Abstract
Precedentemente, il nostro gruppo ha dimostrato che l’espressione nucleare della ligasi E3 ubiquitina (MDM2) nel mesotelioma pleurico maligno (MPM) è significativamente associata ad una ridotta sopravvivenza complessiva. Una possibile spiegazione può essere che la sovraespressione di MDM2 porta a una degradazione proteasomica di TP53 che alla fine risulta in una perdita di apoptosi e senescenza indotta da TP53. È ben noto da altre entità tumorali che il ripristino dell’attività di TP53, ad esempio, mediante l’inibizione di MDM2, si traduce in un immediato stress indotto da TP53 e/o nella risposta ai danni al DNA delle cellule tumorali. Nutlin-3A (un analogo della cis-imidazolina) è stato descritto come un potente e selettivo inibitore di MDM2 che previene l’interazione MDM2-TP53 attraverso un legame specifico alla tasca idrofobica di legame a TP53 di MDM2. Nel presente studio, gli effetti dell’inibizione di MDM2 nel MPM tramite Nutlin-3A e gli agenti chemioterapici standard a base di platino sono stati testati comparativamente in tre linee cellulari MPM (NCI-H2052, MSTO-211H, e NCI-H2452) che mostrano diversi profili di espressione di TP53, MDM2, e il suo inibitore fisiologico di MDM2-P14/ARF. I nostri esperimenti in vitro sulle linee cellulari MPM hanno rivelato che la Nutlin-3A in combinazione con il cisplatino ha prodotto un’induzione della senescenza fino a 9,75 volte superiore (p=0,0050) e un tasso di apoptosi fino a 5 volte superiore (p=0,0067) rispetto ai regimi di cisplatino e pemetrexed comunemente utilizzati. Quindi Nutlin-3A, un potente inibitore di MDM2, è associato ad una significativa induzione della senescenza e dell’apoptosi nelle linee cellulari di MPM, rendendo Nutlin-3A una sostanza promettente per una terapia mirata nel sottogruppo di MPM che mostra una sovraespressione di MDM2.
1. Introduzione
Il mesotelioma maligno è un tumore altamente aggressivo che nasce da superfici rivestite di mesotelio, soprattutto nelle cavità pleuriche (mesotelioma pleurico maligno, MPM). Quando non trattato, la sopravvivenza mediana dei pazienti è di nove mesi. I pazienti con MPM sono influenzati negativamente dalle modalità di trattamento attuali, per lo più insufficienti, che consistono in regimi contenenti platino che utilizzano cisplatino o carboplatino come prima scelta. Il trattamento con cisplatino si traduce in un tasso di risposta di appena il 14% e una sopravvivenza mediana di meno di sette mesi. Il carboplatino ha portato a tassi di risposta simili che vanno dal 6 al 16%. Nella pratica clinica, l’antifolato pemetrexed, come unica terapia approvata dalla FDA per il MPM, è usato in combinazione con composti del platino.
Diversi studi hanno dimostrato l’efficacia della valutazione dell’espressione intratumorale dei membri del metabolismo dell’acido folico per la previsione della risposta della terapia antifolato multitarget in pazienti con diverse entità tumorali, ma sono discussi in modo controverso. Poiché i platino-analoghi sono composti genotossici che inducono danni al DNA che portano all’arresto del ciclo cellulare indotto da TP53 e all’apoptosi, è fondamentalmente concepibile che il meccanismo di riparazione del DNA possa essere una delle chiavi associate a una risposta alterata alla terapia. Poiché l’identificazione delle proprietà molecolari condivise dai MPM può aiutare a superare la scarsa risposta al trattamento osservata, diversi studi hanno affrontato questa domanda. Tuttavia, le ragioni per l’efficacia piuttosto scarsa dei composti del platino rimangono in gran parte sconosciute.
Riassumendo, non esistono finora né biomarcatori predittivi affidabili né concetti terapeutici individualizzati per il MPM. Pertanto, le linee guida attuali sottolineano la necessità di terapie innovative e nuove.
