Linee di Drosophila
Diverse linee (GMR57C10-Gal4, elav-Gal4, UAS-GCaMP6s, UAS-GCaMP6f, UAS-CD4:tdGFP, e UAS-tdTomato) sono state ottenute dal Bloomington Stock Center. MAN-Gal4 (VT50660-AD; VT14014-DBD) e MDN-1-Gal4 (VT44845-DBD; VT50660-AD) sono stati forniti da B. Dickson (Janelia Research Campus). DNa01-Gal4 (SS00731: GMR22C05-AD; GMR56G08-DBD), DNb06-Gal4 (SS02631: GMR20C04-AD; BJD113E03-DBD), DNg13-Gal4 (SS02538: BJD118A10-AD; BJD123E03-DBD), e DNg16-Gal4 (SS01543: BJD104A07-AD; BJD107F12-DBD) sono stati forniti da G. Rubin (Janelia Research Campus).
Generazione di Act88F:Rpr costrutto e mosche
I ceppi Actin88F:Rpr (Act88F:Rpr mosche) sono stati generati utilizzando un Actin88F:eGFP costrutto29. La linea Act88F:GFP, che ospita un costrutto eGFP guidato da una regione 2053 bp del promotore actin88F, è stato ottenuto da R. Benton (Università di Losanna). Un Act88F:Rpr costrutto è stato generato utilizzando la seguente coppia di primer, per aggiungere un sito di restrizione KpnI all’estremità 5′ di un clone di cDNA rpr (IP02530, Drosophila Genomics Resource Center, Bloomington, IN) e un sito XbaI all’estremità 3′ della struttura di lettura aperta, tramite un QuikChange Site-directed mutagenesis kit (Agilent Technologies):
Primer in avanti 5′ AGACGGTACCATGGCAGTGGCATTC 3′
Primer inverso 5′ GCCGCGTCTAGATCATTGCGATGGCTT 3′
Il costrutto Rpr è stato poi impiombato nel costrutto Act88F:eGFP dietro il promotore Act88F al posto della sequenza eGFP. Il Act88F: Rpr costrutto è stato iniettato in attp18 embrioni Drosophila per PhiC31 integrase-mediata sito-specifico transgenesi35 (transgene atterraggio sito citolocalizzazione 6C12) da BestGene Inc. (Chino Hills, CA). Per alcuni esperimenti, questo transgene è stato combinato con UAS-GCaMP6s-p2A-tdTomato (generato nel laboratorio di M.H.D.).
Fluorescenza imaging dei muscoli di volo indiretto
Microscopia fluorescente di hemi-thoraces è stata eseguita36,37. Brevemente, le mosche sono stati anestetizzati e le loro teste e addomi sono stati rimossi. Thoraces sono stati fissati durante la notte in paraformaldeide 4% a 4 ° C e risciacquato in 1 × tampone fosfato salino (PBS) il giorno seguente. I campioni sono stati disposti su un vetrino di vetro, snap congelato in azoto liquido e bisecato lungo il piano midsagittal utilizzando una lama di rasoio. IFMs sono stati colorati con Alexa-Fluor 568 falloidina (1:100 in PBS con 0,1% Triton-X (PBST)) durante la notte a 4 ° C, sciacquati con PBS e visualizzati utilizzando EVOS ® FL Cell Imaging System (Life Technologies) a ×4 ingrandimento. Per l’imaging whole-mount di miofibrille IFM, mosche sono stati preparati e thoraces bisecato come descritto sopra. Emi-toraci sono stati colorati con Alexa-Fluor 568 falloidina (1:100 in PBST) durante la notte a 4 ° C. I campioni sono stati risciacquati in PBS, montati con Vectashield (Vector Laboratories) e visualizzati utilizzando un microscopio confocale Leica TCS SPE RGBV (Leica Microsystems) a 100x ingrandimento.
