Introduzione
Le proteine fluorescenti (FP) sono state usate come tag proteici dalla metà degli anni 90, principalmente per la biologia cellulare e la microscopia a fluorescenza. Questi tag non solo hanno rivoluzionato la biologia cellulare permettendo l’imaging di quasi tutte le proteine, ma sono anche utilizzati in applicazioni biochimiche. Un esempio importante è l’immunoprecipitazione e la purificazione per affinità di proteine con tag FP, che è stata resa possibile dallo sviluppo di resine di affinità ad alta resa, purezza e affinità come le Nano-Traps di ChromoTek (https://www.chromotek.com/products/detail/product-detail/nano-traps/).
In questo blog forniamo una rassegna di
- proteine fluorescenti verdi
- proteine fluorescenti rosse
- proteine auto-etichettanti, che richiedono l’accoppiamento covalente di una molecola fluorescente
Tipi di proteine fluorescenti
La maggior parte dei ricercatori usa proteine intrinsecamente fluorescenti GFP, mNeonGreen, TurboGFP, RFP, o mCherry. In alternativa, sono state introdotte proteine estrinsecamente fluorescenti o auto-etichettanti che richiedono l’accoppiamento covalente di una molecola fluorescente alla proteina non fluorescente, ad esempio le proteine tag SNAP, CLIP e Halo. Queste proteine fluorescenti auto-etichettanti hanno alcuni vantaggi prestazionali rispetto alle FP intrinseche grazie alle proprietà dei loro coloranti fluorescenti.
Figura 1: Strutture delle proteine fluorescenti.
(A) Le proteine intrinsecamente fluorescenti (FP) come EGFP, GFP, RFP, mNeonGreen, turboGFP ecc. condividono solo un piccolo numero di residui comuni, ma si piegano tutte in una struttura conservata a β-barile. La loro fluorescenza nasce attraverso la ciclizzazione della spina dorsale e l’ossidazione di tre residui di aminoacidi al centro di questo cilindro (evidenziati sulla destra), che si traduce in un cromoforo a due anelli. Questo processo chimico è descritto come maturazione del cromoforo, è inerente alla piega della proteina e dipende solo da variabili ambientali come la temperatura e la concentrazione di ossigeno, ma non da enzimi aggiuntivi. Il colore, la fotostabilità, la resa quantica e altre proprietà spettrali delle proteine intrinsecamente fluorescenti sono il risultato di mutazioni all’interno degli aminoacidi che compongono il cromoforo o che si trovano nelle vicinanze del cromoforo.
(B) Le proteine estrinsecamente fluorescenti come HaloTag non sono fluorescenti nella loro forma apo basale. Solo se un adeguato fluoroforo attivato viene aggiunto alla proteina HaloTag, questo fluoroforo sarà catturato e legato covalentemente dal residuo D106 di HaloTag, rendendo HaloTag fluorescente. (ID PDB per le strutture: EGFP, 2y0g; apo-HaloTag, 5uy1; holo-HaloTag, 5uxz.)
La proteina fluorescente verde della medusa (GFP) e i suoi derivati sono ancora le proteine fluorescenti più utilizzate nella ricerca biomedica. Recentemente, sono state introdotte altre proteine fluorescenti verdi derivate da altri organismi. Queste FP possiedono la stessa piega di base di GFP ma divergono ampiamente a livello di sequenza. Pertanto, richiedono nuovi strumenti di ricerca dedicati come gli anticorpi.
L’originale: GFP
La proteina fluorescente verde è stata isolata dalla medusa Aequorea victoria nel 1962 da Osamu Shimomura. Ha una fluorescenza verde a lungo spostamento Stokes (ex 395nm; em 509 nm). 30 anni dopo, Douglas Prasher riuscì a clonare la sequenza della GFP e Martin Chalfie espresse questa sequenza in vivo. Più tardi, il laboratorio di Roger Tsien ha sviluppato GFP in una suite di veri e propri strumenti di ricerca. Shimomura, Chalfie e Tsien hanno ricevuto il premio Nobel nel 2008. Guarda la conferenza di Roger Tsien sul premio Nobel qui: https://www.nobelprize.org/prizes/chemistry/2008/tsien/lecture/.
Gli scienziati hanno sviluppato una pletora di varianti GFP con proprietà diverse. Questi GFP hanno diverse proprietà funzionali e spettrali. Il primo miglioramento significativo di GFP è stata una mutazione (S65T) che ha aumentato l’intensità e la stabilità del segnale di fluorescenza. Il picco di eccitazione principale è stato spostato a 488 nm (Heim et al., 1995). La variante comune EGFP è una versione ingegnerizzata di GFP, che facilita l’uso pratico di GFP in una varietà di organismi e cellule diverse.