Siccome le mutazioni del gene TP53 sono estremamente rare nel MPM, altri meccanismi come la cancellazione del locus o alterazioni epigenetiche possono contribuire all’inattivazione di TP53. La sovraespressione di MDM2 in alcuni tipi di tumore può portare a una perdita della funzione di regolazione di TP53 nelle cellule tumorali attraverso la sua maggiore degradazione proteasomica. P14/ARF, l’inibitore fisiologico di MDM2, è riconosciuto come un soppressore tumorale e contribuisce a questo meccanismo attraverso l’induzione di arresto del ciclo cellulare sia in un modo TP53-dipendente che TP53-indipendente. Inoltre, la regolazione dei miRNA sembra giocare un ruolo importante. In studi precedenti, abbiamo dimostrato una forte sovraespressione MDM2 nucleare in circa il 25% del MPM; questa osservazione è stata limitata al MPM epitelioide o alle componenti epitelioidi del MPM bifasico. I pazienti con MPM MDM2-positivo hanno mostrato una sopravvivenza complessiva (OS) e una sopravvivenza libera da progressione (PFS) significativamente ridotte rispetto al MPM MDM2-negativo. Questo potrebbe essere spiegato da un’attività e/o stabilità di TP53 significativamente diminuita o completamente abolita mediata da una sovraespressione di MDM2.
Un ripristino dell’attività di TP53, per esempio, dall’inibizione di MDM2, potrebbe risultare in una risposta immediata allo stress indotto da TP53 e/o ai danni al DNA delle cellule tumorali. Nutlin-3A (un analogo cis-imidazolina) è un inibitore MDM2 potente e selettivo con un valore IC50 di 90nM e impedisce l’interazione MDM2-TP53 legandosi alla tasca idrofobica TP53-binding di MDM2.
Quindi, lo scopo di questo studio è stato quello di testare l’effetto dell’inibizione di MDM2 nel MPM tramite Nutlin-3A rispetto alle strategie chemioterapiche comuni contemporanee utilizzando tre linee cellulari che mostrano diversi profili di marcatori riguardanti lo stato TP53, il livello di espressione P14/ARF- e MDM2.
2. Materiale e metodi
2.1. Esperimenti con linee cellulari
Sulla base della revisione della letteratura, sono state stimate le concentrazioni per i citostatici (Nutlin-3A, cisplatino e pemetrexed, rispettivamente).
Le linee cellulari MPM umane sono state ottenute dalla American Type Culture Collection nel 2012-08 (Manassas, VA, USA). Le linee cellulari sono state autenticate e testate per le contaminazioni utilizzando un servizio commerciale (Multiplexion, Heidelberg, Germania) e sono state ritestate direttamente dopo la fine degli esperimenti.
NCI-H2052, NCI-H2452, e MSTO-211H sono state coltivate in Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium (Invitrogen, CA, USA) contenente 10% di siero bovino fetale (Invitrogen) a 37 ° C in un 5% di CO2-umidificata atmosfera. Le cellule sono state coltivate fino all’85% – 95% di confluenza, poi lavate con soluzione salina a base di fosfato (Invitrogen), e tripsinizzate con 1 ml di 0,05% tripsina-0,53 mM acido etilendiamminotetraacetico, rosso fenolo (Invitrogen). La tripsinizzazione è stata interrotta aggiungendo terreno fresco alla reazione. Circa 10 μl sono stati trasferiti in un emocitometro (BRAND, Wertheim, Germania) per il conteggio delle cellule. 1.000 cellule per pozzetto (100 μl) sono state seminate in micropiastre 96/U (Eppendorf, Amburgo, Germania) adatte al rilevamento della luminescenza e della fluorescenza. Le cellule sono state lasciate attaccare per una notte a 37°C e 5% CO2. Il giorno successivo, il mezzo è stato rimosso e ad ogni pozzetto è stato applicato un mezzo fresco contenente uno dei citostatici o senza additivo. Cisplatino (10μM; TEVA, Petah Tikva, Israele) pemetrexed (200μM; Lilly, IN, USA) e Nutlin-3A (5, 10 o 20μM; Sigma-Aldrich, MO, USA) è stato applicato da solo o in combinazione. La Nutlin-3A doveva essere solubilizzata in dimetilsolfossido (Sigma-Aldrich). Le concentrazioni dei citostatici applicati sono riassunti nella tabella 1. Le colture cellulari contenenti citostatici e mezzo vuoto sono state incubate per tre giorni a 37°C e 5% CO2. Entro 72 ore, necrosi, apoptosi e vitalità cellulare sono stati valutati utilizzando i seguenti saggi di luminescenza: CytoTox-Glo™ Cytototoxicity Assay (Promega), Caspase-Glo® 3/7 Assay (Promega), e CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay (Promega). I saggi sono stati eseguiti come raccomandato dal fornitore. Per ogni farmaco citostatico e test di luminescenza sono stati misurati almeno quattro punti dati. La luminescenza è stata valutata utilizzando uno SpectraMax L Luminescence Microplate Reader (Molecular Devices, CA, USA). La luminescenza (unità luminescenti relative; RLU) è stata misurata a 570nm e il tempo di integrazione è stato regolato a 1 secondo. La temperatura dello SpectraMax L è stata mantenuta tra 21,5°C e 24,5°C durante le misurazioni. Inoltre, da ogni linea cellulare è stato preparato un blocco FFPE per l’analisi immunoistochimica e qPCR.
