Ricostruzione tridimensionale dell’apparato di alimentazione della zecca Ixodes ricinus (Acari: Ixodidae): una nuova visione del meccanismo di alimentazione del sangue

Immagini a raggi X della femmina I. ricinus

Qui, mostriamo che i raggi X CRYTUR set-up (basato su X-RayWorx microfocus, la fonte di raggi X, e CRYCAM X-ray detector) è altamente adatto a fornire veloce e un’osservazione non distruttiva di osmio impregnato strutture interne di zecche femmina. Figura 1A mostra i muscoli retrattori chelicerali raggiungere la zona del secondo paio delle gambe, gli spessori della cuticola, i muscoli all’interno delle gambe, e palpi (Fig. 1A, Movie 1). Il modello 3D ottenuto dalle immagini di proiezione a raggi X 2D ha fornito ulteriori informazioni spaziali sulle strutture superficiali del capitello femminile (Fig. 1B) comparabili con l’imaging in anteprima al SEM (Fig. 1D) con conseguente possibilità di visualizzare anche alcune strutture interne (ad esempio i muscoli, le basi delle chelicere e la faringe) a varie fette virtuali (Fig. 1B). La risoluzione della tomografia a raggi X era di 8,060 µm ed è stata calcolata in base all’analisi di Fourier da una fetta virtuale ricostruita nel piano laterale presente al centro dell’oggetto ricostruito. Abbiamo costruito un grafico dello spettro di potenza mediato radialmente e in base al criterio di Rayleigh, valutiamo il segnale di confine di separazione dal rumore all’8,94% della distanza tra il pavimento del rumore e il valore di picco. Poiché il modello a raggi X è stato ricostruito dalle immagini di proiezione nell’intervallo da 0° a 180° con passo 10°, la risoluzione è tecnicamente quasi isotropa. Tuttavia, questa risoluzione non era sufficiente per l’osservazione dell’apparato boccale ninfale (Fig. 1C,D, vedi il confronto delle dimensioni dell’apparato boccale femminile e ninfale allo stesso ingrandimento).

Serial section SEM

Il modello 3D dell’apparato alimentare di I. ricinus nymph che è stato ricostruito da sezioni seriali di resina ultrasottile ha rivelato relazioni del salivarium e del canale alimentare agli stiletti capitolari (cheliceri, ipostome) e altre strutture associate, soprattutto muscoli (Fig. 2, filmati 2 e 3)14.

