Risultati e discussione
Per comprendere meglio la formazione e la riparazione dei siti AP derivanti dalla riparazione per escissione di basi e dalla depurinazione/depirimidinazione spontanea in vivo, abbiamo misurato il numero di siti AP endogeni nel DNA genomico estratto da vari tessuti di ratti adulti e da fegato umano di qualità da trapianto usando il saggio ASB (3). Il numero di siti AP endogeni variava ampiamente tra i tessuti (Fig. 1) ⇓ ma non all’interno dei tessuti. Il più alto numero di siti AP è stato rilevato nel cervello, con 30 siti AP per 106 nucleotidi, seguito dal cuore e dal colon. Al contrario, il fegato, il rene e il polmone di ratto hanno mostrato costantemente il minor numero di siti AP (8-9 siti AP per 106 nucleotidi). Il numero di siti AP endogeni nel fegato umano era paragonabile a quello del fegato di ratto. Questi dati indicano che i siti AP persistono a 50.000-200.000 lesioni per cellula di mammifero in condizioni fisiologiche normali. Il numero stazionario di siti AP nel DNA genomico dovrebbe riflettere l’equilibrio tra la formazione e la riparazione dei siti AP. Le possibili interpretazioni del maggior numero di siti AP endogeni nel cervello sono le seguenti: (a) maggiore tasso di depurinazione e/o formazione di addotti al DNA endogeno, con conseguente aumento dei siti AP; (b) maggiore attività della glicosilasi del DNA, inducendo più siti AP; (c) minore attività dell’endonucleasi AP di tipo II, causando l’accumulo di siti AP; e (d) minore efficienza della dRp-asi o β-eliminazione, lasciando siti AP con 5′-nicked.
Siti AP endogeni in tessuti umani e di ratto. Il DNA è stato estratto a 4°C da tessuti intatti di ratto e fegati umani normali, e il numero di siti AP è stato misurato usando il saggio ASB. A, tipica pellicola a raggi X che mostra i siti AP endogeni dei tessuti di ratto. Il DNA (compresi i campioni di DNA standard) è stato caricato su una membrana NC (1,5 μg per slot). B, dati densitometrici di scansione dei siti AP endogeni nei tessuti di ratto e umani. Colonne, mezzi da slot duplicati di cinque a otto campioni individuali; barre, SD.
Il processo principale nella riparazione dei siti AP è il tipo II AP endonucleasi/β-pol-dipendente percorso (7). L’endonucleasi AP di tipo II può riconoscere i siti AP e incidere la spina dorsale del fosfodiestere immediatamente al 5′ delle lesioni, lasciando un gruppo 3′-idrossile e la terminazione del sito 5′-AP (5). Il 5′-dRp viene successivamente rilasciato, e la lacuna del singolo nucleotide viene riempita. È stato dimostrato che quantità significative di endonucleasi AP di tipo II sono presenti nel nucleo delle cellule di mammifero (8). In precedenza, abbiamo dimostrato che la combinazione del saggio ASB e dell’endonucleasi AP di tipo II o NaOH induce la scissione 3′ o 5′ dei siti AP, rispettivamente (3). Per capire l’attività di endonucleasi AP e dRp-asi in vivo, abbiamo ulteriormente ottimizzato il saggio di scissione del sito AP. In questo esperimento, abbiamo usato Exo III come endonucleasi AP di tipo II per identificare 3′-cleavage dei siti AP e putrescina per rilevare 5′-nicks (Fig. 2)⇓. Per caratterizzare questo saggio di scissione sito AP, abbiamo incubato il DNA che era stato pretrattato con MX per ridurre il numero di siti AP a 3,8 ± 0,5 siti AP per 106 nucleotidi (media ± SD) con calore e tampone acido. Vari periodi di incubazione calore/acido hanno indotto 11, 47, 115 e 320 siti AP per 106 nucleotidi. Un singolo trattamento di Exo III ha ridotto il numero di siti AP di 4-10 siti AP per 106 nucleotidi in ogni campione di DNA, indipendentemente dal numero iniziale presente (Fig. 3)⇓. Questa riduzione può essere dovuta alla combinazione di incisione enzimatica sul lato 5′ da Exo III e scissione aspecifica 3′ dei siti AP durante l’incubazione con Exo III. Questa scissione aspecifica 3′ precludeva una precisa quantificazione del numero di siti AP 3′-nicked nel DNA con questo test. Al contrario, il trattamento con putrescina non ha mostrato alcuna riduzione del numero di siti AP. Dopo l’incubazione con Exo III seguita da putrescina, il numero di siti AP è stato ridotto al numero originale di siti AP nel DNA di timo di vitello pretrattato con MX. L’efficienza di scissione dei siti AP dalla combinazione di Exo III e putrescina era >99%.