Immunofluorescenza di cervelli e cordoni nervosi ventrali
Il cervello e VNC sono stati sezionati da 2-3 mosche dpe femminile in PBS. I tessuti sono stati poi fissati per 20 min in paraformaldeide 4% in PBS a temperatura ambiente. Dopo la fissazione, cervelli e VNC sono stati lavati 2-3 volte in PBS con 1% Triton-X-100 (PBST) per 10 min ciascuno e poi incubati a 4 ° C durante la notte in PBST. I campioni sono stati poi messi in PBST con 5% di siero di capra normale (PBSTS) per 20 min a temperatura ambiente. Sono stati poi incubati con anticorpi primari (coniglio anti-GFP a 1:500, Thermofisher RRID: AB_2536526; mouse anti-Bruchpilot/nc82 a 1:20, Developmental Studies Hybridoma Bank RRID: AB_2314866) diluiti in PBSTS per 48 h a 4 ° C. Cervelli e VNC sono stati sciacquati 2-3 volte in PBST per 10 min ciascuno prima dell’incubazione con anticorpi secondari (capra anti-coniglio anticorpo secondario coniugato con Alexa 488 a 1:500; Thermofisher; capra anti-mouse anticorpo secondario coniugato con Alexa 633 a 1:500; Thermofisher) diluito in PBSTS per 48 h a 4 ° C. Infine, cervelli e VNC sono stati sciacquati 2-3 volte per 10 min ciascuno in PBST e montati su vetrini con coprioggetti a ponte in Slowfade mounting-media (Thermofisher).
I campioni sono stati ripresi utilizzando un microscopio confocale a scansione laser Carl Zeiss LSM 700 con le seguenti impostazioni: ×20 ingrandimento, 8-bit gamma dinamica, 2 × media delle immagini, 0,52 × 0,52 micron dimensioni dei pixel, 0,57 micron intervallo z-passo. Deviazione standard z-proiezioni di volumi di imaging sono stati fatti utilizzando Fiji38. Per confrontare l’espressione GFP nel sistema nervoso centrale, l’intensità del laser e guadagni PMT per il canale verde sono stati mantenuti costanti attraverso wild-type, A1 > GFP, e Act88F: campioni GFP.
Imaging espressione GFP nei muscoli delle gambe
Le gambe sono stati sezionati manualmente al corpo-coxa giunto e montato su vetrini con nastro biadesivo. Slowfade mounting-media (Thermofisher) è stato poi aggiunto allo spazio tra il vetrino coprioggetto e il vetrino. Abbiamo poi registrato la fluorescenza GFP nel canale verde utilizzando un microscopio confocale a scansione laser LSM 700 (Zeiss). Intensità del laser, guadagni PMT, e parametri di scansione sono stati mantenuti costanti attraverso wild-type, MHC > GFP e Act88F:GFP animali: Ingrandimento ×20, 8-bit gamma dinamica, ×8 media dell’immagine, 0,63 × 0,63 µm dimensione del pixel, e 10 µm z-step intervallo. Auto-fluorescenza cuticolare è stato registrato anche nel canale rosso.
Sezione toracica per VNC imaging
I supporti personalizzati utilizzati per montare mosche durante l’imaging sono stati fabbricati come descritto in precedenza39. Per l’imaging VNC, queste fasi sono state modificate per avere (i) spessori in acciaio piatto piuttosto che piegato, e (ii) vertici smussati per rendere il tapis roulant sferico visibile ai sensori di flusso ottico (Shapeways, ‘file’). Gli spessori in acciaio sono stati fabbricati da 0,001″ acciaio inossidabile, tipo 316 ricotto morbido (McMaster-Carr, parte #2317K11). Gli spessori sono stati incisi (Etchit, Buffalo, MN) per generare fori rettangolari come spiegato qui. Il file di progettazione shim può essere trovato ‘qui’.
Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti su 1-3 dpe mosche femminili allevati a 25 ° C sul cibo farina di mais standard su una luce 12 h: 12 h ciclo di buio. Le mosche sono state anestetizzate a 4 °C. Una mosca femmina è stato selezionato e, in alcuni casi, le sue ali sono state tagliate per semplificare il processo di montaggio. Torace dorsale della mosca è stato poi spinto attraverso un foro nello spessore in acciaio della fase di imaging. Il palco è stato poi capovolto, colla UV-curing (Bondic, Aurora, ON Canada) è stato accuratamente applicato intorno al perimetro del torace e curato da illuminazione UV (LED-200, Electro-Lite Co. Bethel, CT USA). La colla UV è stata poi utilizzata per fissare la testa e l’addome alla parte inferiore del palco. Il palco è stato poi riempito con salina extracellulare 18. Sotto un microscopio ad alto ingrandimento dissezione (Leica M165C), un ago ipodermico (30 G, BD PrecisionGlide, Franklin Lakes, NJ USA) è stato utilizzato per tagliare e sollevare la cuticola fuori dal torace dorsale 40, facendo attenzione a non recidere il connettivo del collo. Successivamente, in non-Act88F:Rpr animali, un paio di pinze opache è stato utilizzato per rimuovere IFMs, prevalentemente dalla regione anteriore-mediale del torace sovrastante l’intestino (questo passaggio non è necessario in Act88F:Rpr animali). Questo processo espone la superficie dorsale del proventricolo, una grande struttura intestinale bulbosa. Con grande attenzione, un paio di pinze super-fine è stato poi utilizzato per afferrare e sollevare il proventricolo per spostare gran parte dell’intestino (compreso il gozzo e ghiandole salivari) dal tessuto nervoso più ventralmente situato. Con l’intestino così sollevato, ultra-fine forbici clipper (Fine Science Tools, Foster City, CA USA) sono stati utilizzati per tagliare nella sua sezione più anteriore. Il proventricolo è stato poi staccato e un’incisione posteriore è stata fatta per rimuovere completamente queste porzioni di intestino, rivelando il tessuto nervoso sottostante. In particolare, questa dissezione rimuove anche l’aorta, limitando il flusso di emolinfa dal vaso addominale dorsale. Tuttavia, abbiamo trovato che le mosche erano vitali e si comportavano per un massimo di 4 h. In alcuni casi, abbiamo osservato che il tessuto intestinale o muscolare avrebbe cominciato a oscurare il VNC durante l’imaging. Pertanto, il tessuto sciolto dovrebbe essere rimosso in questa fase, pur facendo molta attenzione a non recidere il VNC. Dopo ogni dissezione, abbiamo esaminato la misura in cui l’animale spostato le gambe in risposta a un soffio d’aria o afferrato un oggetto con ciascuna delle sue gambe. Questo ha dimostrato di essere un accurato predittore del successo della preparazione. Per valutare la qualità di una dissezione, abbiamo esaminato i movimenti di ogni zampa sul tapis roulant sferico. Se una mosca poteva camminare in modo coordinato, la dissezione era considerata riuscita. Altrimenti, l’animale è stato classificato come avente una deficienza di movimento degli arti. Gli animali con più gambe disfunzionali sono stati classificati come incapaci.
Microscopia a 2 fotoni durante il comportamento
Gli esperimenti sono stati eseguiti nel tempo Zeitgeber sera (Z.T.) e gli animali sono stati in genere imaged 30-60 min dopo la dissezione. Portamosche sono stati fissati ad una piattaforma rialzata sopra il tapis roulant sferico (Fig. 3a supplementare). Il VNC è stato poi individuato utilizzando oculari microscopio e posizionato al centro del campo visivo da 2 fotoni imaging.
Il tapis roulant sferico è una barra di alluminio con un foro a forma di palla fresato ad una estremità22. Abbiamo fabbricato 10 mm di diametro palle di schiuma (Last-A-Foam FR-7106, General Plastics, Burlington Way, WA USA) e macchiato manualmente con una penna Rapidograph (Koh-I-Noor, Leeds, MA USA) per fornire caratteristiche ad alto contrasto per le misure di flusso ottico. Un flusso di 500-600 mL min-1 di aria filtrata e umidificata è stato fatto passare attraverso il supporto utilizzando un controller di flusso digitale (Sierra Instruments, Monterey, CA USA). I movimenti della palla sono stati misurati utilizzando due sensori di flusso ottico (ADNS3080) dotato di lenti zoom (Computar MLM3X-MP, Cary, NC USA). La palla e la mosca sono stati illuminati utilizzando una coppia di LED IR (850-nm lunghezza d’onda di picco) accoppiato a fibre ottiche e lenti collimatrici (ThorLabs, Newton, NJ USA). Misure di flusso ottico sono stati passati a una scheda microcontrollore (Arduino Mega2560) per essere registrato utilizzando il codice personalizzato Python. Contemporaneamente, le registrazioni video degli animali che si comportano sulla palla sono state fatte utilizzando una telecamera firewire IR-sensibile (Basler, Ahrensburg, Germania) a circa 30 fps.
