Stile di vita necrotrofico di Rhizoctonia solani AG3-PT durante l’interazione con la sua pianta ospite patata come rivelato dall’analisi del trascrittoma

Analisi del trascrittoma

L’interazione interspecifica tra R. solani AG3-PT isolato Ben3 con la cultivar di patata mediamente resistente ‘Arkula’ è stata analizzata a livello di trascrittoma utilizzando il sequenziamento dell’RNA. Al fine di trovare i fattori importanti per l’istituzione dell’interazione e l’ulteriore progressione dell’interazione, abbiamo utilizzato tre diversi campionamenti: micelio puro di R. solani AG3-PT isolato Ben3 coltivato senza essere attratto da una pianta di patata in crescita (Ben3); germogli di patata a 3 dpi dei tuberi con R. solani (precoce) e 8 dpi (tardivo). In entrambe le date di campionamento di R. solani in interazione con il germoglio di patata tutti i germogli emergenti sono stati raccolti e utilizzati nell’analisi. Le lesioni necrotiche sui germogli diventano visibili per la prima volta a 8 dpi. Successivamente, l’estrazione dell’RNA, il sequenziamento dell’RNA (RNAseq) e la mappatura delle letture al genoma dell’isolato Ben334 sono stati eseguiti per calcolare i valori delle letture per kilobase per milione di letture mappate (RPKM). In generale, per i campioni inoculati, tra l’1 e il 23% di ogni set di dati è stato mappato sul genoma di Ben3. Per i campioni di controllo, tra il 70 e il 75% di questi set di dati potrebbe essere mappato sul genoma Ben3.

In tutti e tre i campionamenti un numero comparabile di geni potrebbe essere rilevato come espresso (Tabella 1). Nel micelio puro 11.206 geni dei 12.567 geni identificati sul genoma di R. solani AG3-PT isolato Ben3 erano espressi, mentre le letture potrebbero essere mappate su 10.181 e 9.939 geni a 3 dpi e 8 dpi, rispettivamente. In sintesi, in tutti i trascrittomi all’interno di questo esperimento 11.287 geni dei 12.567 geni identificati sul genoma di R. solani AG3-PT isolato Ben3 sono stati espressi in uno qualsiasi dei campioni analizzati.

Come ovvio dalla tabella 1, le quantità di letture totali mappate differivano notevolmente. Ciò è dovuto al fatto che nel campionamento Ben3 il trascrittoma del micelio puro di R. solani AG3-PT isolato Ben3 è stato sequenziato, mentre nei campionamenti precoce e tardivo (3 e 8 dpi) un approccio RNAseq duale è stato utilizzato per accedere ai trascrittomi di entrambi gli organismi interagenti contemporaneamente30. Poiché le dimensioni della biblioteca e la quantità di sequenze prodotte da ogni biblioteca erano comparabili, nel campionamento Ben3 quasi tutte le letture potrebbe essere mappato al genoma Ben3 isolato. Negli approcci RNAseq doppio dei campionamenti a 3 e 8 dpi, solo una frazione delle letture prodotte potrebbe essere mappato al genoma Ben3, mentre gli altri principalmente mappato al genoma della patata. A causa di queste diverse quantità di letture totali mappate al genoma di R. solani AG3-PT isolato Ben3 per campionamento deve essere considerato quanto segue: (1) i geni con basso valore RPKM solo in Ben3 non sono necessariamente non espressi quando il fungo sfida la pianta, potrebbe essere solo dovuto alle dimensioni della libreria; (2) i geni che si trovano ad essere espressi in tutti e tre i campionamenti potrebbero essere assegnati come comunemente espressi; (3) i geni che si trovano ad essere espressi solo nelle librerie molto più piccole dei campionamenti 3 e 8 dpi possono essere assunti come specifici di interazione.

