Il polimero antimicrobico PHMB entra nelle cellule e condensa selettivamente i cromosomi batterici

Attività della membrana cellulare batterica del PHMB

Se l’attività antibatterica del PHMB (Fig. 1a) è dovuta alla rottura della membrana, come ampiamente riportato6,7,8,9,10, ci si aspetterebbe di permeabilitare le barriere delle cellule batteriche a concentrazioni inibitorie della crescita e sub crescita. Per testare questo modello, abbiamo innanzitutto stabilito le concentrazioni minime inibitorie (MIC) e le proprietà time kill del PHMB contro Escherichia coli (ceppi K-12 e MG1655) e Salmonella enterica serovar Typhimurium (ceppo LT2). Come riportato in precedenza2,4, il PHMB ha mostrato potenti proprietà inibitorie e cicide (Tabella 2 supplementare e Fig. 1 supplementare). Inoltre, dopo il trattamento, abbiamo esaminato le cellule utilizzando la microscopia ottica. Inaspettatamente, le concentrazioni inibitorie della crescita di PHMB non hanno liso le cellule, come monitorato dalla microscopia a campo chiaro. Per valutare i danni alla barriera cellulare che potrebbero essere invisibili alla microscopia, le colture di E. coli K-12 sono state coltivate a metà della fase log, trattate con PHMB in presenza della sonda fluorescente di integrità della membrana SYTOX®Green e poi monitorate usando la fluorimetria. Questa sonda è utile come indicatore di danni alla membrana, perché è normalmente esclusa dai batteri intatti e la sua resa quantica di fluorescenza aumenta con il legame al DNA. Pertanto, i batteri intatti sono tenuti a visualizzare bassa fluorescenza e la fluorescenza dovrebbe aumentare dopo danni barriera cellulare 16. Come previsto, appena cresciuto E. coli culture visualizzati grandi aumenti di fluorescenza dopo il trattamento con il noto parete cellulare distruttore polimixina B o trattamento termico (Fig. 1b). Inaspettatamente, il trattamento con PHMB ha portato a livelli relativamente più bassi di fluorescenza. Più sorprendentemente, concentrazioni più elevate di PHMB hanno portato a una fluorescenza a livelli di fondo. Queste osservazioni non sono compatibili con la distruzione della membrana come principale meccanismo antibatterico e quindi hanno sollevato ulteriori dubbi sul modello stabilito.

PHMB entra nei batteri

Se l’obiettivo primario di PHMB non sono le barriere cellulari batteriche, o non esclusivamente le barriere cellulari, allora probabilmente agisce internamente e questo richiederebbe l’ingresso nelle cellule. Per testare l’ingresso batterico, abbiamo sintetizzato un coniugato PHMB-FITC (Fig. 2a,b) e valutato l’assorbimento in batteri Gram-positivi (Staphylococcus aureus), Gram-negativi (Escherichia coli e Salmonella enterica serovar Typhimurium) e acido-resistenti (Mycobacterium smegmatis) utilizzando la microscopia e la citometria a flusso (Fig. 1c, Fig. 3 supplementare). Una forte fluorescenza verde associata alle cellule è stata osservata in tutte le specie testate (Fig. 1c). Per esaminare più a fondo la localizzazione delle cellule, il batterio di grandi dimensioni Bacillus megaterium è stato trattato con PHMB-FITC, controcolorato con agglutinina di germe di grano localizzante la membrana (WGA-red) ed esaminato mediante microscopia a fluorescenza (Fig. 1d). L’ingresso nelle cellule è stato osservato sia in cellule vive che fisse e un’analisi del profilo di intensità della fluorescenza mostra che il PHMB-FITC si è localizzato all’interno del citoplasma, senza accumulo alla barriera cellulare (Fig. 1e).

L’osservazione che il PHMB entra nelle cellule a basse concentrazioni di microgrammi/mL suggerisce che può entrare nelle cellule vive. Per indagare se l’assorbimento del PHMB nei batteri richiede un metabolismo energetico, le colture di E. coli in fase mid-log sono state incubate a 37 °C o a 4 °C per 2 ore per ridurre i livelli di ATP cellulare. Successivamente, le cellule sono state trattate con PHMB-FITC (0-6 μg/ml) e ulteriormente incubate in ghiaccio per 2 ore. La fluorescenza PHMB-FITC associata alle cellule è stata quantificata con la fluorimetria (Fig. 3b supplementare). Le cellule tenute a 4 °C hanno mostrato un ridotto assorbimento di PHMB-FITC rispetto alle cellule incubate a 37 °C, coerente con un processo di assorbimento cellulare dipendente dall’energia. Inoltre, verde fluorescente e batteri mobili sono stati osservati in diversi punti di tempo durante il trattamento PHMB (Fig. 3 supplementare). Poiché la motilità batterica è energia dipendente 17, l’evidenza indica che PHMB-FITC entra cellule metabolicamente attive. Pertanto, PHMB entra batteri diversi e l’ingresso è stato osservato in cellule mobili.