Abbiamo eseguito microscopia a 2 fotoni utilizzando un microscopio Bergamo II (ThorLabs) dotato di due rivelatori GaAsP PMT per GCaMP6 e tdTomato imaging e accoppiato a un laser Ti:Sapphire (MaiTai DeepSee, Newport Spectra-Physics, Santa Clara, CA USA) sintonizzato a 930 nm. Abbiamo usato un obiettivo Olympus 20 × a immersione in acqua con 1,0 NA (Olympus, Center Valley, PA USA). Il microscopio è stato controllato utilizzando il software ThorImage (ThorLabs). Esperimenti di imaging sezione coronale sono stati eseguiti in modalità di imaging Galvo-Galvo a 6-9 Hz. Questo framerate variava con le dimensioni dell’immagine che variava tra 26,58 × 26,58 µm e 53,15 × 53,15 µm. La potenza del laser variava tra 3 mW e 5,7 mW. L’imaging volumetrico è anche possibile con hardware appropriato (ad esempio, scanner Galvo-Resonance e collare obiettivo Piezo-driven).
Occasione, un soffio d’aria è stato utilizzato per suscitare comportamenti di camminare. Questi soffi sono stati codificati digitalmente (Honeywell AWM 3300 V, Morris Plains, NJ USA). Personalizzato software ROS interfacciato attraverso un dispositivo di uscita analogica (Phidgets, Calgary, Canada) al software ThorSync (ThorLabs) è stato utilizzato per sincronizzare le misure di flusso ottico, videografia comportamento, misure di soffio d’aria, e 2-fotone acquisizione delle immagini. Per l’imaging sezione coronale, un collare Piezo (Physik Instrumente, Karlsruhe, Germania) è stato utilizzato per controllare rapidi movimenti dell’asse z della lente obiettivo del microscopio.
Per confrontare l’attività neurale tra il controllo e Act88F: Rpr animali, abbiamo acquisito 512 × 512 immagini pixel a 1.7 fps utilizzando una intensità laser costante e guadagno PMT. Regioni di imaging selezionati sono stati scelti empiricamente come sezioni orizzontali costituiti da punti di riferimento osservati a ~ 61-65 µm di profondità nel filmato supplementare 1.
Confrontare camminare con o senza dissezione
Per valutare gli effetti della dissezione sulla locomozione, animali wild-type sono stati sottoposti alla seguente procedura. Gli animali sono stati montati su stadi di imaging e la soluzione salina è stata aggiunta ad ogni stadio. Solo un sottoinsieme casuale di animali è stato sezionato. Ogni mosca montata è stato poi posto sul tapis roulant sferico e il suo comportamento a piedi sono stati registrati per 30 min. Flusso ottico è stato registrato come descritto sopra. Per aumentare la probabilità di locomozione, un impulso di 500 ms di 100% CO2 è stato diretto alle antenne della mosca con un intervallo di un minuto tra gli impulsi (0,05 ln min-1 utilizzando un controller di flusso di massa; Vögtlin Instruments, Svizzera).
Stimolazione antennale laser infrarosso
Per confrontare i comportamenti di camminare tra Act88F:Rpr e animali di controllo, abbiamo stimolato le loro antenne con un 830 nm vicino laser infrarosso (Schäfter + Kirchhoff, Germania). Abbiamo prima anestetizzato 7-8 animali femmina dpe a 4 ° C e montati su fasi di imaging. Le mosche sono stati poi acclimatati per 10 min. Per ogni esperimento, un animale ha ricevuto dieci impulsi di stimolazione laser 2 s (18.1 mW) alla sua antenna destra ad un 60 s intervallo inter-pulso. Controllo e Act88F:Rpr animali sono stati testati in alternanza per ridurre al minimo gli effetti del tempo circadiano sui confronti comportamentali.