I risultati riassuntivi della mappatura (Tabella 1) già indicavano che ci devono essere molti geni comunemente espressi in tutti e tre i campionamenti. Pertanto, è stato costruito un diagramma di Venn per confrontare i tre campionamenti e visualizzare il numero calcolato di geni che hanno in comune rispetto al numero di geni che distingue i singoli campionamenti (Fig. 1). Più di 9.000 geni sono stati trovati espressi in tutti e tre i campionamenti, mentre 871 sono stati trascritti esclusivamente nel micelio senza contatto con la pianta. L’espressione di 29 geni è stata trovata in comune nei campioni 3 e 8 dpi, rappresentando geni espressi solo in presenza della pianta di patate viva. Inoltre, a 3 dpi 27 geni sono stati espressi esclusivamente, e le letture di sequenza che mappano un piccolo set di 21 geni sono stati esclusivamente rilevabili a 8 dpi. Gli elenchi di questi geni insieme ai loro rispettivi valori RPKM e le descrizioni sono riportati nelle tabelle supplementari 1 – 4.

Dai 29 geni che erano comunemente espressi in presenza della pianta di patate viva, quattro geni codificano per proteine coinvolte nella degradazione della parete cellulare della pianta. Questo corrisponde alla strategia di virulenza di un patogeno necrotrofico con secrezione di enzimi di degradazione della parete cellulare per indurre la necrosi della cellula ospite e la perdita di nutrienti21. Inoltre, un gene che codifica per una proteina coinvolta nella degradazione delle proteine supporta ulteriormente questa linea di attacco. Inoltre, due geni che codificano per proteine con domini di legame al DNA e funzione putativa nella regolazione trascrizionale sono anche in questa lista e probabilmente hanno un ruolo nella regolazione trascrizionale del reato (ad esempio Ben3g4553, vedi Tabella 2). La maggior parte dei 27 geni espressi esclusivamente a 3 dpi sono codificanti per proteine ipotetiche a cui non può essere assegnata alcuna funzione putativa. Dai 21 geni che sono stati espressi esclusivamente nelle fasi successive dell’interazione (8 dpi), otto geni codificano per proteine coinvolte nella degradazione della parete cellulare della pianta e due sono codificanti per le proteasi. Questo dimostra ancora una volta la strategia tipica di un patogeno necrotrofico.

In sintesi, un primo esame dei dati del trascrittoma dei tre campionamenti ha rivelato differenze distinte e ragionevoli, dimostrando così il potenziale di questo studio per trovare fattori importanti per la costituzione dell’interazione tra R. solani AG3-PT isolato Ben 3 con una cultivar di patata suscettibile e l’ulteriore progressione dell’interazione.