Schema del saggio di scissione del sito AP. Per comprendere meglio le attività dell’endonucleasi AP di tipo II, così come della dRp-asi in vivo, abbiamo determinato l’esistenza di scissioni sul lato 5′ o 3′ dei siti AP nel DNA genomico. Putrescina e Exo III (endonucleasi AP di tipo II) lasciano siti AP 3′-cleaved e 5′-cleaved, rispettivamente. Per i siti AP intatti senza incisione ai lati 3′ e 5′ dei siti AP, il saggio ASB può teoricamente rilevare il numero originale di siti AP dopo il trattamento con Exo III o putrescina perché i siti AP rimangono sulla spina dorsale del DNA dopo l’incisione su entrambi i lati del legame fosfodiestere adiacente al sito AP. Tuttavia, la combinazione di Exo III e putrescina taglia sia al 3′ che al 5′ lato del sito AP, con conseguente rilascio del sito AP dalla spina dorsale del DNA. Tali siti AP rilasciati non vengono rilevati da questo test. Sulla base del numero di siti AP lasciato sulla spina dorsale del DNA dopo questa reazione di scissione, il numero di 5′- e 3′-cleaved siti AP può essere stimato. Se 5′-cleaved siti AP sono presenti nel DNA, il trattamento putrescina singolo può rilasciare il 5′-nicked siti AP da 3′-cisione dei siti AP. Allo stesso modo, i siti AP 3′-nicked nel DNA possono essere rilasciati da 5′-cisione utilizzando Exo III.
Saggio di scissione del sito AP del DNA di timo di vitello trattato con tampone caldo/acido. Per convalidare il test di scissione del sito AP, abbiamo esaminato gli effetti di Exo III e putrescina sui siti AP intatti indotti nel DNA di timo di vitello. Il numero originale di siti AP nel DNA di timo di vitello è stato ridotto da MX (CTD/MX). Il DNA è stato poi incubato in un tampone caldo/acido per diversi periodi di tempo per introdurre un numero diverso di siti AP intatti (-/-; rif. 9). Il DNA è stato incubato con Exo III e/o putrescina, e il numero di siti AP rimanenti nel DNA di timo di vitello è stato misurato dal saggio ASB. Colonne, mezzi da slot duplicati di tre campioni individuali; barre, SD. A, test di scissione del sito AP del DNA contenente 115 siti AP per 106 nucleotidi. B, riassunto del test di scissione del sito AP del DNA contenente diversi numeri di siti AP.
Abbiamo applicato questo test al DNA genomico estratto da tessuti di ratto e umani per caratterizzare i siti AP endogeni. Le frazioni di siti AP intatti e scissi e le lesioni aldeidiche residue sono riassunte nella Fig. 4⇓. Ratto e DNA tessuto umano sono stati incubati con Exo III seguita da putrescina per esaminare se le lesioni rilevate erano siti AP effettivi. Dopo 5′ e 3′ scissione dei siti AP, 1.5-2.2 lesioni aldeidiche residue per 106 nucleotidi sono stati rilevati. Questi dati indicano che il saggio ASB misura correttamente i siti AP endogeni. Le lesioni residue possono essere dovute alle limitazioni delle reazioni enzimatiche nel saggio di scissione dei siti AP così come alla presenza di lesioni di base aldeidiche endogene come il formiluracile (10). Inoltre, una frazione combinata di siti AP scissi al 3′ e intatti è stata rilevata in ∼2-3 lesioni per 106 nucleotidi in diversi tessuti, che è ∼1/3-1/10 del numero totale di siti AP endogeni. Per esaminare il numero di siti AP 5′-cleaved, abbiamo incubato il DNA con putrescina. La riduzione dei siti AP da parte della putrescina (il numero originale di siti AP meno il numero di siti AP rimasti dopo l’incubazione con putrescina) ha rappresentato il numero di siti AP 5′-cleaved. In contrasto con il DNA di timo di vitello pretrattato con il tampone calore/acido, il DNA genomico trattato con putrescina aveva un numero notevolmente diminuito di siti AP. Questi dati indicano che circa due terzi o più dei siti AP endogeni sono già scissi sul lato 5′ dei siti AP in vivo.
Sommario del test di scissione del sito AP del DNA di tessuto umano e di ratto. Il numero originale di siti AP come descritto nella legenda di Fig. 1B⇓ consisteva di 5′-cleaved, 3′-cleaved, siti AP intatti, e lesioni aldeidiche residue. Il numero di 5′-cleaved siti AP è stato calcolato come il numero originale di siti AP meno il numero di siti AP lasciato dopo il trattamento con putrescina da solo. La frazione combinata di siti AP 3′-cleaved e intatti era la differenza tra il trattamento con putrescina e il trattamento combinato di Exo III e putrescina. I siti AP residui hanno mostrato il numero di lesioni aldeidiche non scollate.