La proteina fluorescente verde GFP è conosciuta anche come avGFP, wtGFP, e gfp10; EGFP come GFP potenziata e GFPmut1.
https://www.fpbase.org/protein/avgfp/
https://www.fpbase.org/protein/egfp/
TurboGFP
Rapportata nel 2004, TurboGFP è una proteina fluorescente verde dimerica luminosa e a maturazione rapida derivata da CopGFP del copepode Pontellina plumata. Copepod TurboGFP è evolutivamente distante dalle proteine fluorescenti derivate dalle meduse come EGFP e condivide solo circa il 20% di identità di sequenza con le varianti GFP comunemente usate. Pertanto, la maggior parte degli anticorpi anti-GFP, compreso il GFP-Nanobody usato nel GFP-Trap, non si legano al TurboGFP.
https://www.fpbase.org/protein/turbogfp/
mNeonGreen
mNeonGreen deriva da una proteina multimerica a fluorescenza gialla della lancetta Branchiostoma lanceolatum. Quindi, mNeonGreen è evolutivamente distante dalle FP derivate dalle meduse. mNeonGreen e i comuni derivati GFP condividono solo circa il 20% di identità di sequenza. A causa della bassa somiglianza di sequenza, ci si aspetta che gli strumenti di affinità (cioè gli anticorpi) per le varianti GFP non si leghino a mNeonGreen. Certamente, questo è stato dimostrato per i reagenti di affinità della ChromoTek (nano-corpi/ VHH e anticorpi anti-GFP).
Primamente pubblicato nel 2013, mNeonGreen è fino a tre volte più luminoso di GFP. È una proteina fluorescente monomerica versatile verde/gialla emergente per applicazioni di imaging, compresa la microscopia a super risoluzione. Inoltre, mNeonGreen agisce come accettore per le proteine fluorescenti ciano nelle applicazioni di trasferimento di energia a risonanza di fluorescenza (FRET). Sembra essere la proteina fluorescente verde monomerica più luminosa conosciuta finora e ha un tasso di maturazione veloce.
https://www.fpbase.org/protein/mneongreen/
Confronto tra GFP, TurboGFP, e mNeonGreen
Proprietà |
EGFP (derivato GFP più comunemente usato) |
turboGFP |
mNeonGreen |
|---|---|---|---|
|
Scoperta/ prima pubblicazione |
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Origine |
GFP da Medusa |
CopGFP da copepode Pontellina plumata |
proteina fluorescente gialla multimerica da lancetta Branchiostoma lanceolatum |
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Tasso di maturazione (a 37°C) |
25 min |
25 min |
10 min |
|
Identità della sequenza con EGFP |
(100%) |
~20% |
~20% |
|
Derivato da GFP? |
Sì |
No |
No |
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Struttura |
Debole dimero |
Dimero |
Monomero |
|
Varianti comuni |
AcGFP, Clover, eGFP, Emerald, GFP, GFP5, GFP Envy, GFP S65T, mGFP, mPhluorin, PA-GFP, Superfolder GFP, TagGFP, TagGFP2, eGFP monomerico A206K, CFP, eCFP, mCeruleo, YFP, Citrino, eCitrino, eYFP, Venus, Ypet, BFP |
TurboGFP, CopGFP |
mNeonGreen |
|
Massimo di eccitazione/emissione |
488 nm/ 509 nm |
482 nm/ 502 nm |
506 nm/ 517 nm |
|
Lunghezza/ peso molecolare (MW) |
239 aminoacidi, |
2x 232 aminoacidi, |
237 aminoacidi, |
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Strumenti di ricerca offerti da ChromoTek |
Immunoprecipitazione: GFP-Trap Western blot: Anticorpo ratto anti-GFP Controllo: proteina EGFP purificata |
Immunoprecipitazione: TurboGFP-Trap |
Immunoprecipitazione: mNeonGreen-Trap Western blot: Anticorpo di topo anti-mNeonGreen |
Le proteine fluorescenti rosse (RFP) sono FP che emettono luce di fluorescenza rosso-arancio. La prima RFP che divenne disponibile in commercio fu la DsRed. È stata derivata dagli anemoni di mare Discosoma sp. nel 1999.
DsRed ha alcuni problemi pratici immanenti: (i) Ha un tempo di maturazione di circa 24 ore, che lo rende inutilizzabile per esperimenti di breve durata. (ii) La forma tetramerica di DsRed può compromettere la funzione delle proteine a cui è attaccato. (iii) La sua fotostabilità è piuttosto bassa.