I trascritti più abbondanti di R. solani AG3-PT nei tre campionamenti

L’interazione interspecifica tra R. solani AG3-PT isolato Ben 3 con la cultivar di patata mediamente resistente ‘Arkula’ è stata inizialmente valutata esaminando i trascritti più abbondanti nei tre diversi campionamenti. Nel micelio in crescita coltivato in coltura liquida, sono state trovate trascrizioni di 11.206 geni del genoma dell’isolato Ben3. In totale, 698 trascrizioni di questi geni sono stati rilevati con valori mediani RPKM di 100 e superiori, 37 con valori mediani RPKM superiori a 1.000. Nella fase di interazione precoce (3 dpi) dei germogli di tubero con il patogeno, sono stati rilevati i trascritti di 10.181 geni con 729 che mostrano valori mediani RPKM di 100 e superiori, 25 valori mediani RPKM maggiori di 1.000. Un certo numero di 9,939 geni di R. solani AG3-PT sono stati trascritti con 742 mostrando valori mediani RPKM di 100 e superiore, 26 valori mediani RPKM maggiore di 1,000 a 8 dpi (tabelle supplementari 5-7). In totale, 9.679 geni del genoma dell’isolato Ben3 sono risultati espressi in tutti e tre i campionamenti, tra cui sono i trascritti più abbondanti in ciascuno dei singoli campionamenti analizzati. Cinque di questi geni più espressi (Ben3g9573, Ben3g6448, Ben3g5323, Ben3g2326 e Ben3g675) codificano per proteine ipotetiche specifiche di R. solani con funzioni sconosciute. Quindi, queste proteine non sono state previste per svolgere ruoli specifici durante l’interazione con la pianta, queste proteine possono piuttosto essere importanti per la crescita generale e il metabolismo cellulare. Tra i trascritti più abbondanti in ogni singolo campionamento ci sono anche diverse proteine contenenti domini di lectina (Ben3g9146, Ben3g9350, e Ben3g8869). Un certo numero di tali proteine contenenti un dominio di lectina di tipo ricina beta-trefoil sono stati segnalati anche in precedenza come più abbondante nella R. solani AG1-IB isolato 7/3/14 durante l’interazione con la sua pianta ospite lattuga30. Mentre i ruoli specifici di queste proteine di dominio lectina sono indeterminati è stato proposto che R. solani lectine potrebbe avere una funzione come proteina di stoccaggio all’interno del micelio37. Inoltre, due geni che codificano per le proteine con dominio tossina thuringiensis (Ben3g8806, e Ben3g11931) sono stati anche fortemente trascritto in tutti e tre i campioni analizzati. Le tossine del Bacillus thuringiensis sono proteine batteriche note per la loro attività biocida contro gli insetti38, ma anche una serie di altri organismi sono presi di mira39. La forte espressione di tale dominio tossina omologhi in R. solani indica che queste tossine possono essere di importanza generale per R. solani AG3-PT isolato Ben3 piuttosto che giocare un ruolo specifico nell’interazione pianta fungo. Un gene che codifica per una proteina setto poro cap (Ben3g7115) era anche tra i trascritti più abbondanti in tutti e tre campionamenti, indicando il suo contributo all’omeostasi ifale in funghi basidiomiceti40. Un trascritto simile alla proteina del tappo del poro settale (RSOLAG1IB_6054) era anche molto abbondante in R. solani AG1-IB isolato 7/3/14 trascrizioni trovato nella zona sintomatica di interazione con lattuga30. Questa proteina specifica per R. solani è parte del materiale di tamponamento che chiude le perforazioni all’interno del tappo poro settale delle cellule ifali e impedisce il trasporto di fluidi citoplasmatici tra le cellule vicine. Inoltre, un gene che codifica una proteina di dominio emopexina (Ben3g6614) era anche tra i geni più espressi in comune a tutti e tre i campionamenti. Questo dominio denota le metalloproteinasi zinco-dipendenti, che sono ampiamente riconosciute per svolgere un ruolo importante nella regolazione omeostatica dell’ambiente extracellulare41, ma le loro funzioni biologiche possono anche estendersi oltre la degradazione della matrice extracellulare42. Poiché tutte queste proteine hanno mostrato alta abbondanza in R. solani AG3-PT con e senza contatto con la pianta ospite, possono essere importanti per la crescita generale e il metabolismo, ma non sembrano essere di una rilevanza specifica nell’interazione fungina con la pianta.

L’interazione tra R. solani AG3-PT e la patata

Al fine di trovare elementi rilevanti per sostenere l’interazione di R. solani AG3-PT isolato Ben3 con il germoglio di patata, l’espressione genica differenziale è stata eseguita come integrata nella piattaforma ReadXplorer (v2.2)43. Questo confronto a coppie di trascrittomi di micelio puro di isolato Ben3 con trascrittomi di 3 dpi o 8 dpi di interazione con germogli di patate è stato realizzato utilizzando il programma DESeq2. I geni sono stati assegnati come differenzialmente espressi con un valore P aggiustato inferiore a 0,05 e un cambiamento minimo di fold di |2| o più. Utilizzando questi criteri 592 geni potrebbero essere assegnati come differenzialmente indotti a 3 dpi (somma di 242 geni esclusivamente indotti precocemente e 350 geni indotti a 3 dpi e anche a 8 dpi; early up) mentre 520 geni sono differenzialmente ridotti a 3 dpi (somma di 412 geni esclusivamente ridotti precocemente e 108 geni ridotti a 3 dpi e anche a 8 dpi; early down). A 8 dpi, 688 trascrizioni sono risultate differenzialmente indotte (somma di 338 geni esclusivamente indotti in ritardo e 350 geni indotti a 8 dpi e anche a 3 dpi; late up) e 233 sono differenzialmente ridotti (somma di 125 geni esclusivamente ridotti in ritardo e 108 geni ridotti a 8 dpi e anche a 3 dpi; late down). I diagrammi di Venn sono stati costruiti per confrontare e visualizzare i geni differentemente upregolati e downregolati in entrambi i punti temporali durante l’interazione (Fig. 2). Elenchi di questi geni insieme con i loro rispettivi valori di fold change sono riportati nelle tabelle supplementari 8-9.

