Il test clonogenico è stato utilizzato in numerosi studi per quantificare la crescita clonogenica e la sua abrogazione da stimoli citotossici, tra cui radiazioni, farmaci chemioterapici, e/o agenti molecolarmente mirati, in vitro. L’attuale procedura standard per determinare le frazioni di sopravvivenza si basa sul presupposto che la crescita clonogenica nelle colture cellulari trattate può essere normalizzata ai controlli non trattati attraverso la divisione per una linea cellulare specifica, costante PE.
Qui dimostriamo, tuttavia, che questo non è universalmente applicabile. Al contrario, i nostri dati indicano chiaramente che la correlazione tra il numero di cellule seminate in un piatto di coltura e il numero di colonie ottenute è lungi dall’essere sempre lineare. Per le linee cellulari con comportamento cooperativo, l’analisi basata su PE dei dati di sopravvivenza clonogenica ha dato risultati con grandi o enormi errori intrinseci al test. Anche se solo i piatti di coltura con un numero ragionevole di colonie (C = da 5 a 100) sono stati utilizzati per l’analisi, le frazioni di sopravvivenza clonogenica ad una data dose differivano di molto più di un ordine di grandezza per le linee cellulari con alti gradi di cooperazione cellulare. Da notare che virtualmente qualsiasi curva di sopravvivenza (ripida o piatta, moderatamente o fortemente curva, lineare, quadratica o irregolare) può essere derivata da questa gamma di risultati calcolati dal dato set di dati, un’osservazione che potrebbe essere di particolare importanza per i biologi delle radiazioni.
Insieme, i nostri dati mostrano che l’analisi convenzionale basata su PE dei dati di sopravvivenza clonogenica funziona in modo inappropriato non appena la cooperazione cellulare si verifica in una o più condizioni all’interno di un esperimento, e i risultati di sopravvivenza estratti varieranno all’interno di una gamma insoddisfacente. In particolare, i risultati saranno pesantemente distorti se solo una o poche densità cellulari simili sono placcate. Questa pratica genera errori intrinseci al test che sono una conseguenza diretta delle densità cellulari scelte e quindi non sono suscettibili di analisi statistiche degli errori. Per le linee cellulari che crescono in modo cooperativo, le nostre osservazioni possono in parte spiegare le incongruenze segnalate tra i test, tra i ricercatori e tra i laboratori dei dati di risposta al trattamento. Una meta-analisi dei dati del saggio di formazione di colonie A549 supporta ulteriormente questa ipotesi: All’interno di un pannello di 156 studi diversi, Nuryadi et al. hanno riportato valori SF4 per questa specifica linea cellulare che vanno dal 5 al 90% con un intervallo interquartile SF4 di oltre il 25%. Anche se diversi altri parametri possono certamente influenzare i dati di risposta al trattamento, concludiamo dai nostri dati che la cooperazione cellulare è un fattore importante che spiega la variabilità tra gli studi. Poiché anche piccole differenze nelle frazioni di sopravvivenza clonogenica possono incoraggiare i ricercatori a postulare e studiare nuove ipotesi scientifiche che potrebbero alla fine essere basate su una falsa precisione, abbiamo sviluppato un nuovo approccio di analisi che è meno suscettibile all’impatto della densità cellulare, soprattutto ma non solo per le linee cellulari in crescita cooperativa. Questo metodo tiene conto delle relazioni non lineari tra il numero di cellule seminate e il numero di colonie ottenuto segnando i piatti di coltura con un’ampia gamma di numeri di cellule seminate per tutte le condizioni di trattamento.