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2.2. Isolamento dell’RNA e Real-Time qPCR
I livelli di espressione di ACTB (gene di riferimento), MDM2 e P14/ARF, sono stati studiati da TaqMan real-time qPCR nelle tre linee cellulari MPM. Quindi, l’RNA è stato isolato tagliando da tre a cinque sezioni di 4μm dal blocco FFPE usando un microtomo (Leica, SM 2000 R, Wetzlar, Germania). RNA totale è stato isolato utilizzando il kit miRNeasy FFPE (Qiagen, Hilden, Germania) e il protocollo del produttore, ad eccezione di due modifiche (digestione della proteinasi K durante la notte; eluizione in 25μl). Le concentrazioni di RNA sono state misurate utilizzando la spettrometria UV/VIS (NanoDrop ND-1000, PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen, Germania). L’RNA è stato conservato a -80°C. Per la sintesi di cDNA, il kit di sintesi cDNA iScript Select e il protocollo (Bio-Rad Laboratories, Inc, CA, USA) è stato usato con un input di 1μg di RNA totale per reazione.
Per la qPCR in tempo reale, sono stati usati i TaqMan Gene Expression Assays on Demand (AoD) per ACTB (Hs03023943_g1), MDM2 (Hs01066942_m1), e P14/ARF (Hs99999189_m1) (Applied Biosystems®; CA, USA). I volumi di reazione sono stati modificati utilizzando il 50% dei volumi di reazione totali raccomandati con 50 ng di cDNA in ingresso. Ogni target è stato misurato in triplicato. I valori Ct di P14/ARF e MDM2 sono stati normalizzati ai valori medi di ACTB. QPCR in tempo reale e l’analisi dei dati sono stati eseguiti su un Roche LightCycler 480 II (Roche, Basilea, Svizzera) e il software corrispondente. Tutti gli esperimenti di qPCR in tempo reale sono stati eseguiti in conformità con le linee guida MIQE.
2.3. Immunoistochimica
Immunoistochimica è stata eseguita secondo i protocolli standard utilizzando un coloratore automatico (Ventana Discovery XT, Monaco, Germania). Dopo la validazione su tessuti di riferimento (liposarcoma per MDM2, adenocarcinoma polmonare per TP53), le indagini immunoistochimiche sono state eseguite con anticorpi diretti contro MDM2 (clone IF2, Calbiochem, Darmstadt, Germania, diluizione: 1:80) e TP53 (clone BP53-12, Zytomed, Berlino, Germania; diluizione: 1:5000). Il pretrattamento per il recupero dell’antigene è stato eseguito riscaldando in acqua deionizzata a pH 6 per 30 minuti. L’espressione della proteina è stata valutata utilizzando un sistema di punteggio IHC a quattro stadi basato sulla percentuale di nuclei di cellule tumorali con un’immunoreazione positiva (Punteggio 0: nessun segnale; Punteggio 1 (espressione debole): 1-25%; Punteggio 2 (espressione moderata): 26-50%; Punteggio 3 (espressione forte): >50%).
2.4. Analisi statistica
Le analisi statistiche e grafiche sono state eseguite con l’ambiente di programmazione statistica R (v3.4.2).
Per l’analisi tra i singoli gruppi, è stato applicato il test Wilcoxon Mann-Whitney rank sum (non parametrico) o il t-test di studenti a due lati (parametrico). Per le variabili ordinali con più di due gruppi (differenze del segnale di luminescenza tra tutti i gruppi di trattamento), il test Kruskal-Wallis (non parametrico) o ANOVA (parametrico) è stato utilizzato per rilevare le differenze di gruppo.