Le differenze di espressione trovate con questa analisi DESeq2 sono state validate in esperimenti utilizzando qRT-PCR. Pertanto deve essere stabilito un gene di controllo adatto con un modello di espressione invariante. Gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi (Ben3g7151, GAPDH), enzima coniugante ubiquitina E2 (EUC63156, UBC), ubiquitina-protein ligasi E3 (Ben3g494, UBI), fattore di allungamento 2 (Ben3g3364, EF-2), e geni beta tubulina (Ben3g4099; TUB1) e (Ben3g5288, TUB2) sono stati testati e il gene della beta tubulina Ben3g5288 (TUB2) ha dimostrato di essere il riferimento più appropriato nei nostri esperimenti. I livelli di trascrizione relativi di tre geni candidati con diversi modelli di espressione sono stati normalizzati sulla base dell’espressione di questo controllo invariante. I valori ΔΔCq sono stati calcolati e confrontati con la rispettiva analisi DESeq2 (Tabella 2).

Per tutti e tre i geni candidati con modelli di espressione molto diversi, i valori ΔΔCq calcolati erano in accordo con i rispettivi valori di cambiamento log2fold calcolati nell’analisi DESeq2, dimostrando così la convalida delle differenze di espressione.

Inoltre, sono state eseguite annotazioni di ontologia genica (GO) per assegnare le rispettive funzioni ai geni particolari. Nell’ulteriore analisi, un’attenzione specifica è stata posta sui geni significativamente indotti per catturare in modo preferenziale i candidati molecolari che potrebbero essere importanti per l’avvio e per stabilire l’interazione con la pianta.

Geni differenzialmente espressi (DEG) nell’isolato Ben3 a 3 dpi di germogli di patata

Geni differenzialmente indotti nell’isolato Ben3 nell’interazione con i germogli di patata a 3 dpi rispetto al micelio puro dell’isolato sono stati selezionati assumendo funzioni nell’iniziare e sostenere il processo di interazione con i germogli di patata. Le funzioni putative dei prodotti genici particolari e la loro distribuzione negli aspetti comuni GO per il processo biologico (BP), funzione molecolare (MF), e componente cellulare (CC) sono riportati in Fig. 3.

