陽性菌（黄色ブドウ球菌）、グラム陰性菌（大腸菌、サルモネラ菌）、酸菌（マイコバクテリウム・スメグマティス）への取り込みを評価した（図1c、補足図3）。 試験したすべての菌種で、強い細胞関連性の緑色蛍光が観察された（Fig.1c）。 細胞の局在をより詳細に調べるため、大型の細菌Bacillus megateriumをPHMB-FITCで処理し、膜局在性の小麦胚芽アグルチニン（WGA-red）で対比染色して蛍光顕微鏡で観察した（Fig.1d）。 細胞侵入は生細胞と固定細胞の両方で観察され、蛍光強度プロファイル分析により、PHMB-FITCは細胞バリアに蓄積することなく、細胞質内に局在することが示された（図1e）
PHMBが低いマイクログラム/mL濃度で細胞に入るという観察は、それが生細胞に入る可能性を示唆する。 PHMBの細菌への取り込みにエネルギー代謝が必要かどうかを調べるため、ログフェーズ中期の大腸菌培養物を37 ℃、または4 ℃で2時間インキュベートし、細胞のATPレベルを低下させた。 その後、細胞をPHMB-FITC（0～6μg/ml）で処理し、さらに氷上で2時間インキュベートした。 細胞内のPHMB-FITC蛍光は、蛍光測定により定量化した（補足図3b）。 4℃で保持した細胞は、37℃でインキュベートした細胞に比べてPHMB-FITCの取り込みが減少しており、エネルギー依存的な細胞の取り込み過程と一致した。 また、PHMB処理中のいくつかの時点では、緑色の蛍光を発する細菌と運動する細菌が観察された（補足図3）。 細菌の運動はエネルギーに依存するため17 、PHMB-FITCが代謝的に活発な細胞に入ることを示す証拠である。 したがって、PHMBは多様な細菌に入り、運動性のある細胞で侵入が観察された。
PHMB は細胞分裂を停止し、細菌の染色体を凝縮する
顕微鏡で大腸菌を調べたところ、PHMB処理細胞がしばしば細長い形態を示し、これは細胞分裂阻害の特徴となり得る（図2a）ことに留意した。 PHMBの細胞伸長に対する効果を測定するため、大腸菌SS996株の成長培養物にPHMBを滴下し（下図）、細胞の長さを測定した。 成長阻害濃度では、80%以上の細胞が伸長した（図2b；補足表2）。 また、成長阻害濃度のPHMBまたはPHMB-FITCで処理した後にDAPI染色した大腸菌は、細胞中心付近に青い蛍光巣を形成することが確認された（図2c）。 これらの構造はヌクレオイドに類似していた18。 DNA フォーカスの可視化を容易にするため、必須細胞分裂遺伝子 ftsZ19 の RNA サイレンシングにより細胞分裂を阻害し、大腸菌のフィラメント状/多核集団を作製した。 RNAサイレンシングは、必須遺伝子転写産物の翻訳を特異的かつ制御的に抑制することができるため、この実験に選択された20。 生育に必須な遺伝子は、ゲノム破壊の手法ではノックアウトできないため、生育不能な株になってしまう。 PHMB非存在下では、糸状細胞は均一なDAPI染色を示したが、PHMB処理した細胞は青い「糸状のビーズ」を示した（図2d）。 同様に、大型のグラム陽性菌B. megateriumでは、PHMB処理後にDAPIで染色された病巣が観察された（Fig. 2e）。 これらの結果は、グラム陰性菌とグラム陽性菌の両方において、PHMBに曝されると細菌内で染色体が凝縮されることを示している。
PHMBによるバクテリアの細胞伸長と染色体凝縮
(a) E. coliを90分間PHMB処理し明視野顕微鏡で観察した。 (b)PHMB濃度の関数としての平均細胞長。 MIC(矢印)を示す。 (c) PHMB-FITC処理後の細胞における染色体分布のパターン。 大腸菌K-12株の培養物をPHMB-FITCで処理し、DAPIで対比染色した後、蛍光顕微鏡で観察した。 染色体はDAPIで染色された凝縮した巣のように見えるが、拡大するとよりはっきりする。 (d) PHMB曝露後の糸状菌/多核大腸菌における染色体分布のパターン。 ftsZ発現のRNAサイレンシングにより細胞分裂を停止させた後、細胞を未処理またはPHMBで処理し、DAPIで染色し、蛍光顕微鏡で観察した。 (e) 未処理またはPHMBで処理したB. megaterium細胞をDAPIとWGA-redで染色し、蛍光顕微鏡で観察した染色体分布のパターン。
PHMB による抗菌作用はストレス応答経路とは無関係