Il livello di significatività statistica è stato definito come p<0,05.
3. Risultati
I profili di espressione di MDM2, TP53 e P14/ARF differiscono tra le linee cellulari studiate e sono riassunti nella tabella 2. Le scansioni delle colorazioni immunoistochimiche sono mostrate nella Figura 1; i risultati della qPCR sono visualizzati nella Figura 2. NCI-H2052 ha mostrato una pronunciata MDM2-immunoespressione, ma poca P14/ARF e TP53-espressione. Immunoistochimicamente, MSTO-211H non ha mostrato alcuna espressione di MDM2 e P14/ARF, ma era presente l’espressione di TP53. NCI-H2452 non ha mostrato né MDM2 né TP53-espressione, ma è stata rilevata l’espressione di P14/ARF. Le linee cellulari studiate rappresentano la costellazione molecolare che è stata riportata in studi precedenti di pazienti con MPM.
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-: espressione minima o nulla
+: espressione misurabile +/-: poca espressione misurabile |
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(a) NCI-H2052, colorazione anti-P53
(b) NCI-H2052, colorazione anti-MDM2
(c) NCI-H2452, colorazione anti-P53
(d) NCI-H2452, colorazione anti-MDM2
(e) MSTO-211H, colorazione anti-P53
(f) MSTO-211H, colorazione anti-MDM2
(a) NCI-H2052, colorazione anti-P53
(b) NCI-H2052, colorazione anti-MDM2
(c) NCI-H2452, colorazione anti-P53
(d) NCI-H2452, colorazione anti-MDM2
(e) MSTO-211H, colorazione anti-P53
(f) MSTO-211H, colorazione anti-MDM2
3.1. Risposta delle linee cellulari MPM al pemetrexed, al cisplatino e a diverse concentrazioni di Nutlin-3A
Il cisplatino (10μM) e il pemetrexed (200μM) come agente singolo e in combinazione sono stati testati rispetto a tre concentrazioni di Nutlin-3A (5μM, 10μM, e 20μM).
3.1.1. Vitalità cellulare
NCI-H2052. Qualsiasi concentrazione di Nutlin-3A era superiore nel ridurre la vitalità cellulare rispetto al cisplatino o al pemetrexed o alla loro combinazione, rispettivamente (p=0,0039). Al contrario, il trattamento con il solo pemetrexed ha mostrato una vitalità cellulare significativamente elevata. Il trattamento con cisplatino da solo ha mostrato una maggiore vitalità cellulare rispetto al cisplatino e al pemetrexed in combinazione.
MSTO-211H. Il pemetrexed combinato con il cisplatino è stato associato alla più alta vitalità cellulare, seguito dal cisplatino da solo e dalla concentrazione più bassa di Nutlin-3A (p=0,0952). Il pemetrexed combinato con il cisplatino ha ridotto significativamente la vitalità cellulare, ma la Nutlin-3A (10μM) ha mostrato una riduzione leggermente più forte. La più alta concentrazione di Nutlin-3A ha ridotto la vitalità cellulare al minimo.
NCI-H2452. La più alta concentrazione di Nutlin-3A (20μM) ha ridotto la vitalità cellulare al minimo (p=0,0017). 10μM Nutlin-3A è stato il secondo più forte inibitore della vitalità cellulare seguito da cisplatino da solo, pemetrexed da solo, e cisplatino in combinazione con pemetrexed. La concentrazione più bassa di Nutlin-3A ha mostrato l’impatto più debole sulla riduzione della vitalità cellulare.
I box plot per la vitalità cellulare evidenziano la diminuzione della vitalità cellulare con l’aumento della concentrazione di Nutlin-3A nelle linee cellulari testate. I risultati per tutte le linee cellulari riguardanti la senescenza/vitalità cellulare sono riassunti nelle figure 3(a)-3(c).
(a)
(b)
(c)
(a)
(b)
(c)
3.1.2. Apoptosis
NCI-H2052. Nella linea cellulare NCI-H2052, il più alto tasso di apoptosi è stato trovato per 20μM Nutlin-3A, mentre gli altri approcci di trattamento hanno mostrato un’induzione di apoptosi simile (p=0,14).