A 3 dpi, i geni differenzialmente indotti sono principalmente assegnati come coinvolti nei processi metabolici di carboidrati e composti azotati cellulari e nel trasporto. Quasi il 10% (50 geni) dei geni differenzialmente upregolati codificano varie attività di peptidasi (ad esempio Ben3g2070, vedi Tabella 2), mentre 53 geni codificano enzimi di degradazione della parete cellulare, comprese diverse idrolasi che agiscono sui legami glicosilici, e pectato liasi (ad esempio Ben3g3530, vedi Tabella 2.) o xilanasi. Per specificare ulteriormente questi enzimi di degradazione della parete cellulare, tutti i DEG sono stati anche annotati secondo il database Carbohydrate Active enZyme (CAZy) (Tabella supplementare 11). La secrezione di un grande arsenale di enzimi idrolitici come le proteasi e gli enzimi di degradazione della parete cellulare durante il corso dell’interazione44,45 è necessaria per i patogeni fungini necrotrofi delle piante come R. solani per indurre la necrosi cellulare attraverso la rottura delle componenti strutturali di proteine e carboidrati delle pareti cellulari delle piante e per causare la perdita di nutrienti9,30,46,47. Pertanto, si ipotizza che gli enzimi di degradazione della parete cellulare indotti e diverse peptidasi indotte funzionino nel sostenere l’interazione di R. solani AG3-PT con il tessuto del germoglio di patata. Tuttavia, le peptidasi secrete sono state anche ampiamente studiate per il loro ruolo come effettori di batteri gram-negativi48 e anche di funghi47,49. Gli effettori degli agenti patogeni sono di solito consegnati come fattori di virulenza nelle cellule dell’ospite per sopprimere le risposte di difesa basali e creare un ambiente adatto alla propagazione degli agenti patogeni50,51,52. Così, la modifica post-traslazionale delle proteine dell’ospite attraverso l’elaborazione proteolitica è un meccanismo ampiamente utilizzato nella regolazione della risposta di difesa delle piante. Allo stato attuale delle conoscenze si potrebbe supporre che una o più di queste proteasi indotte abbiano ruoli putativi come effettori che sostengono l’interazione di R. solani AG3-PT sull’ospite della patata. Tuttavia, ulteriori analisi funzionali delle singole proteasi sono necessarie per assegnare chiaramente il loro ruolo funzionale nell’interazione patogeno-ospite.

Un altro grande gruppo composto da 100 membri di geni differentemente upregolati dell’interazione a 3 dpi è descritto come codificante per proteine ipotetiche. La maggior parte di questi geni sono specifici di R. solani e gli omologhi potrebbero essere trovati negli altri cinque genomi annotati di R. solani AG3 Rhs1AP, R. solani AG2-2IIIB, R. solani AG8, e R. solani AG1-IA e AG1-IB. Dalla nostra analisi di espressione genica differenziale, ci si aspetta che alcuni di questi geni siano coinvolti nel sostenere l’interazione di R. solani AG3-PT sul germoglio di patata. È già noto che gli effettori secreti dei patogeni fungini prendono di mira l’immunità dell’ospite utilizzando varie strategie, ad esempio idrolizzando un precursore dell’acido salicilico53, o legandosi a fattori di trascrizione e inibendo così la loro attività54. Ulteriori analisi sono necessarie per rivelare le funzioni putative delle proteine finora ipotetiche per i loro vari ruoli possibili nell’interazione di R. solani AG3-PT con la patata.

Interessante, il più forte gene differenzialmente aumentato (Ben3g6247) è omologo alle proteine della famiglia lipid-translocating exporter (LTE), come RTA1 da Saccharomyces. La proteina RTA1 contiene sette potenziali segmenti che attraversano la membrana55 e si prevede che sia una proteina integrale di membrana con funzione nella resistenza cellulare agli xenobiotici56. Altri geni della famiglia LTE possono codificare trasportatori o sensori che facilitano l’escrezione di intermedi biosintetici, direttamente o indirettamente56. Queste funzioni putative delle proteine della famiglia LTE rendono il gene Ben3g6247 un candidato favorito coinvolto nella secrezione di componenti importanti per l’attacco del patogeno.

La fase iniziale dell’interazione necrotrofica è associata alla morte cellulare della pianta ospite e alla produzione di vari metaboliti secondari e all’accumulo di specie reattive dell’ossigeno21. È stato dimostrato che i processi antiossidanti e la rispettiva espressione genica erano correlati ai tessuti necrotici in diversi patosistemi di R. solani (germogli di patata-R. solani AG3; ipocotile di soia-R. solani AG4 e foglie di soia-R. solani AG1-IA)27. Nella fase iniziale dell’interazione dell’ospite di patata con l’isolato Ben3 (3 dpi) nessuna prova forte per l’induzione dei processi antiossidanti nelle ife del patogeno potrebbe essere osservato a livello trascrizionale, perché non c’era un forte aumento nell’espressione del gene glutatione S-transferasi o upregulation di altri geni noti per essere coinvolti nello scavenging di specie reattive dell’ossigeno. Pertanto, si potrebbe postulare che nel nostro sistema per colonizzare il germoglio di patata con R. solani AG3-PT, l’analisi del tessuto a 3 dpi assomiglia a una fase iniziale dell’interazione patogeno pianta forse prima infezione del tessuto del germoglio. Non sono stati osservati sintomi visibili in questo momento.