Di conseguenza, DsRed è stato sottoposto a mutagenesi sito-diretta per diventare comunemente applicabile come tag di fusione geneticamente codificato. Alla fine, sono stati creati derivati monomerici di RFP con migliori prestazioni fluorescenti (in termini di luminosità e fotostabilità) e maggiore efficienza di maturazione. Inoltre, sono stati generati derivati con fluorescenza arancione, rossa e rosso lontano. Queste versioni monomerizzate di RFP sono diventate i preziosi strumenti di ricerca mCherry, mOrange, mRaspberry, mPlum (conosciuti anche come “mFruits”), mKO, mRFP (a.k.a. mRFP1), mRFPruby, mRuby, tagRFP, mKate2, e DsRed-Express ecc.
Altri RFP sono stati identificati in altri antozoi (cioè anemoni e coralli), ma anche queste proteine erano principalmente tetrameri. Così, non sono ancora state ulteriormente ottimizzate per l’uso nella ricerca.
mRFP (conosciuta anche come mRFP1)
La prima variante monomerica di dsRed, ingegnerizzata geneticamente nel laboratorio di Roger Tsien, è stata semplicemente designata mRFP (o mRFP1), cioè proteina fluorescente rossa monomerica. Rispetto a dsRed, mRFP1 è caratterizzata da livelli leggermente inferiori di assorbimento, resa quantica e fotostabilità. Tuttavia, il suo tasso di maturazione è circa 10 volte più veloce di quello di DsRed, il che si traduce in una luminosità effettiva simile quando viene espresso in cellule viventi.
https://www.fpbase.org/protein/mrfp1/
mCherry
mCherry è probabilmente la variante RFP più comunemente usata. È una proteina fluorescente rossa monomerica con ampia applicabilità come proteina di fusione in vari tipi di cellule. Come altre mFruit RFP, mCherry è derivata dalla variante dsRed mRFP1 tramite evoluzione diretta dal laboratorio di Roger Tsien. Rispetto agli altri mFruit, mCherry ha la più alta fotostabilità, il tasso di maturazione più veloce e un’eccellente resistenza al pH. Ha, tuttavia, una resa quantica più bassa di mRFP1.
https://www.fpbase.org/protein/mcherry/
mPlum
Il laboratorio di Roger Tsien ha anche generato un derivato monomerico rosso lontano di mRFP1/dsRed, chiamato mPlum. Gli RFP in rosso lontano sono vantaggiosi per le applicazioni di imaging del corpo intero perché i principali assorbitori dei tessuti come l’acqua, i lipidi e l’emoglobina sono quasi trasparenti nella gamma di emissione di 650-900 nm. Come la maggior parte dei FP spostati in rosso, mPlum presenta uno spostamento di Stokes esteso.
https://www.fpbase.org/protein/mplum/
Confronto tra mCherry, mRFP (mRFP1), e mPlum
| Proprietà | mCherry | mRFP (mRFP1) | mPlum |
|---|---|---|---|
|
Scoperta/ prima pubblicazione |
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Origine |
DsRed da anemone di mare |
DsRosso da anemone di mare |
DsRosso da anemone di mare |
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Tasso di maturazione (a 37°C) |
15 min |
60 min |
100 min |
|
Struttura |
Monometro |
Monometro |
Monometro |
|
Aggregazione |
no |
no |
no |
|
Massimo di eccitazione/emissione |
587 nm/ 610 nm |
584 nm/ 607 nm |
590 nm/ 649 nm |
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Lunghezza/ peso molecolare (MW) |
236 aminoacidi, |
228 aminoacidi, |
229 aminoacidi, |
|
Strumenti di ricerca forniti da ChromoTek |
Immunoprecipitazione: RFP-Trap |
Immunoprecipitazione: RFP-Trap |
Immunoprecipitazione: RFP-Trap |
I tag proteici estrinsecamente fluorescenti Halo, SNAP, e CLIP richiedono la cattura covalente di un piccolo ligando fluorescente per trasformarsi in una proteina fluorescente. A tal fine, questi tag proteici auto-etichettanti sono derivati da enzimi che catalizzano la formazione di legami chimici: I tag SNAP e CLIP sono varianti di O6-alchilguanina-DNA alchiltransferasi che reagiscono con derivati di benzilguanina e benzilcitosina, rispettivamente. L’HaloTag è derivato da un aloalcano dealogenasi e reagisce con gli alchilalidi (Figura 1).