PHMB arresta divisione cellulare e condensa cromosomi batterici

Esaminando E. coli al microscopio, abbiamo notato che le cellule trattate con PHMB spesso visualizzato una morfologia allungata, che può essere caratteristica di inibizione della divisione cellulare (Fig. 2a). Per misurare gli effetti del PHMB sull’allungamento delle cellule, abbiamo titolato il PHMB in colture in crescita di E. coli del ceppo SS996 (vide infra) e misurato la lunghezza delle cellule. A concentrazioni inibitorie della crescita, più dell’80% delle cellule si sono allungate (Fig. 2b; Tabella supplementare 2). Inoltre, abbiamo osservato che E. coli trattati con concentrazioni inibitorie della crescita di PHMB o PHMB-FITC seguita da DAPI-colorazione visualizzato blu foci fluorescenti vicino al centro della cella (Fig. 2c). Queste strutture assomigliavano nucleoidi18. Per facilitare la visualizzazione dei focolai di DNA, abbiamo generato filamentose / popolazioni multinucleate di E. coli inibendo la divisione cellulare attraverso il silenziamento RNA del gene essenziale divisione cellulare ftsZ19. Il silenziamento dell’RNA è stato selezionato per questo esperimento perché permette la repressione specifica e controllabile della traduzione dei trascritti del gene essenziale20. I geni che sono essenziali per la crescita non possono essere eliminati con metodi di interruzione del genoma, in quanto ciò si tradurrebbe in ceppi non vitali. In assenza di PHMB, le cellule filamentose hanno mostrato una colorazione uniforme di DAPI, mentre le cellule trattate con PHMB hanno mostrato “stringhe di perline” blu (Fig. 2d). Allo stesso modo, nei batteri Gram-positivi di grandi dimensioni B. megaterium abbiamo osservato foci colorati con DAPI dopo il trattamento con PHMB (Fig. 2e). Questi risultati, in entrambe le specie Gram-negative e Gram-positive, mostrano che l’esposizione a PHMB porta a cromosomi condensati all’interno dei batteri.

Gli effetti antibatterici mediati dal PHMB sono indipendenti dalle vie di risposta allo stress

L’allungamento delle cellule e la condensazione dei cromosomi sono morfologie caratteristiche che sono spesso associate alla risposta SOS batterica21,22. Pertanto, abbiamo ritenuto che questi effetti potessero coinvolgere questa risposta. Tuttavia, nel caso degli effetti mediati dal PHMB, una risposta SOS sembrava improbabile. In primo luogo, la risposta SOS è tipicamente associata a danni al DNA e non ci sono prove di effetti genotossici o epigenetici mediati dal PHMB23. In secondo luogo, la condensazione osservata dopo il silenziamento di ftsZ e il trattamento con PHMB si è verificata in un ceppo recA- (TOP10), che è un mutante di risposta SOS. Tuttavia, i meccanismi antimicrobici sono notoriamente difficili da decifrare e possono coinvolgere più meccanismi. Pertanto, abbiamo deciso di valutare il possibile coinvolgimento di una risposta SOS e di altre vie di risposta allo stress utilizzando un ceppo SOS reporter e un pannello di mutanti della via di risposta allo stress di E. coli.

Per verificare se gli effetti mediati dal PHMB sull’allungamento cellulare e la condensazione cromosomica sono alterati da mutazioni della via di risposta SOS, abbiamo valutato le risposte morfologiche in tre ceppi mutanti di E. coli. Il ceppo SS996 è in grado di avviare una risposta SOS, ma a causa di una mutazione sulB la risposta non porta all’inibizione della divisione cellulare. Questo perché SS996 ha un allele mutante di ftsZ (sulB103), il cui prodotto è insensibile all’azione dell’inibitore della divisione cellulare indotta da SOS SulA24. Il ceppo JW2669 non produce RecA funzionale e quindi è carente di SOS. Il ceppo AB2474 ha una mutazione nel repressore LexA che lo rende non-cleavable da RecA e quindi non è in grado di indurre una risposta SOS (ulteriori dettagli ceppo sono riportati in Fig. 3 e informazioni supplementari Tabella 3). Le colture in fase mid-log sono state trattate con PHMB, colorate con DAPI e osservate al microscopio a fluorescenza. Come osservato con E. coli K-12, i ceppi mutanti visualizzato morfologie allungate e cromosomi condensati dopo il trattamento PHMB (Fig. 3a). Pertanto, gli effetti della divisione cellulare e della struttura cromosomica mediati dal PHMB si verificano indipendentemente da una risposta SOS programmata.

Per misurare più direttamente se PHMB induce una risposta SOS, abbiamo usato il ceppo E. coli SS996, che è un ceppo reporter che contiene una risposta cromosomica SOS sulAp-gfp/sistema reporter24,25. Se una risposta SOS è causato da PHMB, quindi l’esposizione PHMB dovrebbe indurre l’espressione GFP in questo ceppo. Le colture di SS996 sono state trattate con PHMB per 18 ore e poi è stata misurata la fluorescenza verde. La mitomicina C, che danneggia il DNA, è stata inclusa come controllo positivo e il triclosan, che inibisce la biosintesi degli acidi grassi, è stato incluso come controllo negativo. Come previsto, la mitomicina C ha indotto un grande aumento dell’espressione GFP e il triclosan non ha indotto l’espressione GFP. In contrasto con la mitomicina C, PHMB non ha indotto l’espressione GFP, indicando che PHMB non induce una risposta SOS (Fig. 3b).