Statistica
Le dimensioni del campione per gli esperimenti sugli animali sono stati scelti come segue: abbiamo eseguito almeno tre esperimenti per illustrare la popolazione e registrazioni neurali sparse ed eseguito più di dieci esperimenti per gruppo quando si eseguono confronti statistici. Un criterio prestabilito di basso segnale-rumore segnali di fluorescenza ha portato alla rimozione di due esperimenti MDN dal nostro set di dati. Nessuna randomizzazione o cecità è stato utilizzato. Per la stimolazione laser antennale, i dati non erano normalmente distribuiti, quindi Friedman e Mann-Whitney U-test sono stati eseguiti. Stime di variazione sono presentati come media e bootstrapped 95% intervalli di confidenza.
Analisi dei dati
Abbiamo analizzato tutti i dati utilizzando script Python personalizzato. Poiché la frequenza di acquisizione dei dati differiva per il flusso ottico, videografia comportamento, e 2-fotone imaging abbiamo interpolato i segnali per abbinare quelli della frequenza più alta. Successivamente, i dati di flusso ottico sono stati lisciati utilizzando una media in esecuzione (finestra = 200 ms) e poi tradotto in rotazioni s-1 per anteriore-posteriore, mediale-laterale, e gli assi di imbardata 22. Per rendere queste misure più intuitive, rotazioni s-1 sono stati poi convertiti in mm s-1 (1 rotazione s-1 = 31.42 mm s-1) per anteriore-posteriore (vforward) e mediale-laterale (vside) movimenti e in gradi s-1 (1 rotazione s-1 = 360° s-1) per imbardata (vrotation) movimenti22.
L’analisi della locomozione in animali sezionati (Fig. supplementare 2) è stata eseguita come segue. Vforward dati di flusso ottico per 20 mosche sezionato e 20 non sezionato sono stati downsampled a 1500 punti s-1 e levigato utilizzando una media in esecuzione di durata 0,2 s. Per calcolare la percentuale di tempo in cui si cammina in avanti/indietro o lateralmente sono state definite empiricamente due soglie, -0,31 mm s-1 e +0,31 mm s-1, per distinguere tra lo stare fermi e il camminare in avanti (verso destra) o indietro (verso sinistra), rispettivamente. I valori superiori a 0,31 mm s-1 sono stati considerati momenti di camminata in avanti (verso destra) e i valori inferiori a -0,31 mm s-1 sono stati considerati momenti di camminata all’indietro (verso sinistra). I valori di flusso ottico tra queste soglie sono stati considerati momenti di immobilità. La percentuale di tempo in cui si cammina è stata calcolata come la proporzione di punti di dati in cui un animale non è stato considerato fermo. Allo stesso modo, le soglie di 10.8 e -10.8 gradi s-1 sono state utilizzate per definire i momenti di svolta. Un bout è stato definito come un periodo continuo di camminare o girare.
Grandi deformazioni dei tessuti potrebbero verificarsi durante il comportamento. Pertanto, abbiamo eseguito post-hoc pan-neuronale registrazione delle immagini (Fig. 2). Abbiamo registrato tutti i fotogrammi di un esperimento di imaging a un’immagine di riferimento. Poiché la complessità delle deformazioni non poteva essere catturato utilizzando semplici modelli di movimento parametrici (ad esempio, trasformazioni affini), abbiamo usato un non-parametrico, approccio variazionale, progettato per modellare deformazioni arbitrariamente complesse. Abbiamo calcolato il campo di movimento w tra l’immagine di riferimento, indicata con Ir, e l’immagine al tempo t, indicata con It, risolvendo il problema di minimizzazione
dove D(w) è un termine di adattamento dei dati, il secondo termine è una regolarizzazione che promuove la scorrevolezza di w penalizzando il suo gradiente ∇w41, Ω è il dominio discreto dell’immagine, e il parametro λ bilancia i contributi dei due termini.
