I.U.B.: 3.1.27.5
C.A.S.9001-99-4
Reazione enzimatica (l’immagine si apre in una nuova finestra)
La ribonucleasi pancreatica (RNasi) è una endoribonucleasi. Catalizza la scissione del legame fosfodiestere tra il 5′-ribosio di un nucleotide e il gruppo fosfato attaccato al 3′-ribosio di un nucleotide pirimidinico adiacente. Questa scissione forma un fosfato 2′,3′-ciclico, che viene poi idrolizzato al corrispondente fosfato 3′-nucleoside.
La RNasi si trova in maggior quantità nel pancreas dei ruminanti (Barnard 1969). Il componente principale dell’enzima cristallino è la RNasi A; un componente minore è la RNasi B. La RNasi B è la forma glicosilata della RNasi A (Beintema et al. 1976).
Storia:
Il lavoro di Jones nel 1920 è solitamente citato come “inizio” della ribonucleasi pancreatica (Richards e Wycoff 1971). La RNasi fu isolata da Dubos e Thompson nel 1938 e cristallizzata da Kunitz nel 1940.
Nel 1947 Worthington fu la prima azienda a produrre RNasi cristallina altamente purificata. Nei primi anni ’50, la società Armour preparò l’enzima cristallino grezzo, e lo offrì ad un prezzo molto conveniente. Negli anni ’60 e ’70, la RNasi A era una delle preferite da studiare soprattutto perché è notevolmente termostabile e presente ad alta concentrazione in una fonte accessibile, il pancreas bovino. Questi studi hanno portato all’elucidazione della struttura cristallina (Anfinsen 1959, Groves 1966, e Scheraga 1967), alla determinazione della sequenza di aminoacidi (Smyth et al. 1963), all’identificazione del meccanismo catalitico (Beers 1960), e al chiarimento dei percorsi di ripiegamento (Hantgan et al. 1974). La RNasi A è stato il primo enzima e la terza proteina per cui è stata determinata una corretta sequenza di amminoacidi (Raines 1998).
Quattro premi Nobel sono stati assegnati per il lavoro associato agli studi sulla RNasi (Anfinsen, Moore, Stein, e Merrifield). La vasta letteratura e i numerosi studi hanno reso la RNasi l’enzima più studiato del 20° secolo (Raines 1998).
I lavori recenti continuano a studiare la sintesi e la maturazione della RNasi nel reticolo endoplasmatico delle cellule vive (Geiger et al. 2010). Molto lavoro è ancora dedicato allo studio del ripiegamento e dell’aggregazione della RNasi (Benito et al. 2008, Iwaoka et al. 2008, e Arai et al. 2010). Si sta studiando il ruolo dell’enzima nello sviluppo del cancro e nella regolazione dei geni (Shlyakhovenko 2009), e si stanno sviluppando agenti chemioterapici per il cancro (Chao et al. 2010).
Specificità:
RNase A è specifica per i legami nucleosidici pirimidinici (Volkin e Cohn 1953). Si ritiene che la reazione avvenga in due fasi. Nella prima fase, il legame 3′,5′-fosfodiestere viene scisso, generando un intermedio fosfodiestere 2′,3′-ciclico. Nella seconda fase, il fosfodiestere ciclico viene idrolizzato in un gruppo 3′-monofosfato. Il primo passo è aspecifico rispetto alla base azotata del substrato; tuttavia, il secondo passo è assolutamente specifico per i nucleotidi pirimidinici con 2′,3′-fosfati ciclici terminali. La RNasi B ha la stessa specificità della RNasi A sia verso il citidilato ciclico che verso l’RNA del lievito (Plummer e Hirs 1963). La RNasi A mostra una preferenza per substrati più grandi (Nogués et al. 1995).