MSTO-211H. In MSTO-211H, i più alti tassi di apoptosi sono stati trovati per il pemetrexed seguito dal pemetrexed in combinazione con cisplatino e diverse concentrazioni di Nutlin-3A (p=0,0219). Quasi nessuna apoptosi è stata osservata per il cisplatino da solo e Nutlin-3A.
NCI-H2452. NCI-H2452 ha rivelato il più alto tasso di apoptosi in risposta a Nutlin-3A nella concentrazione più alta (20μM) seguita dal cisplatino (p=0,0359). Tassi di apoptosi significativamente più bassi sono stati trovati per gli altri citostatici.
I risultati per l’apoptosi sono riassunti nelle figure 4(a)-4(c).
(a)
(b)
(c)
(a)
(b)
(c)
3.1.3. Necrosi
La necrosi delle cellule non è stata influenzata da nessuno dei chemioterapici rispetto al controllo (dati non mostrati).
3.2. Risposta delle linee cellulari MPM a diverse concentrazioni di Nutlin-3A combinate con il cisplatino
In ulteriori esperimenti, l’induzione dell’apoptosi è stata testata utilizzando un regime di Nutlin-3A o una combinazione di Nutlin-3A e cisplatino. Tre combinazioni di Nutlin-3A (5μM, 10μM, e 20μM) più cisplatino (10μM) sono state confrontate con cisplatino (10μM) da solo, pemetrexed (200μM) da solo, Nutlin-3A da solo (10μM), e una combinazione di cisplatino e pemetrexed.
3.2.1. Vitalità cellulare
NCI-H2052. La Nutlin-3A da sola e la sua combinazione con il cisplatino hanno mostrato un aumento significativo dell’induzione della senescenza rispetto all’altro regime (p=0,0051). Solo 5μM di Nutlin-3A in combinazione con il cisplatino ha mostrato una potenza inferiore per indurre tassi di senescenza come 5μM di Nutlin-3A senza cisplatino. Le concentrazioni più alte di Nutlin-3A (10 e 20μM) con cisplatino hanno ridotto la vitalità cellulare al minimo. La vitalità cellulare più alta è stata trovata per il pemetrexed seguito dalla combinazione di pemetrexed e cisplatino.
MSTO-211H. Qualsiasi combinazione di Nutlin-3A con cisplatino ha indotto una senescenza cellulare significativamente aumentata rispetto al cisplatino, al pemetrexed o alla combinazione di entrambi (p=0,0059). Tuttavia, la combinazione di cisplatino e pemetrexed ha mostrato un’efficacia simile rispetto al regime più basso di Nutlin-3A/cisplatino e alla sola Nutlin-3A. Concentrazioni più elevate di Nutlin-3A combinate con il cisplatino hanno ridotto la vitalità cellulare al minimo.
NCI-H2452. Nutlin-3A in combinazione con il cisplatino o da solo era superiore rispetto agli altri citostatici, tranne alla concentrazione più bassa di 5μM (p=0,0089). È interessante notare che il cisplatino ha mostrato un’efficacia comparabile a 10μM di Nutlin-3A da solo e al cisplatino in combinazione con 5μM di Nutlin-3A. La più alta vitalità cellulare è stata osservata con pemetrexed, cisplatino in combinazione con pemetrexed, e 5μM Nutlin-3A. La più alta concentrazione di Nutlin-3A (20μM) con cisplatino ha mostrato il più alto tasso di senescenza.
I box plot per la vitalità cellulare evidenziano che la vitalità cellulare è diminuita con l’aumentare della concentrazione del regime cisplatino/Nutlin-3A nelle linee cellulari testate. I risultati per la senescenza/vitalità cellulare sono riassunti nelle figure 3(a)-3(c).
3.2.2. Apoptosis
NCI-H2052. Nella linea cellulare NCI-H2052, concentrazioni più elevate di Nutlin-3A combinate con il cisplatino applicato hanno indotto un aumento significativo dell’apoptosi rispetto al pemetrexed da solo o combinato con il cisplatino (p=0,0069). I più alti tassi di apoptosi sono stati trovati per 10μM di Nutlin-3A in combinazione con il cisplatino.