Matematicamente, il nostro approccio utilizza la regressione di potenza e l’interpolazione dei numeri di colonie abbinati a diverse dosi di irradiazione. Applicato allo stesso set di dati che è stato utilizzato per i calcoli basati su PE, ha fornito risultati chiaramente più stabili e indipendenti dalla densità cellulare. I lettori attenti possono aver notato che i calcoli della frazione di sopravvivenza eseguiti secondo il metodo qui presentato, si basano esclusivamente sul coefficiente a e l’esponente b estratti dalla regressione di potenza. Anche se questo ovviamente compensa gli effetti della cooperazione cellulare, porta un’altra qualità di errore che deriva dall’imprecisione della regressione e che non può essere comparata quantitativamente alla simile qualità di errore nei calcoli delle frazioni di sopravvivenza basati su PE. Di conseguenza, questo errore dovrebbe essere minimizzato assicurando un attento disegno sperimentale con un numero sufficiente di repliche indipendenti. Inoltre, i calcoli delle frazioni di sopravvivenza dovrebbero essere eseguiti solo con risultati di regressione di potenza di prestazioni adeguate, come indicato dal coefficiente di regressione R.
Il nostro approccio matematico sostituisce fondamentalmente i calcoli di sopravvivenza clonogenica basati su PE con la domanda:
Quante volte più cellule devono essere seminate in un piatto di coltura trattato per produrre lo stesso numero di colonie come in un piatto di controllo?
L’esponente b è di particolare importanza a questo proposito. Esso indica se la correlazione tra il numero di cellule seminate e il numero di colonie contate è lineare (b ≈ 1) o no. Alti valori di b, come quelli ottenuti per le cellule BT20 e SKLU1, indicano che la crescita delle cellule in vitro è decelerata (o completamente abrogata) se il volume del mezzo di coltura per cellula è aumentato – sia con l’uso di grandi volumi di saggio o la riduzione del numero di cellule seminate. Si dovrebbe sottolineare che i valori b non sono affatto specifici per una certa linea cellulare, ma piuttosto una conseguenza del mezzo di coltura cellulare scelto, diversi parametri di incubazione del saggio, e la procedura sperimentale che include praticamente qualsiasi aspetto che potrebbe influenzare la crescita clonale delle cellule che sono in una situazione di stress estremo quando vengono piantate come cellule singole, come la formulazione del mezzo, l’integrazione con nutrienti e fattori di crescita, i metodi utilizzati per la separazione delle cellule, il plasticware, ecc. Per esempio, l’uso di mezzi condizionati da cellule BT20 quasi confluenti ha fortemente attenuato il comportamento cooperativo delle cellule singole BT20, mentre questa procedura non ha avuto alcun impatto sulla crescita clonogenica delle cellule MDA-MB231 in crescita non cooperativa. Inoltre, il tempo di raddoppio delle cellule BT20 cooperative dipendeva sia dal tempo di incubazione del test che dalla densità delle cellule nel pozzetto, dando così una spiegazione biologica evidente per le frazioni di sopravvivenza clonogenica imprecise ottenute dai calcoli basati sul PE: Il tasso di crescita di un cluster di cellule proliferanti può essere semplicemente troppo lento per raggiungere la soglia di 50 cellule per colonia entro il tempo di incubazione del saggio. Quindi, l’apparente “non clonalità” di un cluster di ad esempio 35 cellule lentamente proliferanti al punto di arresto del tempo è semplicemente una conseguenza inevitabile del tempo di incubazione del test che è – almeno in una certa misura – scelto arbitrariamente. In questo contesto, abbiamo inoltre analizzato l’impatto del tempo di incubazione sulle frazioni di sopravvivenza clonogenica ottenute e abbiamo osservato che è insufficiente per determinare il punto di arresto del tempo dall’ispezione dei soli piatti di controllo come suggerito da altri: la fine prematura del periodo di incubazione può portare a frazioni di sopravvivenza eccessivamente basse su piastre con un trattamento più aggressivo in cui la riparazione dei danni prima di continuare la crescita cellulare richiede un tempo supplementare.