Geni espressi in modo diverso nell’isolato Ben3 a 8 dpi di germogli di patata

Al fine di trovare trascrizioni che sono importanti in una fase avanzata dell’interazione, i geni indotti in modo diverso tra il micelio puro dell’isolato Ben3 e Ben3 attratto da germogli di patata a 8 dpi sono stati vagliati. Le rispettive annotazioni funzionali dei prodotti genici e la loro distribuzione nelle caratteristiche comuni GO sono mostrate in Fig. 4. A 8 dpi, i geni differentemente indotti sono principalmente assegnati come coinvolti nei processi metabolici dei carboidrati e macromolecolari e nel trasporto. In questa fase successiva di interazione, i 152 geni upregolati (> 22%) codificano vari enzimi di degradazione della parete cellulare (ad esempio Ben3g3530, vedi tabella 2). Inoltre, tutti i DEG sono stati anche annotati secondo il database Carbohydrate Active enZyme (CAZy) (Tabella supplementare 11). Questo aumento dell’espressione dei geni che codificano per gli enzimi idrolitici della parete cellulare dimostra piacevolmente l’aumento dell’attività patogena dell’isolato Ben3 così come l’importanza della rottura dei componenti della parete cellulare per accedere ai nutrienti durante il corso dell’interazione, confermando così la strategia di virulenza descritta di un patogeno necrotrofico21,57. Questa tattica distruttiva è stata accompagnata da un’induzione dell’espressione dei geni che codificano i componenti integrali delle membrane. Queste 154 proteine di membrana integrali per lo più non caratterizzate e i trasportatori putativi erano presumibilmente coinvolti nell’assorbimento di nutrienti e prodotti di degradazione delle attività delle idrolasi. In questa fase dell’interazione l’importanza predominante dei geni che codificano per le peptidasi sembrava diminuire, ma ancora 33 geni che codificano peptidasi erano differentemente upregolati (per esempio Ben3g2070, vedi tabella 2). Questo potrebbe anche essere spiegato dal fatto che sono stati raccolti interi germogli, compresi i germogli con fino a 8 giorni di interazione con il patogeno sfidante e i successivi germogli emergenti con un periodo di interazione più breve. In generale, questo è anche rappresentato nei 350 geni che erano in comune differentemente aumentati a 3 e 8 dpi (Fig. 2).

Inoltre, un altro grande gruppo di DEG a 8 dpi è composto da 98 geni con funzione sconosciuta. Dal momento che questi geni sono specifici di Rhizoctonia senza alcuna regione di somiglianza con sequenze con funzioni assegnate, si può solo speculare sul loro ruolo nel sostenere l’interazione pianta-patogeno. Ulteriori confronti funzionali di questi geni e, ad esempio, la loro espressione differenziale nei rispettivi sistemi patogeni potrebbe dare suggerimenti sulla loro funzione putativa.