Le immagini GCaMP6s rappresentano una sfida per la stima del movimento perché l’attività neurale produce grandi cambiamenti di intensità locali. Pertanto, abbiamo usato un ulteriore fluoroforo indipendente dall’attività, tdTomato, e definito un termine di dati della forma
Il primo termine modella l’assunzione standard di conservazione dell’intensità lungo la traiettoria di ogni pixel. E’ definito da
dove usiamo una norma \(ell _1\) per ottenere una parziale robustezza ai cambiamenti di intensità42. Il secondo termine in Eq. (2) è un vincolo di corrispondenza delle caratteristiche ispirato da Revaud e collaboratori43, scritto come
Nelle Eq. (2)-(4), Ir e It sono del canale tdTomato. La minimizzazione della funzione ϕ favorisce che i vettori di movimento w(x) siano vicini alle corrispondenze delle caratteristiche m(x, Ir, It), calcolate su un insieme sparso di punti chiave rilevanti. Otteniamo m con l’algoritmo di corrispondenza delle caratteristiche proposto da Revaud e collaboratori43, che è specificamente progettato per gestire grandi deformazioni dell’immagine. Calcoliamo m utilizzando il canale di imaging tdTomato, in modo che le corrispondenze sono anche insensibili ai cambiamenti di intensità tra Ir e It. Di conseguenza, la stima è guidata da corrispondenze affidabili. Il parametro γ bilancia i due termini in Eq. (2).
Per ogni esperimento, abbiamo ottimizzato i valori di λ e γ utilizzando una ricerca a griglia per registrare le immagini della sezione orizzontale del VNC (Fig. 4 supplementare). Come funzione obiettivo per l’ottimizzazione, abbiamo usato il gradiente dell’immagine media temporale44. Piccoli valori di λ (cioè, λ < 1000), occasionalmente portato a artefatti nelle immagini registrate. Questi artefatti erano associati con forte convergenza nel campo vettoriale w(x) (Fig. 4c supplementare). Pertanto, abbiamo definito empiricamente gli artefatti come gruppi di pixel con \({mathrm{div}},{mathbf{w}} a sinistra( {mathbf{x}} a destra) < – 1.2\) e cardinalità >20 (abbiamo ottenuto risultati simili con cardinalità >5). Infine, abbiamo selezionato i valori λ e γ come quelli senza artefatti e con il più alto gradiente dell’immagine media. Esempi di immagini non registrate, campi vettoriali di trasformazione e immagini registrate dei tre esempi ottimizzati sono mostrati nel filmato supplementare 5.
Abbiamo risolto il problema di ottimizzazione in Eq. (1) con un metodo di direzione alternata del moltiplicatore (ADMM) algoritmo45. Abbiamo introdotto due variabili di divisione, associate alla regolarizzazione e ai termini di corrispondenza delle caratteristiche, rispettivamente. Ogni sottoproblema dell’algoritmo è stato risolto analiticamente. Abbiamo usato parti della libreria di problemi inversi descritta in rif. 46. Un post processing basato sul filtraggio mediano ponderato è stato applicato utilizzando il metodo da47.
In Fig. 2, i comportamenti sono stati semi-automaticamente annotati, utilizzando un modulo personalizzato Python. Questo modulo permette all’utente di selezionare due regioni di interesse (ROI) sul primo fotogramma del video. La prima ROI è utilizzata per rilevare la camminata e deve essere posizionata sopra le gambe metatoraciche e mesotoraciche. Il secondo ROI è responsabile del rilevamento della pulizia delle gambe protoraciche e deve essere posizionato di fronte alla mosca. Per rilevare il movimento in queste regioni, i fotogrammi consecutivi sono sottratti. Le immagini differenziali risultanti sono poi sfocate con la mediana (raggio = 5 pixel), per ridurre il rumore. Sulla base di questa immagine sfocata, viene applicata una soglia sul numero di pixel non-zeros in ciascuna delle due ROI per estrarre le sequenze binarie degli attacchi di grooming e walking. Si noti che i movimenti delle gambe protoraciche osservati durante la camminata sono ignorati (cioè, la classificazione del grooming è subordinata alla classificazione della camminata). Un filtro di isteresi è stato poi applicato al filtro passa-basso sequenze comportamentali binarie e per rimuovere le transizioni che si verificano su troppo pochi fotogrammi per essere biologicamente plausibile. Esempio ROIs e annotazioni comportamentali sono illustrati nel filmato supplementare 6. Questi dati di comportamento è stato utilizzato in Fig. 2 come mostrato nel filmato supplementare 2. E ‘stato annotato utilizzando i seguenti parametri: soglia per camminare = 400, soglia per grooming = 5, lunghezza isteresi per camminare = 8, lunghezza isteresi per grooming = 10.