L’enzima taglia i residui di citidina due volte più velocemente dei residui di uridile (Richards e Wyckoff 1971). Si è scoperto che Thr45 è più importante per mediare la specificità pirimidinica, sia formando legami idrogeno con le basi pirimidiniche che escludendo stericamente le basi puriniche (del Cardayré e Raines 1994). La catena laterale di Asp83 è importante per stabilizzare lo stato di transizione durante il clivaggio di substrati contenenti uridina; questo residuo non ha effetto sulla cinetica del clivaggio della citidina (del Cardayré e Raines 1995).
Composizione:
La forma della proteina assomiglia a un rene, con i residui del sito attivo che si trovano nella fessura (Richardson 1981, e Raines 1998). La struttura secondaria contiene lunghi beta-sheet antiparalleli a quattro filamenti e tre brevi alfa-elici (Raines 1998). La RNasi A contiene quattro legami disolfuro, che sono critici per la stabilità dell’enzima nativo. Due di questi legami disolfuro si trovano tra un’alfa-elica e un beta-sheet e contribuiscono maggiormente alla stabilità termica rispetto agli altri due (Klink et al. 2000). La RNasi B è una glicoproteina che contiene all’Asn34 un singolo oligosaccaride composto da sei residui di mannosio e due residui di N-acetilglucosamina (Tarentino et al. 1970).
Caratteristiche molecolari:
La RNasi A è una piccola proteina, l’enzima maturo ha solo 124 residui di aminoacidi, senza carboidrati attaccati. La RNasi A contiene 19 dei 20 aminoacidi, mancando solo il triptofano (Nogués et al. 1995, e Raines 1998). La struttura tridimensionale della RNasi A è completamente codificata dalla sua sequenza di aminoacidi (White e Anfinsen 1959, e Raines 1998). Tutti gli otto geni umani simili alla RNasi A si trovano sul cromosoma 14. Ognuno codifica una sequenza di segnale secretorio e contiene una triade catalitica invariante di due istidine e una lisina con un motivo conservato (CKXXNTF) (Marshall et al. 2008).
Sono state identificate le sequenze aminoacidiche di molti omologhi della RNasi A, rendendo la RNasi A un sistema modello per l’evoluzione molecolare dei vertebrati (Dyer e Rosenberg 2006). Dalle sequenze e dalla loro distribuzione in una gamma di specie è stato stabilito che la RNasi A è una proteina moderna che si evolve rapidamente (Doolittle 1992, e Raines 1998).
Numero di accesso alla proteina: P61823
Classificazione CATH (v. 3.2.0):
- Classe: Alpha-Beta
- Architettura: Rotolo
- Topologia: Proteina P-30
Peso molecolare:
- RNasi A: 13,7 kDa (Hirs et al. 1956b)
- RNasi B: 14,700 ± 0,3 (Plummer e Hirs 1963)
PhpH ottimale: RNase A: 7.0-7.5 (Brown e Todd 1955)
Punto isoelettrico:
- RNase A: 9.3 (Ui 1971)
Coefficiente di estinzione:
- RNase A e B: 8.640 cm-1M-1 (Teorico)
- RNase A: E 1%, 280 = 7.3 (Worthington RNase A)
- RNase B: E 1%, 280 = 5.77 (teorico, RNasi B)
Residui del sito attivo:
- Istidina (H12, H119)
- Lisina (K41)
Attivatori:
- Cloruro di sodio (Weickmann et al. 1981)
- Solfato (Moosavi-Movahedi et al. 2006)
Inibitori:
- Ioni di metalli pesanti
- Inibitore della ribonucleasi (RI), una proteina di 50 kDa che costituisce ≤ 0.01% della proteina nel citosol delle cellule di mammifero (Takahashi 1967)
- Complessi di uridina-vanadato (Lindquist et al. 1973)
Applicazioni:
- Rimozione dell’RNA durante l’isolamento del DNA
- Analisi della sequenza dell’RNA
- Saggi di protezione dalla RNase
- Quantificazione o mappatura dell’RNA
- Purificazione del DNA plasmidico
- Isolamento del DNA genomico
- Marcatore di peso molecolare