In generale, sia le proteine intrinsecamente che estrinsecamente fluorescenti sono fuse ad una proteina di interesse per permettere il suo imaging cellulare e il rilevamento. Tuttavia, le proteine estrinsecamente fluorescenti richiedono l’aggiunta di un fluoroforo reattivo, che ha diversi vantaggi:
- Più alta resa quantica e fotostabilità
- Fluorescenza forte sia in cellule vive che fisse
- Una più ampia selezione di coloranti fluorescenti
- Un singolo costrutto genetico permette la scelta di fluorofori distinti per l’imaging multicolore imaging/multiplexing
- La fluorescenza inizia solo dopo l’aggiunta dell’etichetta
La disponibilità di tre proteine estrinsecamente fluorescenti con diverse specificità di substrato/ligando permette il loro uso ortogonale in esperimenti multiplex, anche in combinazione con le FP intrinseche.
A seconda delle esigenze sperimentali, si possono usare ligandi permeabili alle cellule a base di tetrametilrodamina (TMR), Oregon Green, diAcFAM o cumarina, che attraversano facilmente la membrana cellulare per etichettare le proteine intracellulari. In alternativa, i ligandi impermeabili cellulari basati su fluorofori impermeabili come Alexa Fluor® 488 e 660 possono essere applicati per una rapida etichettatura della superficie cellulare.
Confronto tra HaloTag, SNAP-Tag, e CLIP-Tag
| Proprietà | HaloTag | SNAP-Tag | CLIP-Tag |
|---|---|---|---|
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Scoperta/prima pubblicazione |
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Origine |
Haloalkane dehalogenase da Rhodococcus rhodochrous |
Uomo O6-alchilguanina-DNA-alchiltransferasi |
O6-alchilguanina-DNA-alchiltransferasi |
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Struttura |
Monomero |
Monomero |
Monomero |
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Reattività |
Derivati del cloroalcano |
O6-derivati della benzilguanina |
Derivati della benzilcitosina |
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Ligandi |
Cellule permeabili o non permeabili, fluorofori, biotina e perline |
Tinture permeabili o non permeabili, fluorofori, biotina e perline |
Tinture permeabili o non permeabili, fluorofori, biotina, e perline |
|
Massimo di eccitazione/emissione |
Dipende dal fluoroforo accoppiato |
Dipende dal dipende dal fluoroforo accoppiato |
dipende dal fluoroforo accoppiato |
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Lunghezza/peso molecolare (MW) |
297 aminoacidi, |
182 aminoacidi, |
182 aminoacidi, |
|
Strumenti di ricerca offerti da ChromoTek |
Immunoprecipitazione: Halo-Trap |
Immunoprecipitazione: SNAP/CLIP-tag-Trap |
Immunoprecipitazione: SNAP/CLIP-tag-Trap |
HaloTag
L’HaloTag auto-etichettante è stato derivato dall’enzima aloalcano dealogenasi DhaA del Rhodococcus rhodochrous. Il suo sito attivo è stato geneticamente modificato per legare irreversibilmente i substrati del linker cloroalcano. A causa di questo tipo di inibizione suicida, la rigenerazione del suo sito catalitico per un’ulteriore dealogenazione non è più possibile. A seconda del substrato scelto, l’HaloTag si converte in un tag di proteina fluorescente o può essere immobilizzato su perline di agarosio, per esempio.
Poiché le aloalcani dealogenasi sono assenti nelle cellule eucariotiche e nella maggior parte dei procarioti, compreso l’E. coli, non ci sarà alcuna etichettatura di fondo.
SNAP-tag
Il tag proteico auto-etichettante SNAP-tag è derivato dalla O6-alchilguanina-DNA-alchiltransferasi umana (hATG), che, come proteina wildtype, rimuove i danni da alchilazione dal DNA. La variante hAGT risultante usata come SNAP-tag reagisce in modo covalente con i derivati della O6-benzilguanina (cioè un’etichetta fluorescente coniugata ai gruppi lascianti di guanina o cloropirimidina tramite un linker benzilico) in modo irreversibile e altamente specifico. Nella reazione di etichettatura, il gruppo benzilico sostituito del substrato è legato covalentemente allo SNAP-tag.
CLIP-tag
CLIP-tag è una versione modificata dello SNAP-tag, progettata per reagire con la benzilcitosina piuttosto che con derivati della benzilguanina. Se usato insieme a SNAP-tag, CLIP-tag permette l’etichettatura ortogonale e complementare di due proteine contemporaneamente nella stessa cellula.