MSTO-211H. La linea cellulare MSTO-211H ha mostrato la più alta apoptosi quando trattata con pemetrexed da solo (p=0,0035). Il secondo più alto tasso di apoptosi è stato trovato per 10μM Nutlin-3A combinato con cisplatino. Il pemetrexed in combinazione con il cisplatino ha portato al terzo più alto tasso di apoptosi. Il cisplatino in combinazione con 20μM Nutlin-3A è stato più potente del cisplatino da solo, del Nutlin-3A da solo, e della concentrazione più bassa di Nutlin-3A (5μM) in combinazione con il cisplatino.
NCI-H2452. I più alti tassi di apoptosi sono stati trovati per l’agente singolo 20μM Nutlin-3A e per le concentrazioni di 10μM e 20μM Nutlin-3A combinate con cisplatino, seguite dal cisplatino (p=0,1).
I risultati riguardanti l’apoptosi sono riassunti nelle figure 4(a)-4(c).
3.2.3. Necrosi
La necrosi delle cellule non è stata influenzata da nessuno dei chemioterapici rispetto al controllo non trattato (dati non mostrati).
Tutti i risultati degli esperimenti di inibizione della linea cellulare sono riassunti nella tabella 3.
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(a) Risposta delle linee cellulari MPM a pemetrexed, cisplatino, e a varie concentrazioni di Nutlin-3A
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(b) Risposta delle linee cellulari MPM a varie concentrazioni di Nutlin-3A combinata con cisplatino
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4. Discussione
In studi precedenti abbiamo identificato MDM2 come un biomarcatore prognostico in pazienti con MPM e che l’espressione è regolata attraverso miRNA specifici. Nutlin-3A inibisce l’interazione MDM2-TP53 e quindi induce l’arresto del ciclo cellulare, senescenza e apoptosi a seconda del tipo di cellula. Inoltre, è un farmaco non genotossico che mostra poca tossicità nei modelli animali ed è associato a un rischio minore di resistenza rispetto ai farmaci convenzionali.
In questo contesto abbiamo ipotizzato che la sovraespressione di MDM2, forse in combinazione con la perdita parziale o completa di P14/ARF, possa essere mirata da un regime terapeutico basato sulla Nutlin-3A per ripristinare l’attività di TP53 in un sottogruppo di MPM.
In questo approccio in vitro, gli effetti dei chemioterapici attualmente all’avanguardia cisplatino e pemetrexed, da soli e in combinazione, rispetto alla Nutlin-3A sono stati studiati in tre linee cellulari che coprono il modello trovato nei pazienti. La Nutlin-3A ha indotto la senescenza in modo efficiente in tutte e tre le linee cellulari MPM ed è stata superiore rispetto al cisplatino e/o al pemetrexed, mentre l’apoptosi poteva essere indotta solo ad alte concentrazioni. È noto dalla letteratura che gli effetti di Nutlin-3A sono specifici del tipo di cellula, inducendo piuttosto l’arresto del ciclo cellulare e la senescenza che l’apoptosi. Di conseguenza, abbiamo studiato il cisplatino e la Nutlin-3A in combinazione per aumentare lo stress cellulare inducendo danni al DNA basati sul platino. La combinazione di Nutlin-3A con cisplatino si traduce in un aumento dei tassi di apoptosi e senescenza rispetto a Nutlin-3A da solo, come una funzione principale di TP53 è il danno al DNA e la risposta allo stress.
Lo stesso meccanismo sembra essere vero quando si combinano Nutlin-3A e radioterapia per fornire ulteriori danni cellulari e spostare la risposta cellulare TP53 verso l’apoptosi, già dimostrato in TP53 wild-type carcinoma squamoso esofageo in vitro e in vivo. È interessante notare che Shimazu et al. hanno trovato un ulteriore effetto inibitorio della crescita nel MPM quando combinano Nutlin-3A con la metformina, un inibitore mTOR, suggerendo un possibile cross-talk tra la via mTOR e TP53. Da notare che gli autori hanno confermato i nostri risultati delle linee cellulari NCI-H2052 e MSTO-211H come migliori rispondenti alla terapia con Nutlin-3A, postulando un valore IC50 di 0.37μM (MSTO-211H) e 0.50μM (NCI-H2052), rispettivamente.