細胞の伸長と染色体の凝縮は細菌の SOS 応答にしばしば関連する特徴的な形態である21,22. したがって、これらの効果はこの反応に関与している可能性があると考えた。 しかし、PHMBを介した効果の場合、SOS反応は考えにくいと思われた。 第一に、SOS 反応は通常 DNA 損傷と関連しており、PHMB が介在する遺伝毒性またはエピジェネティックな効果については証拠がない23。 第二に、ftsZサイレンシングとPHMB処理後に観察された凝縮は、SOS反応変異体であるrecA-株（TOP10）で起こった。 とはいえ、抗菌機構の解明は難しく、複数の機構が関与している可能性もある。 そこで、SOSレポーター株と大腸菌ストレス応答経路変異株を用いて、SOS応答と他のストレス応答経路の関与の可能性を評価することにした。
SOS応答経路への変異により、PHMBによる細胞伸長と染色体凝縮への作用が変化するか調べるために、3つの変異大腸菌株で形態的な応答を評価した。 SS996株はSOS応答を開始することができるが、sulB変異によりその応答は細胞分裂阻害には至らない。 これは、SS996がftsZの変異アリル（sulB103）を持ち、その産物がSOS誘発細胞分裂阻害剤SulA24の作用に対して非感受性であるためである。 株JW2669は機能的なRecAを産生しないため、SOS欠損である。 AB2474株はLexAリプレッサーに変異があり、RecAによって切断されないため、SOS反応を誘導できない（その他の株の詳細は図3および補足情報表3に示す）。 ログ期中期の培養物をPHMBで処理し、DAPI染色を行い、蛍光顕微鏡で観察した。 大腸菌K-12で観察されたように、変異株はPHMB処理後、伸長した形態と凝縮した染色体を示した（図3a）。 したがって、PHMBによる細胞分裂と染色体構造の効果は、SOSプログラム応答とは無関係に起こる。
細菌のSOS応答に対するPHMBの効果。
(a) PHMBで2時間処理した大腸菌SS996株（sulB103；SulAに感受性のないFtsZ変異体）、JW2669株（recA-；recAのノックアウト）、AB2474株（lexA1；SOS応答の誘導を妨げる変異）の染色体凝縮を観察した。 細胞はDNAを明らかにするためにDAPI染色した。 (b) SOS応答レポーターの発現、蛍光測定により定量化。 染色体sulAp-gfp融合体を有するSOSレポーター大腸菌株SS996を未処理またはPHMB、SOS誘導剤として知られるマイトマイシンC、あるいはSOS応答を誘導しないトリクロサンで処理した。 SS996に対するMIC値は、PHMB, 0.75 μg/mL; triclosan, 2 μg/mL; mitomycin C, 0.06 μg/mLで、これらの値を%MICの計算に使用した。
PHMBがSOS応答を誘導するかどうかをより直接的に測定するために、sulAp-gfp染色体SOS応答／レポーターシステムを含むレポーター株である大腸菌株SS996を用いた24，25． もし、SOS 応答が PHMB によって引き起こされるのであれば、PHMB の曝露によってこの株で GFP 発現が誘導されるはずである。 SS996 の培養液を PHMB で 18 時間処理した後、緑色蛍光を測定した。 ポジティブコントロールとしてDNAを損傷するMitomycin Cを、ネガティブコントロールとして脂肪酸の生合成を阻害するTriclosanを含めた。 予想通り、マイトマイシンCはGFPの発現を大きく増加させ、トリクロサンはGFPの発現を誘導しなかった。 マイトマイシンCとは対照的に、PHMBはGFPの発現を誘導せず、PHMBがSOS応答を誘導しないことが示された（図3b）。
次に、SOS応答に欠陥がある株や制御されていない株がPHMBに対して感受性に差があるかどうかを検証した。 recAを介した感受性への影響を調べるため、recAを欠く大腸菌（JW2669）および誘導剤IPTGの添加によりrecAを過剰発現する株（ASKA JW2669）を用い、MIC値を測定した。 recAの欠失および誘導性過剰発現のいずれもPHMBに対する感受性を変化させなかった（補足情報表3、濃い灰色で示した行）。 一方、recA-株はSOS反応誘導薬であるナリジクス酸に対して2倍感受性が高く、recAの過剰発現はナリジクス酸に対する感受性を8倍低下させた。 lexAを介したPHMB感受性への影響を調べるために、SOS反応を誘導できないlexA1(Ind-)株AB2474を用いた。 親株と比較して、AB2474株はPHMBに対して1倍感受性が高く、ナリジクス酸に対して1倍感受性が低かった（補足表3、薄い灰色で示した行）。 したがって、試験したSOS応答変異体はいずれも、SOS応答の関与を示すPHMB感受性の変化を示さなかった。