Per Fig. 2b, c, abbiamo usato la regressione lineare per trovare regioni nel VNC associato sia a piedi o grooming. Regressori Xw e Xg (per camminare e grooming, rispettivamente) sono stati costruiti dalle due sequenze comportamentali, Sw e Sg, utilizzando Eq. (5) mediante convoluzione con un decadimento esponenziale del segnale di calcio Risposta all’impulso (CIR) derivato dalla costante di tempo misurata per GCaMP6s (t½ = 1.1448 s)19.
Le funzioni target erano tracce ∆F/F in pixel, dove ∆F = Ft – F. Ft è la fluorescenza al tempo, t. F è un segnale di fluorescenza di base misurato come il valore medio del pixel per le prime dieci immagini sequenziali di GCaMP6s in cui non è stata osservata attività cellulare (cioè, fluorescenza GCaMP6s minima e invariata).
I pesi dei regressori sono stati calcolati usando l’Eq. (6).
dove y è la traccia ∆F/F pixel-wise.
La figura 2b, c mostra le mappe di calore dei pesi dei regressori, ww per il camminare e wg per il grooming, normalizzati ai loro rispettivi massimi. ROI 1 è stato scelto come una regione della mappa di calore con un alto peso per grooming ma un basso peso per camminare. La ROI 2 è stata scelta come la posizione spaziale con il più alto valore di ww. Ogni ROI comprende una regione con un raggio di 15 pixel.
Per identificare i dati di imaging neurale sparse processo (Figg. 3-5), ROI sono stati selezionati utilizzando script Python personalizzato che dipendeva da OpenCV e Numpy librerie. Per fare questo, un quadro di riferimento è stato selezionato per il quale il software ha identificato tutti i potenziali ROI. Per fare questo, l’immagine GCaMP6s è stata lisciata per ridurre il rumore di fondo e poi una soglia del filtro Otsu è stata applicata all’immagine. Un fattore di erosione è stato poi applicato a tutti gli oggetti rilevati all’interno dell’immagine. I contorni di tutti gli oggetti rilevati sono stati poi presentati all’utente per la selezione manuale. Una volta che questi ROI di riferimento sono stati selezionati per i neuroni sinistro e destro, abbiamo usato un algoritmo di registrazione dell’immagine cross-correlazione-based48 per identificare il più probabile ROI sinistra e destra per ogni fotogramma dell’immagine sulla base di quelli selezionati manualmente sul telaio di riferimento. Un secondo script è stato utilizzato per verificare manualmente ROI selezionati automaticamente e, se errato, per visualizzare tutti i potenziali ROI all’interno del telaio per la selezione manuale. Se i valori di erosione producevano ROI malformati, un altro script è stato utilizzato per posizionare manualmente ROI ellittici di orientamento arbitrario su un dato frame. Infine, le immagini binarie ROI sono stati utilizzati come una maschera di immagine per estrarre i segnali di fluorescenza media dalle immagini originali GCaMP6s o tdTomato. Questi segnali sono stati riportati come %∆R / R come in rif. 49 per ridurre gli effetti del movimento sulle nostre misure. A causa dell’assenza di stimoli, la linea di base R è stato calcolato come il rapporto minimo di GCaMP6s/tdTomato all’interno di un bin 2.5 s.
Per rilevare gli aumenti transitori di attività, abbiamo sviluppato un algoritmo basato in parte su rif. 50. Abbiamo prima determinato quando la prima derivata del segnale %∆R/R ha attraversato una soglia, che è stata determinata esaminando tutti i valori di derivazione per una data classe di neuroni (MDN, MAN, o A1). Abbiamo ragionato sul fatto che i valori di soglia dovrebbero essere caratteristici e potenzialmente diversi per ogni tipo di neurone perché le dinamiche di fluorescenza sono legate a proprietà fisiologiche intrinseche che possono differire tra le classi di neuroni ma non tra gli esperimenti per una singola classe. Abbiamo impostato questa soglia come il 97.5° percentile per MDNs e dMANs e il 90° percentile per i neuroni A1. Un valore di soglia più basso è stato selezionato per i neuroni A1 perché molti più transienti di fluorescenza sono stati osservati in tracce A1. Questi transienti sarebbero stati trascurati utilizzando una soglia 97.5th percentile. Per identificare l’inizio degli aumenti di fluorescenza abbiamo trovato il punto temporale precedente più vicino in cui la derivata ha attraversato lo zero. Questo attraversamento dello zero è considerato il punto temporale di un “evento” associato all’aumento di fluorescenza identificato. Gli eventi rilevati vicini l’uno all’altro senza alcun incrocio dello zero della derivata sono stati compressi in un evento associato al primo punto temporale. Ci sono stati ~ 10 esperimenti separati per animale. Eventi nel primo e ultimo 10 s di ogni esperimento non sono stati considerati in quanto la finestra di presentazione dei dati comprendeva 10 s prima e 10 s dopo ogni evento.