Nel sistema sperimentale qui descritto per colonizzare il germoglio di patata con R. solani AG3-PT isolato Ben3 le lesioni diventano visibili per la prima volta a 8 dpi. È stato dimostrato in altri esperimenti25,27 che l’interazione necrotrofica e la morte cellulare nella pianta ospite era correlata all’espressione genica rispettiva nella pianta e nel fungo. Samsatly e collaboratori27 hanno dimostrato, utilizzando la RT-PCR quantitativa, che l’espressione dei geni antiossidanti che codificano per la glutatione S-transferasi e la catalasi erano significativamente aumentati in R. solani AG3 cinque giorni dopo l’inoculazione di germogli di patata staccati. Ma tale espressione fortemente aumentata di questi geni antiossidanti non è stata trovata negli esperimenti qui descritti. Le ragioni di queste differenze potrebbero essere dovute all’inoculazione con isolati di R. solani AG3 che presentano differenze di patogenicità. Tuttavia, un’altra distinzione è il fatto che Samsatly e collaboratori27 hanno eseguito esperimenti con germogli staccati in un sistema limitato in vitro, mentre il nostro setup sperimentale riflette pienamente le condizioni dell’ambiente in vivo con germogli in crescita su tuberi di semi coltivati. Ulteriori indagini insieme alla concomitante analisi del trascrittoma nella patata ospite aumenteranno finalmente la comprensione di una relazione reciproca nell’interazione patogeno ospite in un ambiente che assomiglia alla situazione naturale.

Geni espressi differenzialmente nell’isolato Ben3 confrontando 3 e 8 dpi di germogli di patata

Per differenziare tra R. solani AG3-PT i trascritti che erano principalmente rilevanti al momento iniziale e quelli che diventano più importanti nelle fasi avanzate dell’interazione i geni differenzialmente espressi tra 3 e 8 dpi dell’interazione sono stati analizzati anche con DESeq2. Utilizzando i criteri di cui sopra con P-valori aggiustati di meno di 0.05 e un minimo fold change di |2| o più 173 geni potrebbe essere assegnato come differenzialmente ridotto espresso tra 3 e 8 dpi mentre 400 geni sono differenzialmente aumentato espresso al timepoint successivo. Elenchi completi di questi geni insieme ai loro rispettivi valori medi di base e valori di fold change sono riportati nella tabella supplementare 10, elenchi dei 20 geni più differenzialmente espressi tra 3 e 8 dpi sono presentati nelle tabelle 3 e 4. Mentre 10 dei 20 geni più differenzialmente espressi tra 3 e 8 dpi sono codificanti per proteine coinvolte nella degradazione delle proteine e nell’assorbimento e assimilazione dell’azoto (Tabella 3), la maggior parte dei geni differenzialmente espressi tra 3 e 8 dpi sono coinvolti nella degradazione dei polisaccaridi con attenzione alle monoossigenasi litiche rame-dipendenti dei polisaccaridi per la scissione delle catene di cellulosa con ossidazione di vari carboni (Tabella 4).

È noto che il metabolismo dell’azoto e l’espressione genica regolata dall’azoto nei funghi patogeni delle piante è di grande importanza per lo stabilimento della malattia nella pianta ospite58. Tuttavia, il nitrato è la fonte di azoto meno preferito rispetto all’ammonio e L-glutamina per quanto riguarda l’utilizzo dei nutrienti nei funghi almeno durante l’infezione delle foglie59. Nei funghi, questa utilizzazione preferenziale dei nutrienti è regolata attraverso la repressione dei metaboliti dell’azoto e assicura la trascrizione dei geni codificanti le permeasi attive di ammonio e urea. Oltre alla forte espressione transitoria dei geni che codificano l’ammonio e composti azotati trasporto permeasi (Ben3g6147, Ben3g6767, Ben3g4369, e Ben3g7775) nella fase di interazione precoce a 3 dpi, R. solani AG3-PT isolato Ben3 esercitato anche alta induzione ed espressione dei geni coinvolti in assorbimento e assimilazione di nitrato (Ben3g6360, Ben3g6359, e Ben3g6361). Se questo è un tratto distintivo dell’isolato Ben3 o una caratteristica dei funghi patogeni per le piante presenti nel suolo avrebbe bisogno di ulteriori indagini.

La maggior parte dei geni con espressione differentemente aumentata tra 3 e 8 dpi sono coinvolti nella degradazione della parete cellulare codificando per idrolasi che agiscono sui legami glicosilici e pectato liasi. Questo era previsto e dimostra ancora una volta l’importanza crescente della degradazione dei componenti della parete cellulare che designa la strategia di virulenza di un patogeno necrotrofico21.

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