最後に、他の（非SOS）ストレス応答経路がPHMB感受性の影響を与えるかどうかを検討した。 我々は、一連の既知の大腸菌ストレス応答変異体を、親と並行してPHMBへの感受性をテストした。 いずれの変異体も、ストレス応答経路の機能的関与を示唆するようなMIC値の変化を示さなかった（補足表3）。 したがって、PHMBの抗菌作用は、試験したストレス応答機構のパネルとは無関係に生じる。
PHMB condenses bacterial chromosomes in vitro
PHMBが細胞内の細菌染色体を凝縮する場合、これはDNAへの直接的または間接的な作用によって生じる可能性がある。 PHMBはin vitroでDNA断片に結合することが示されているため、我々は直接的な効果を疑った15。 そこで、単離された大腸菌の染色体DNAを用いて、PHMBのDNA結合特性を調べることにした。 PHMB-DNA の相互作用は、まず電気泳動移動度シフトアッセイ (EMSA) と色素排除アッセイを使用して調べられた。 PHMBを大腸菌K-12から分離した染色体DNAと混合し、混合物をアガロース/TBEゲルで分画した後、エチジウムブロマイドでDNA染色を行った。 PHMBとDNAのwt:wt比が≧0.5である混合物を作製した。5は、電気泳動移動度が明らかに低下しており、DNAがウェル内に留まっていることがわかる（Fig.4a）。 同様の結果が、PHMB-FITCでも得られた。 移動度の遅れとウェルへの保持は、PHMBとDNAの安定した相互作用と一致する。 また、EMSAアッセイでは、PHMBまたはPHMB-FITCの存在下で臭化エチジウムの蛍光が減少したことから、PHMB：DNA複合体の形成により臭化エチジウムのDNAへの結合が阻害されたことが示唆された。 この観察は、DNA結合色素SYTOX®Greenを用いた色素排除アッセイでさらに検討された。 PHMBの非存在下では、SYTOX®Greenは単離大腸菌のDNAと結合し、色素を単独で添加した場合に比べて蛍光が大きく増大することが示された。 しかし、PHMBを添加すると、蛍光は>80%減少した (Fig. 4b)。 したがって、PHMBはバクテリアのDNAと複合体を形成し、電気泳動移動度を遅らせて、DNAリガンドへのDNAのアクセスを妨害している。 これらの各実験の結果は、PHMBがDNAに直接結合することを示している。
PHMB in vitroでの細菌の染色体DNAに結合する様子。
(a) PHMB または PHMB-FITC を大腸菌 K-12 株から分離した染色体 DNA と混合し、サンプルを EMSA で分析した。 ゲル内移動度の遅延パターンは、PHMBによるDNA結合を示す。 (b) PHMBを介したSYTOX®Greenの単離大腸菌染色体DNAへの結合の排除。蛍光の減少は、PHMBによるDNA結合を示す。 (c) PHMBと単離された大腸菌染色体DNAの混合物の円偏光二色性分光法。 (d) PHMB:DNA比の関数としての楕円率のプロット。
DNAへのPHMB結合が染色体DNAの構造にどう影響するかを知るために、我々は生物物理学の手法と顕微鏡を使用した。 PHMBと単離した大腸菌の染色体DNAの組み合わせを円偏光二色性（CD）分光法で検討した。 PHMB単独では特徴的なCDスペクトルを示さなかったが、単離した染色体DNAは260nm付近に正の最大楕円率、252nmに負のクロスオーバー、245nm付近に負のトラフを持つ典型的なDNAスペクトルを示した。 このことから、PHMB添加に伴うDNAのCDスペクトルの変化を評価することができた。 PHMBとDNAの混合物は、260 nmの楕円率が減少しており、PHMBの結合によってDNAの構造が変化したことを示している（図4c,d）。 また、動的光散乱法（DLS）により、PHMBがDNAに結合すると、約50〜60 nmのナノ粒子が形成され、多分散性指数が低くなることがわかった（補足図4a）。 最後に、透過型電子顕微鏡（TEM）と蛍光顕微鏡でも、PHMBがDNAに結合することでナノ粒子が形成されることが示された（補足図4b,c）。 したがって、これらの結果は、PHMBがDNAと結合するという以前の報告26を確認し、PHMBが単離した細菌の染色体DNAと結合し、染色体を低多分散性のナノ粒子集団に凝縮できることを明らかにした
The antibacterial effects are suppressed by a dsDNA ligand