Come menzionato prima, la sovraespressione di MDM2 può portare ad una perdita della funzione regolatrice di P53 attraverso una maggiore degradazione proteasomale. Oltre al suo inibitore fisiologico P14/ARF, l’analisi della relazione di segnalazione tra questi geni indica un ulteriore ruolo di RB1 in questa rete di segnalazione. È stato dimostrato che, oltre all’inibizione dell’interazione MDM2-TP53, Nutlin-3A influenza anche le interazioni MDM2-RB1, rendendo questa una possibile spiegazione per gli effetti indipendenti da TP53 basati su Nutlin-3A.
Interessante, anche la linea cellulare MSTO-211H a bassa espressione di MDM2 e la linea cellulare negativa MDM2 e TP53 NCI-H2452 mostrano un’induzione ridotta ma chiaramente rilevabile dell’apoptosi tramite Nutlin-3A combinata con cisplatino. Inoltre, le cellule immunoistochimicamente negative hanno, come riportato in precedenza, un modello di espressione genica rilevabile di MDM2, con conseguente concentrazione di proteina MDM2 al di sotto del limite di rilevamento di IHC. Noi ipotizziamo che, poiché la regolazione guidata da MDM2 di TP53 è un mediatore essenziale dell’apoptosi e dello stato cellulare in una situazione fisiologica, anche l’inibizione dell’interazione TP53-MDM2 a questi bassi livelli di MDM2 avrà un effetto benefico sulla citotossicità dei composti del platino, spiegando gli effetti collaterali della terapia con Nutlin-3A. Per NCI-H2452, una linea cellulare con espressione assente di TP53, l’effetto osservato deve essere indipendente da TP53 e si basa molto probabilmente sugli effetti inibitori di RB1.
Attualmente, Nutlin-3A viene somministrato per os come sostanza R05045337 in uno studio clinico multicentrico di fase I per la terapia della neoplasia ematologica. Inoltre, RG7112, un derivato di Nutlin-3A è entrato in studi clinici di fase I in pazienti con liposarcomi che sono tumori TP53 wild-type con MDM2 amplificato. In questo studio clinico, RG7112 è stato somministrato per os in 20 pazienti in un ambiente neoadiuvante. Un paziente ha mostrato una remissione parziale e 14 hanno mostrato una malattia stabile, ma tutti i pazienti hanno sofferto di effetti collaterali come la neutropenia. Una possibile spiegazione potrebbe essere le alte dosi di farmaco di 1440 mg m-2 giorno-1 per os. In precedenti studi in vivo, la somministrazione orale di Nutlin-3A ha mostrato diversi limiti come elevate quantità di Nutlin-3A in ingresso (200-400 mg/Kg) e difficoltà nella somministrazione di questi alti dosaggi. È degno di nota il fatto che sono stati sviluppati sistemi di consegna efficienti utilizzando polimeri come il poli (lattide-co-glicolide) (PLGA) e anticorpi monoclonali
5. Conclusione
In questo studio in vitro, la nostra ipotesi che il MPM MDM2-overexpressing possa essere bersagliato da una chemioterapia a base di Nutlin-3A è stata dimostrata. In particolare, per un’impostazione ottimale del biomarcatore di MDM2-overexpression e una bassa/assente espressione di P14/ARF, sono stati osservati tassi di apoptosi e senescenza superiori rispetto ai chemioterapici convenzionali. Anche per un’impostazione del biomarcatore meno ottimale con un’espressione minima di MDM2, un’induzione favorevole dell’apoptosi e della senescenza era evidente per Nutlin-3A in combinazione con il cisplatino rispetto al regime di farmaci convenzionali. Pertanto, l’approccio terapeutico basato su Nutlin-3A potrebbe essere di grande valore per un sottogruppo di pazienti con MPM.
Data Availability
I dati utilizzati per sostenere i risultati di questo studio sono disponibili dall’autore corrispondente su richiesta.
Divulgazione
I risultati del presente studio sono stati presentati al German Cancer Consortium (DKTK), 1st Essen Translational Oncology Symposium (ETOS) (Essen, 2018), e al 33° Congresso tedesco sul cancro (Berlino 2018).
Conflitti di interesse
Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.
Riconoscimenti
Lo studio è stato finanziato dall’Istituto di Patologia, Ospedale Universitario di Essen, e dalla Ruhrlandklinik Essen.