Una guida alla scelta delle proteine fluorescenti
Shaner N.C., Steinbach P.A. and Tsien R.Y. (2005)
Nature Methods 2(12), 905-909 doi: 10.1038/nmeth819
http://www.tsienlab.ucsd.edu/Publications/Shaner%202005%20Nature%20Methods%20-%20Choosing%20fluorescent%20proteins.pdf
Proteine fluorescenti verdi:
La proteina fluorescente verde
Tsien R.Y. (1998)
Annual Review of Biochemistry, 67(1), 509-544. doi: 10.1146/annurev.biochem.67.1.509.
Fluorescenza verde migliorata
Heim, R., Cubitt A.B. and Tsien R.Y. (1995)
Nature, 373, 663-664. doi: 10.1038/373663b0
Base strutturale per la rapida maturazione della proteina fluorescente verde di Arthropoda
Evdokimov A.G., Pokross M.E., Egorov N.S., Zaraisky A.G., Yampolsky I.V., Merzlyak E.M., Shkoporov A.N., Sander I, Lukyanov K.A e Chudakov D.M. (2006)
EMBO reports, 7(10), 1006-1012. doi: 10.1038/sj.embor.7400787.
Una proteina fluorescente verde monomerica brillante derivata da Branchiostoma lanceolatum
Shaner N.C., Lambert G.G., Chammas A., Ni Y., Cranfill P.J. Baird M.A., Sell B.R., Allen J.R., Day R.N., Israelsson M, Davidson M.W. and Wang J. (2013)
Nature Methods, 10(5), 407-409. doi: 10.1038/nmeth.2413
Proteine fluorescenti rosse:
Proteine fluorescenti monomeriche rosse, arancioni e gialle derivate dalla proteina fluorescente rossa Discosoma sp.
Shaner N.C., Campbell R.E., Steinbach P.A., Giepmans B.N.G., Palmer A.E. and Tsien R.Y. (2004)
Nature Biotechnology, 22(12), 1567-1572. doi: 10.1038/nbt1037
Una proteina fluorescente rossa monomerica
Campbell R.E., Tour O., Palmer A.E., Steinbach P.A., Baird G.S., Zacharias D.A. and Tsien R.Y. (2002)
PNAS, 99(12), 7877-7882. doi: 10.1073/pnas.082243699
Evoluzione di nuove proteine non anticorpali tramite ipermutazione somatica iterativa
Wang L., Jackson W.C., Steinbach P.A. and Tsien R.Y. (2004)
PNAS, 101(48), 16745-16749. doi: 10.1073/pnas.0407752101.
Recovery of Red Fluorescent Protein Chromophore Maturation Deficiency through Rational Design
Moore M.M, Oteng-Pabi S.K., Pandelieva A.T., Mayo S.L. e Chica R.A. (2012)
Plos ONE, 7(12), e52463. doi: 10.1371/journal.pone.0052463.
Halo, SNAP, e CLIP:
Sonde SNAP-tag rilasciabili per studiare l’endocitosi e il riciclaggio
Cole N.B. and Donaldson J.G. (2012)
ACS Chemical Biology,7(3): 464-469, doi: 10.1021/cb2004252
Site-Specific Protein Labeling with SNAP-Tags
Cole N.B. (2013)
Current protocols in protein science / editorial board, Coligan J.E. et al, 73: 30.1.1-30.1.16., doi: 10.1002/0471140864.ps3001s73
Un tag proteico ingegnerizzato per l’etichettatura multiproteica in cellule viventi
Gautier A., Juillerat A., Heinis C, Corrêa I.R., Kindermann M., Beaufils F. and Johnsson K. (2008)
Chemistry and Biology 15 (2): 128-136, doi: 10.1016/j.chembiol.2008.01.007
HaloTag: A Novel Protein Labeling Technology for Cell Imaging and Protein Analysis
Los G.V., Encell L.P., McDougall M.G., Hartzell D.D., Karassina N., Zimprich C, Wood M.G., Learish R, Friedman-Ohana R, Urh M., Simpson D., Mendez J., Zimmerman K., Otto P., Vidugiris G., Zhu J., Darzins A., Klaubert D.H., Bulleit R.F. e Wood K.V. (2008)
ACS Chem. Biol. 3(6): 373-382 doi: 10.1021/cb800025k
Un metodo generale per la marcatura covalente di proteine di fusione con piccole molecole in vivo.
Keppler A., Gendreizig S., Gronemeyer T., Pick H., Vogel H. e Johnsson K (2003)
Nat. Biotechnol. 21: 86-89, doi: 10.1038/nbt765
Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging
Provost C.R. and Sun L. (2010)
Visualized Exp. 39: 1876, doi: 10.3791/1876
Solo per uso di ricerca.
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