PHMBの細菌への影響に関する我々の結果は、PHMBの主たる抗菌メカニズムの膜破壊モデルには適合しないものである。 むしろ我々は、図5aに示すように、PHMBがバクテリアに入り、染色体を凝縮させるという新しいモデルを提案している。 もしこのモデルが正しければ、PHMBと他のDNAリガンドとの機能的な相互作用も予測され、このモデルを検証する方法が得られたのです。 つまり、このモデルが正しければ、低分子量のDNAリガンドは、染色体内のDNA結合部位を奪い合うことによって、PHMBの抗菌力を抑制することが予想される。 この可能性を検証するために、PHMBとHoechst 33258を一対一で組み合わせた増殖感受性アッセイを実施した。 Hoechst 33258は、ATリッチ配列の小溝に優先的に結合するDNAリガンドであり27、細胞透過性があるため、この競合実験に適している。
PHMBの抗菌作用機構と増殖抑制のモデル
(a) PHMBの提案する抗菌作用のメカニズム
薬物相互作用は、分岐した細菌種のパネルを使用して、分数阻害濃度指数値（FICI）として計算された。 PHMB:HoechstのFICI値は、PHMBと2つの非DNAリガンド抗菌剤のいずれかを組み合わせた場合よりも有意に高かった（図5b）。 また、PHMB:Hoechstの組み合わせのFICI値は、染色体AT-contentと正の相関を示した（Fig. 5c）。 つまり、PHMBの抗菌作用は、細胞内のDNAへのアクセスに依存していることがわかる。 B. megateriumでは、PHMBとHoechstの組み合わせの効果が顕著で、PHMBによる増殖阻害は阻害以下のHoeschst 33258濃度を用いて抑制された（図5d）。 したがって、低分子DNAリガンドであるヘキスト33258は、PHMBの阻害濃度から細菌を救済した。
これらの一対の薬物相互作用は、PHMBの抗菌効果が主に細菌のDNAを標的にして起こることを明らかにした。 PHMBで観察された細胞透過性変化プロファイル（図1b）と一致する。この結果は、細胞内のDNA結合部位に対するPHMBとDNAリガンドの間の競争も示している。 したがって、2つの既知のDNAリガンドを用いた別の実験の結果は、PHMB活性に関する我々の新しいモデルと一致している。
PHMBは哺乳類細胞に入るが核からは排除される
PHMB活性に関する一般的なモデルでは、PHMBは細菌の膜損傷を通して細菌を殺し、ポリマーは哺乳類の細胞膜に作用しないとする（上述）。 しかし、PHMBの予想外のバクテリア細胞侵入特性、および培養マクロファージ28やケラチノサイト29に侵入するという最近の観察から、我々は哺乳類細胞のパネルに侵入する能力を直接評価することにした。 PHMB-FITCをいくつかの哺乳類細胞株と初代線維芽細胞に添加し、蛍光顕微鏡とフローサイトメトリーで取り込みを評価した。 テストしたすべての細胞種への明確な取り込みを観察した（Fig. 6a、b）。 また、これらの条件は、哺乳類細胞膜の完全性の破壊をもたらさなかった（補足図5a）。 顕微鏡画像を詳細に観察すると、PHMB-FITCは小胞内に含まれ、核からは排除されていることがわかった（図6a）。 もし、エンドソームがPHMBを内包していることが事実であれば、細胞質への放出はPHMB-FITCを脱抑制し、蛍光の増加をもたらすはずである。 これは、FITCの蛍光は低いpHで消光し、後期エンドソームのpHは<630であるのに対し、細胞質のpHは7.4であるためである。 浸透圧/緩衝剤であるクロロキンを添加すると31、PHMB-FITC処理細胞の蛍光が増加することが観察され（図6c）、エンドソーム内にポリマーが封入されていることと矛盾しない。 したがって、PHMBは効率的に哺乳類細胞に入るが、エンドソーム内に取り込まれ、核への侵入を制限しているように見える。
PHMBによる哺乳類細胞への侵入。
(a) プライマリー線維芽細胞をPHMB-FITC (3.5 μg/mL) で処理し、Hoechst 33258でカウンター染色し、蛍光顕微鏡で観察した。 (b) PHMB-FITCで処理した哺乳類細胞のパネルのフローサイトメトリー分析。 挿入図：未処理のHeLa細胞集団（紫の集団）またはPHMB-FITC（0.4μg/mL）で処理したHeLa細胞集団（緑の集団）のフローサイトメトリーヒストグラムの代表例である。 (c）HeLa細胞をPHMB-FITC（3.5μg/mL）およびクロロキン（0〜20μM）で2時間処理した。 蛍光に対するクロロキンの効果は、幾何平均蛍光強度（任意単位（A.U.）、対数スケール）を用いて、フローサイトメトリーにより測定した