Perché sinistra e destra MDN e attività dMAN fortemente covariati (Fig. 5 supplementare), un ulteriore passo è stato eseguito per la rilevazione degli eventi: se gli eventi sono stati rilevati in entrambi i neuroni di sinistra e destra entro 2 s di un altro, entrambi gli eventi sono stati mantenuti; altrimenti, un evento identificato per il neurone A (ad esempio, MDN sinistro) e non per il neurone B (ad esempio, MDN destro) è stato aggiunto anche alla libreria di eventi del neurone B.
Al contrario, le attività A1 sinistra e destra non covariavano fortemente. Pertanto, gli eventi sono stati associati a uno e non all’altro neurone. Per fare questo, se un evento è stato rilevato per entrambi i neuroni A1 sinistra e destra entro una finestra temporale di 0,25 s, nessuno dei due eventi sono stati utilizzati per l’analisi.
%∆R / R e tracce di flusso ottico collegati a ciascun evento sono stati allineati impostando i punti di tempo di evento a 0 s. Abbiamo poi calcolato la media e bootstrapped intervalli di confidenza al 95% per queste tracce allineati utilizzando la libreria Python Seaborn. Flusso ottico e %∆R / R misure sono state sottocampionate a 500 valori s-1 per questa analisi. Per aumentare la chiarezza, %∆R / R tracce sono state baseline-sottratto per renderli zero al momento dell’evento nei pannelli di riepilogo (Figs. 3d, 4d e 5d, e). Il controllo, i dati mischiati (tracce grigie) sono stati calcolati assegnando invece punti di tempo casuali al posto di eventi reali e identificati. Questi punti di tempo casuali sono stati trattati come eventi reali e la loro media e bootstrapped intervalli di confidenza al 95% sono stati calcolati e tracciati per il confronto.
L’analisi della covarianza (Fig. 5 supplementare) è stata eseguita utilizzando uno script personalizzato Python che dipendeva dal Matplotlib e Numpy librerie. Grafici di dispersione sono stati calcolati per confrontare il neurone sinistro e destro %∆R / R valori da tutti gli esperimenti per ogni mosca separatamente. Valori r di Pearson sono riportati come media ± deviazione standard.
Event-correlati comportamenti (filmati supplementari 8, 10, 12 e 13) sono stati selezionati manualmente da eventi rilevati automaticamente come descritto sopra. Per dMANs, gli eventi sono stati selezionati tra quelli che hanno massimizzato la differenza nelle rotazioni palla anteriore-posteriore tra 1 s prima e 2 s dopo l’evento. Per MDNs, gli eventi sono stati selezionati tra quelli che ha minimizzato anteriore-posteriore rotazioni palla fino a 2 s dopo l’evento. Per i neuroni A1, gli eventi sono stati selezionati tra quelli che hanno massimizzato le rotazioni palla imbardata media (positivo per gli esempi neurone A1 sinistra e negativo per gli esempi neurone A1 destra) per fino a 2 s dopo gli eventi.
In Fig. 8 supplementare, le risposte alla stimolazione laser nel vicino infrarosso sono stati mediati attraverso 10 prove per ogni animale. Flusso ottico è stato downsampled a 500 valori s-1. Intervalli di confidenza medi e 95% bootstrapped per le tracce di flusso ottico sono stati misurati e tracciati utilizzando la libreria Python Seaborn. La libreria Python Scipy è stato utilizzato per eseguire Friedman e Mann-Whitney U-test.