Importante, i nostri dati sono pienamente in linea con le scoperte seminali dei ricercatori pionieri delle colture cellulari negli anni ’40 e ’50 e riflettono semplicemente un fenomeno che a quel tempo era oggetto di ampie indagini. Puck e colleghi furono i primi a pubblicare una curva di sopravvivenza di singole cellule irradiate nel 1956. Tuttavia, la più grande sfida scientifica a questo risultato fondamentale era un problema allora irrisolto della coltura di cellule di mammiferi: Le linee cellulari smettevano di crescere in vitro non appena le cellule venivano piastrate a bassa densità. Un tentativo di superare questo problema fu fatto nel 1948 da Sanford e altri, che riuscirono a far crescere colonie di fibroblasti derivati da singole cellule in piccoli capillari dove la diffusione dei fattori derivati dalle cellule nel mezzo era fortemente ridotta, permettendo così una sufficiente stimolazione autocrina della crescita. Hanno identificato l’importanza del precondizionamento del mezzo di coltura da parte delle cellule coltivate e hanno concluso che un mezzo di coltura cellulare sufficiente a consentire la crescita infinita di colonie di cellule ad alta densità è in realtà “tutt’altro che ottimale per la crescita di una singola cellula”. In linea con questo, Earle et al. descrissero che la placcatura del rispettivo tipo di cellule a densità molto bassa portava alla morte delle cellule, e questo lavoro costituì la base per la prima pubblicazione sulla crescita clonogenica di cellule di mammiferi in vitro da Puck e Marcus nel 1955. Ispirati dalla necessità di un mezzo di coltura condizionato per facilitare la crescita delle singole cellule, hanno usato un sistema di co-cultura di singole cellule HeLa e uno strato di cellule feeder dello stesso tipo pesantemente irradiate. In accordo con gli studi precedenti, hanno concluso che l’inibizione della crescita delle cellule singole in grandi volumi di saggio era dovuta alla “perdita di un fattore diffusibile di breve durata”. Nelle pubblicazioni successive, come quella con la prima curva di sopravvivenza di cellule irradiate di mammiferi, Puck e colleghi hanno spesso omesso l’uso di strati alimentatori, dal momento che avevano sviluppato tecniche di coltura avanzate che permettevano la crescita monocellulare con 100% PE senza integrazione del fattore di crescita da parte delle cellule alimentatrici. Hanno affermato che i protocolli di lavaggio e tripsinizzazione accurati erano essenziali a questo proposito e hanno coniato il termine “azione cooperativa” per descrivere che le cellule in un piatto di coltura possono differire per quanto riguarda il genotipo così come lo stato fisiologico. I nostri risultati ricapitolano queste osservazioni: All’interno di un pannello di 50 linee cellulari di cancro, abbiamo osservato che la crescita subottimale di singole cellule in moderni mezzi di coltura standardizzati integrati con FCS è ancora un fenomeno molto comune, come può essere dedotto dalla constatazione che più della metà delle linee cellulari ha mostrato un comportamento di crescita cooperativa. Quindi, se si trovano PE subottimali per una certa linea cellulare, è probabile che il test clonogenico rilevi simultaneamente sia l’influenza del trattamento di interesse che l’impatto della cooperazione cellulare. Non era nello scopo di questo studio identificare i fattori specifici di supporto alla crescita che potrebbero influenzare il PE delle linee cellulari analizzate. Tuttavia, ipotizziamo che le condizioni di crescita subottimali per le singole cellule di una data linea cellulare possono derivare da parametri molto diversi, come basse concentrazioni di fattori di crescita classici e/o ormoni (ad esempio, fattore di crescita epidermico o estrogeni), ma anche vari metaboliti a basso e alto peso molecolare per i quali almeno una frazione delle singole cellule mostra auxotrofia. Inoltre, l’integrazione dei nutrienti delle singole cellule in un piatto di coltura sarà probabilmente influenzata dai parametri fisico-chimici del mezzo circostante e del materiale plastico, compreso il grado di legame proteico dei rispettivi fattori auxotrofici o il loro adsorbimento alla superficie plastica. In teoria, questo problema potrebbe essere