Esternamente dal capitulum, la saliva e il pasto di sangue vengono espulsi/succhiati in una stretta fessura, il canale preorale, formato tra il solco dell’ipostoma sul lato ventrale e le chelicere sul lato dorsale (Fig. 2A). In Rhipicephalus (ex Boophilus) microplus, una sottile membrana, chiamata anche grondaia, ricopre il solco ipostomale12. È interessante notare che questa struttura mancava in Ixodes hexagonus9, Haemaphysalis longicornus15 e I. ricinus. All’interno del capitulum, la saliva/sangue continua nella cavità del salivarium, e questo percorso comune termina con una separazione di un canale alimentare dal salivarium (Fig. 2A,B). Dal lato dorsale della zecca, il canale alimentare è situato sotto il salivario. Il salivarium non è una struttura permanentemente fissa; piuttosto è creato dal posizionamento delle chelicere sopra il lato dorsale dell’ipostome. Il canale alimentare si separa dalla via comune aprendosi nella faringe. Il suo tetto è formato all’inizio da una minuscola lamella (Fig. 2B, freccia verde) che si allarga in una corta asta all’interno della profondità del capitulum (Fig. 2C,I verde) e continua come una più grande piastra sclerotizzata simile ad un’ala (nota anche come alae) (Fig. 2E,I, verde). Tutte queste strutture insieme formano un labbro. Nella parte inferiore del labbro, c’è un processo simile a un dente adiacente all’orifizio della faringe (Fig. 2C,E, frecce nere). Questa struttura simile a un dente è stata descritta in I. hexagonus, I. holocyclus, e Rhipicephalus microplus9,12,16. Il processo simile a un dente sembra inserirsi in una scanalatura dell’orifizio della faringe, quindi si suppone che sia una parte importante della valvola faringea. L’identificazione di questo processo simile a un dente come labbro è giustificata dalla sua somiglianza con il labbro delle zecche argasidi, che si estende anche dal tetto faringeo nel canale alimentare13,16. La struttura anatomica del canale alimentare, piccolo labbro, e valvola in I. ricinus, è coerente con il lento processo di alimentazione in queste zecche, in cui lunghi impulsi di succhiare si alternano con l’impulso di secrezione salivare durante il loro lungo periodo di sangue-feeding. In zecche molli, tuttavia, il labrum si estende distalmente lungo l’intera lunghezza del canale alimentare. Questo è coerente con il rapido processo di alimentazione in quelle zecche in cui rapido svolazzamento del labrum è sincronizzato con rapida suzione e salivazione per alimentare entro solo 1-2 ore13. Sulla base delle nostre osservazioni EM, questa parte anteriore del tetto faringeo non era collegato con i muscoli e probabilmente forma una parte stazionaria (di supporto) della valvola (Fig. 2B). Il tetto faringeo è collegato alle piastre sub-ipostome che creano i lati e un pavimento della faringe (Fig. 2C frecce bianche). Queste piastre sono collegate alle grandi bande muscolari dilatatrici attaccate ai loro lati opposti alla cuticola ventrale. I muscoli dilatatori anteriori della faringe (ADM, mostrati in Fig. 2C,E,I come strutture di colore rosa chiaro) sono situati solo nella parte anteriore della faringe e la loro contrazione/rilassamento permette l’apertura/chiusura della valvola nell’orifizio faringeo9,12. Le ADM sono attaccate all’angolo superiore e ai lati laterali profondi della parte anteriore della faringe. La parte centrale delle pareti della faringe è associata ad un altro gruppo di muscoli dilatatori la cui contrazione espande il lume faringeo lateralmente. Questi muscoli dilatatori laterali della faringe (LDM) possono essere visti in Fig. 2G e come strutture di colore rosa intenso in Fig. 2I,J. LDM permette l’allargamento massiccio del lume faringeo forse anche a causa della parete a forma di doppia Y nella parte anteriore (Fig. 2G) e tripla Y nella parte posteriore della faringe in una sezione trasversale (Fig. 2H) descritto da Arthur et al.9 e Sonenshine e Anderson13. L’alternanza di contrazione e rilassamento di entrambi i gruppi di muscoli dilatatori dilata la faringe, sincronizzata con l’apertura della valvola anteriore, creando un potente impulso di suzione. Il rilassamento del LDM, dopo la chiusura della valvola faringea, comprime la faringe e spinge il sangue ingerito posteriormente nell’esofago e nel midgut. La sincronizzazione temporale tra l’apertura/chiusura dell’orifizio faringeo, coordinata con l’apertura e la chiusura della valvola faringea e la compressione/allargamento del lume nella parte centrale della faringe permette la suzione, così come il movimento del cibo nell’esofago e impedisce anche il rigurgito del sangue indietro nell’ospite9,12. Il rivestimento interno della faringe è sclerotizzato, mentre la parete dell’esofago è rivestita da cellule epiteliali (Fig. 2A). L’esofago passa attraverso il synganglion e si fonde con il midgut (dati non mostrati).

Il salivarium è una grande cavità situata tra la faringe e le chelicere (Fig. 2A-E). La parte anteriore del salivario è condivisa per il passaggio del sangue e della saliva, poi la faringe è separata dal pavimento del salivario dalla piccola lamella (vedi sopra). Il tetto e i lati laterali del salivario sono rinforzati dalla piastra chelicerale sclerotizzata (ChP in Fig. 2C,E,F e struttura rossa mostrata in Fig. 2M) che si estende ulteriormente nella cavità del corpo della zecca. Nella parte posteriore del salivarium, i lati laterali di questa piastra sono collegati ai muscoli fissati su estremità opposte ai lati laterali della cavità del corpo della zecca. Questi muscoli laterali del salivario (LMS), può essere visto in Fig. 2E,F,K,L segnato in viola chiaro. La contrazione dei muscoli appiattisce la piastra, che è strettamente collegata alla parete del salivario, portando a restringere/chiudere lo spazio interno del salivario, tuttavia solo nella sua parte posteriore dietro la separazione della faringe.