Dopo la scissione al 5′ dei siti AP da parte dell’endonucleasi AP di tipo II, i siti AP incisi devono successivamente essere rilasciati dalla spina dorsale del DNA attraverso l’escissione dei residui 5′-dRp. Questo processo di rilascio è possibilmente eseguito dalla dRp-asi tramite reazione idrolitica (11) o β-eliminazione (12) o tramite un enzima endonucleolitico che incide a valle di 5′-dRp moieties (13). È stato dimostrato che la β-pol di Xenopus e quella umana rilasciano 5′-dRp per β-eliminazione (14). Usando le dimensioni delle patch di riparazione in cellule β-pol-null o -proficienti, è stato dimostrato che una singola via di riparazione delle lacune era predominante nelle cellule β-pol-proficienti ma non nelle cellule β-pol-null (15). Inoltre, l’interazione tra l’endonucleasi AP umana e la β-pol accelera il rilascio di residui 5′-dRp in vitro (16). Tuttavia, l’efficienza di riparazione di 5′-dRp moieties non è stato ben caratterizzato in cellule o in vivo. Utilizzando estratti cellulari privi di lievito, si è scoperto che l’elaborazione delle società 5′-dRp è un passo limitante durante la riparazione per escissione di base del DNA contenente uracile (17). Inoltre, è stata esaminata l’efficienza catalitica di β-pol per rimuovere 5′-dRp (18). È interessante notare che il Kcat dell’attività 5′- dRp-asi di β-pol era ∼100 volte inferiore al Kcat dell’endonucleasi AP. Questo studio dimostra una chiara persistenza dei siti 5′-incisi di AP nei tessuti umani e di ratto. Questi dati suggeriscono che l’incisione da parte dell’endonucleasi AP e il successivo rilascio di residui 5′-dRp potrebbero non essere collegati in modo efficiente a livello basale in vivo e che il processo di riparazione del 5′-dRp potrebbe essere uno dei passi limitanti nella riparazione dell’escissione della base.
Nello studio precedente (3), abbiamo dimostrato che la depurinazione spontanea avveniva a 1,5 siti AP per 106 nucleotidi al giorno in condizioni fisiologiche. Per verificare se gli addotti del DNA termolabili come le purine N3- e N7-alchiliche fossero la fonte del maggior numero di siti AP endogeni nel cervello, è stato eseguito un test di depurinazione nel DNA del cervello e del fegato. Tuttavia, nessuna differenza è stata osservata nel cervello e nel fegato (dati non mostrati). Pertanto, lo stato costante dei siti AP endogeni potrebbe non essere dovuto a lesioni di base labili. Una delle più importanti e abbondanti lesioni del DNA endogeno è il danno ossidativo della base del DNA. È stato riportato che lo steady state della 5-idrossicitosina nel cervello di ratto è ∼2 volte superiore a quello del fegato di ratto (19). Tali basi pirimidiniche ossidative sono riparate da End III, lasciando siti AP sulla spina dorsale del DNA. Per esaminare se lo stress ossidativo potesse essere correlato al numero stazionario di siti AP nel DNA, i siti sensibili a End III sono stati quantificati usando la combinazione del saggio ASB e End III di E. coli. Il numero di siti sensibili all’End III era tre volte superiore nel cervello (14 lesioni per 106 nucleotidi) rispetto ad altri tessuti (4-5 lesioni per 106 nucleotidi). Recentemente, l’omologo umano del gene End III (hNTH1) è stato clonato e caratterizzato (20). L’espressione dell’mRNA di questo gene varia tra gli organi in un modello che corrisponde al numero di siti AP endogeni (20). La maggior parte delle glicosilasi del DNA coinvolte nella riparazione delle basi ossidate possiede l’attività di AP lyase, che scinde il lato 3′ dei siti AP. Pertanto, i siti AP endogeni 5′ non sarebbero derivati dalle scissioni delle basi ossidative da parte di tali glicosilasi del DNA. Un esperimento preliminare ha mostrato che il perossido di idrogeno con FeSO4 ha indotto direttamente i siti AP scissi al 5′ nel DNA del timo di vitello senza alcun enzima (dati non mostrati). Questi studi suggeriscono che lo stress ossidativo potrebbe essere uno dei fattori responsabili dello stato stazionario dei siti AP con scissione al 5′.
Inizialmente ci aspettavamo di trovare un basso numero di siti AP endogeni nel DNA genomico a causa della loro tossicità e mutagenicità. Tuttavia, questo studio mostra che lo stato stazionario dei siti AP è ∼1 lesione per 105 nucleotidi nel DNA genomico. Anche se i siti AP vengono costantemente riparati, la frazione di siti AP che sfugge alla riparazione è probabile che contribuisca a mutazioni, aberrazioni cromosomiche ed errori di trascrizione che possono essere associati a malattie spontanee legate all’età, come il cancro e i disturbi degenerativi.