affrontato adottando misure che ripristinano il PE massimo in condizioni di bassa densità in modo da (ri)stabilire una correlazione lineare tra S e C (b = 1). Le raccomandazioni di Puck per l’uso di cellule feeder, mezzi condizionati, e/o l’incorporazione di singole cellule in agar morbido può essere sufficiente per raggiungere questo obiettivo per linee cellulari selezionate e dovrebbe aumentare di conseguenza la robustezza dei calcoli basati su PE. Tuttavia, è ovvio che può essere più che impegnativo perfezionare e standardizzare le condizioni del test in modo che i tassi di sopravvivenza e crescita delle singole cellule siano ottimali per ogni singolo tipo di cellula di interesse. Abbiamo deciso di accettare condizioni di saggio subottimali per la crescita delle singole cellule e invece sviluppato un metodo computazionale per l’analisi dei dati di sopravvivenza clonogenica che tiene conto di questo fenomeno ben descritto. Ovviamente, il nostro approccio utilizzando la regressione di potenza e l’interpolazione era al di là delle capacità tecniche degli anni ’50 quando i dati di sopravvivenza sono stati adattati a occhio. Tuttavia, in qualche modo la rilevanza della cooperazione cellulare è uscita di scena nei decenni successivi. Anche se alcuni rapporti sulla non linearità nei saggi di formazione delle colonie sono stati riportati nel corso del tempo, le prestazioni limitate delle analisi basate su PE non sono state affrontate.
Interessante, questi studi hanno riportato un aumento meno che lineare del numero di colonie con un numero crescente di cellule seminate per alcuni tipi di cellule in condizioni specifiche. In accordo con questo, per alcune linee cellulari nel nostro pannello abbiamo anche ottenuto valori b leggermente inferiori a 1,0. Tre diversi scenari possono spiegare questa osservazione, di cui due sono dovuti ad artefatti metodologici: In primo luogo, b-valori leggermente al di sotto 1.0 può derivare dal conteggio di pozzetti con un gran numero di colonie overgrown dove piccole colonie sono trascurati dal ricercatore (vedi pozzetti contrassegnati con “nd” in Fig. 1a). In secondo luogo, la crescita cellulare di piatti con un alto numero di cellule può essere inibita in fasi piuttosto precoci a causa di un rapido declino della concentrazione di sostanze nutritive con conseguente aborto delle colonie. Una terza opzione – biologicamente meno intuitiva – è il comportamento competitivo della crescita cellulare, per esempio a causa della secrezione di fattori inibitori della crescita. È importante notare che ognuno di questi fenomeni viene considerato dall’approccio di regressione e interpolazione, perché considera qualsiasi deviazione dalla linearità come riflesso dal valore b.
Inoltre, è notevole che i valori b di varie linee cellulari per condizioni non trattate rispetto a quelle irradiate non sono identici. Nella maggior parte di questi casi, i valori b delle cellule irradiate tendono ad essere più alti dei rispettivi valori b dei controlli non trattati, indicando che la cooperazione cellulare aumenta con l’irradiazione. Di conseguenza, la gamma di valori della frazione di sopravvivenza ottenuti per C = da 5 a 100 colonie diventa più ampia che in caso di valori b quasi identici (vedi linee cellulari HCC1806 e A549). Questo implica che non è tecnicamente possibile estrarre valori di sopravvivenza più precisi per mezzo della procedura del test clonogenico, a meno che un numero fisso di colonie (C) sia stato selezionato per l’analisi. Inoltre, le linee cellulari con valori b estremamente alti per le cellule trattate possono essere di particolare interesse per quanto riguarda gli studi di resistenza alla terapia. Per esempio, il fattore(i) di sopravvivenza indotto(i) dalle radiazioni secreto(i) da un certo tipo di cellule potrebbe essere identificato a causa di un valore b corrispondentemente alto.
In sintesi, i nostri dati mostrano la necessità di analizzare attentamente i dati da esperimenti di formazione di colonie e di considerare l’impatto sottostimato della cooperazione cellulare sui calcoli della frazione di sopravvivenza. Questo può aumentare notevolmente l’affidabilità del test clonogenico e la resistenza di qualsiasi ipotesi basata su di esso.