Inoltre, il pavimento dell’estremità posteriore del salivario è collegato ad un piccolo gruppo di muscoli obliqui (muscoli attaccati al pavimento del salivario, MS in Fig. 2E,F,J,N, contrassegnati dal blu chiaro) uniti nelle parti opposte alla parte superiore della parte anteriore della faringe. Questi muscoli permettono il movimento verso l’alto e verso il basso della parte posteriore del pavimento del salivario. Questi muscoli sono stati descritti nella femmina di I. holocyclus16. La possibilità che il pavimento del salivario può essere abbassato o sollevato è stato proposto in precedenza in connessione di rapido scoppio di saliva basato su una registrazione di segnali elettrici durante ingorgo di R. microplus e Dermacentor andersoni12,17,18,19,20. Durante la salivazione di R. microplus, rapido (fino a 30 per sec) deviazioni verso il basso in conducibilità seguita da picchi più grandi alla fine della salivazione sono stati osservati. Una spiegazione per queste misurazioni è le contrazioni dei muscoli nella parte anteriore della faringe, accompagnato da una pulsazione simile della membrana sopra il canale alimentare (grondaia hypostomal) che apre un canale per l’espulsione della saliva20. Supponiamo che i piccoli muscoli obliqui attaccati al pavimento del salivario possono generare vibrazioni che facilitano il movimento della saliva. Tuttavia, anche i muscoli laterali che influenzano il diametro dello spazio interno del salivario possono partecipare a espellere la saliva fuori l’apparato boccale (non incluso in animazione). Suggeriamo che il movimento delle chelicere all’interno della pelle dell’ospite può anche contribuire ad espellere la saliva dal salivario nella pelle dell’ospite. Le basi chelicerali (ChB in Fig. 2A,B) si trovano direttamente sopra il salivarium (dalla vista dorsale) e si ipotizza che queste strutture possono comprimere localmente il salivarium per aiutare l’espulsione di saliva. Estensioni delle chelicere, che erano leggermente asincrono, è stato osservato da due fotone intra-vital microscopia direttamente all’interno del sito di alimentazione durante tutto il periodo di I. scapularis engorgement21. Abbiamo notato che che chelicerae iniziano a muoversi in modo leggermente asincrono dopo l’applicazione di pilocarpina sulla cuticola dorsale di unfed e parzialmente alimentato femmina I. ricinus (Film 5 e 6, rispettivamente). Le basi chelicerali (ChB in Fig. 2A,B) si trovano direttamente sopra il salivarium (dalla vista dorsale) e possiamo ipotizzare che queste strutture possono espandere o comprimere il salivarium e aiutare a espellere la saliva. L’applicazione di pilocarpina, un farmaco colinergico non endogeno, è ben noto per indurre la salivazione indirettamente attraverso il sistema nervoso centrale della zecca22, mentre il suo effetto ad altri tessuti della zecca rimangono oscuri. Pertanto, non possiamo escludere la pilocarpina-mediata movimento di chelicerae nei nostri esperimenti come un ulteriore effetto di questo farmaco in zecche. Bockenstedt et al. ha suggerito che chelicerae forza indietro fibre di collagene che possono comprimere il sito di alimentazione, confermando notevolmente le nostre ipotesi di chelicerae mediata espulsione saliva all’ospite21.

Poco prima della fine della cavità salivare, dotti salivari accoppiati entrare nei suoi angoli laterali12. Entrambi i dotti salivari sono racchiusi in un foglio di tessuto (TSD in Fig. 2C,E,F,M,N, viola scuro) che probabilmente fissa in modo flessibile i dotti salivari agli angoli laterali del salivario.

Simulazione della salivazione e suzione del sangue basato sul modello 3D

Durante il processo di alimentazione in zecche ixodidi, la salivazione si alterna con suzione di sangue lento o rapido e può includere un periodo di riposo. Percentuali di tempo speso da ogni attività durante l’ingorgo femminile sono variabili e basato sul tempo del giorno, dimensioni delle zecche, ecc.18. Nel film 4, abbiamo animato sia il canale alimentare e il canale per il passaggio della saliva con strutture associate e mostrare come queste strutture funzionano. Il processo di alimentazione della maggior parte delle zecche ixodidi inizia con la secrezione di sostanze simili al cemento, che permette alla zecca di essere fissata nella pelle dell’ospite e sigilla lo spazio tra la lesione di alimentazione e l’apparato boccale inserito23,24,25. Il periodo di salivazione può essere concluso da un breve scoppio di saliva16,17,18,19. L’espulsione di saliva è probabilmente facilitata dalla vibrazione della parte posteriore del pavimento salivarium; movimento di basi chelicerali anche può essere in gioco (film 6). Prima dell’inizio della suzione del sangue, l’orifizio della parte posteriore del salivario viene ristretto dai muscoli laterali tesi tra il tetto del salivario e la parete laterale del corpo della zecca. Questa azione è seguita dall’apertura della valvola faringea e da un’espansione della faringe anteriore causata dalla contrazione dei muscoli dilatatori anteriori. Successivamente, la parte centrale della faringe si allunga lungo il suo asse longitudinale e il sangue viene aspirato nella faringe. La valvola faringea anteriore si chiude prima che la parete faringea si contragga di nuovo e il sangue sia spinto posteriormente verso l’esofago. Questa onda peristaltica si ripete fino all’inizio della salivazione. All’inizio della salivazione, i muscoli limitatori laterali del salivario si rilassano allargando così la cavità del salivario. Ripetuti abbassamenti e sollevamenti del tetto del salivario nella sua parte posteriore probabilmente facilitano la consegna della saliva al canale preorale.