Abbiamo poi testato se i ceppi con risposte SOS difettose o deregolate differiscono nella suscettibilità a PHMB. Per testare gli effetti mediati da recA sulla suscettibilità, abbiamo usato un ceppo di E. coli privo di recA (JW2669) e un ceppo che sovraesprime recA all’aggiunta dell’induttore IPTG (ASKA JW2669) e abbiamo determinato i valori MIC. Né la delezione né la sovraespressione indotta di recA hanno alterato la suscettibilità al PHMB (Tabella 3 delle informazioni supplementari, righe ombreggiate in grigio scuro). Al contrario, il ceppo recA- era 2 volte più suscettibile alla risposta SOS che induce l’acido nalidixico e la sovraespressione recA ha ridotto la suscettibilità all’acido nalidixico 8 volte. Per testare gli effetti mediati da lexA sulla suscettibilità al PHMB, abbiamo usato il ceppo AB2474 lexA1(Ind-), che non è in grado di indurre una risposta SOS. Rispetto al genitore, AB2474 era 1 volta più suscettibile al PHMB e 1 volta meno suscettibile all’acido nalidixico (Tabella 3 supplementare, righe ombreggiate in grigio chiaro). Pertanto, nessuno dei mutanti di risposta SOS testati ha mostrato cambiamenti nella suscettibilità al PHMB che indicano il coinvolgimento di una risposta SOS.

Infine, abbiamo considerato se altre vie di risposta allo stress (non SOS) influenzano la suscettibilità al PHMB. Abbiamo testato una serie di noti mutanti di risposta allo stress di E. coli in parallelo con i loro genitori per la suscettibilità a PHMB. Nessuno dei mutanti ha mostrato cambiamenti nei valori MIC che suggeriscono un coinvolgimento funzionale di una qualsiasi delle vie di risposta allo stress (Tabella 3 supplementare). Pertanto, gli effetti antibatterici del PHMB si verificano indipendentemente dal pannello dei meccanismi di risposta allo stress testati.

PHMB condensa i cromosomi batterici in vitro

Se il PHMB condensa i cromosomi batterici all’interno delle cellule, ciò potrebbe avvenire tramite effetti diretti o indiretti sul DNA. Abbiamo sospettato effetti diretti, perché il PHMB ha dimostrato di legarsi a frammenti di DNA in vitro15. Abbiamo deciso di esaminare le proprietà di legame al DNA di PHMB usando il DNA cromosomico di E. coli isolato. Interazioni PHMB-DNA sono stati prima esaminati utilizzando un test di spostamento di mobilità elettroforetica (EMSA) e un test di esclusione del colore. Il PHMB è stato mescolato con il DNA cromosomico isolato da E. coli K-12 e le miscele sono state frazionate in gel di agarosio/TBE, seguite dalla colorazione del DNA con bromuro di etidio. PHMB: miscele di DNA con rapporti wt:wt di ≥0.5 ha mostrato una mobilità elettroforetica chiaramente ritardata, come indicato dalla ritenzione del DNA nel pozzetto (Fig. 4a). Risultati simili sono stati ottenuti per il PHMB-FITC. La mobilità ritardata e la ritenzione nei pozzetti è coerente con le interazioni stabili tra PHMB e DNA. Inoltre, i saggi EMSA hanno indicato una ridotta fluorescenza dell’etidio bromuro in presenza di PHMB o PHMB-FITC, suggerendo che all’etidio bromuro è stato impedito di legarsi al DNA a causa della formazione di complessi PHMB:DNA. Questa osservazione è stata ulteriormente investigata usando il colorante legante il DNA SYTOX®Green in un test di esclusione del colorante. In assenza di PHMB, SYTOX®Green ha legato il DNA isolato di E. coli, come indicato da un grande aumento della fluorescenza, rispetto all’aggiunta del solo colorante. Tuttavia, l’aggiunta preventiva di PHMB ha ridotto la fluorescenza >80% (Fig. 4b). Pertanto PHMB forma complessi con il DNA batterico in un modo che ritarda la mobilità elettroforetica e maschera l’accesso del DNA ai ligandi del DNA. I risultati di ognuno di questi esperimenti indicano che il PHMB si lega direttamente al DNA.

Per saperne di più su come il legame del PHMB al DNA influisce sulla struttura del DNA cromosomico, abbiamo usato metodi biofisici e microscopia. Combinazioni di PHMB e DNA cromosomico isolato di E. coli sono state esaminate mediante spettroscopia di dicroismo circolare (CD). Il PHMB da solo non ha mostrato uno spettro CD caratteristico, mentre il DNA cromosomico isolato ha mostrato uno spettro tipico del DNA con un’ellitticità massima positiva intorno a 260 nm, un cross over negativo a 252 nm e un trogolo negativo a circa 245 nm. Questo ci ha permesso di valutare i cambiamenti nello spettro CD del DNA in seguito all’aggiunta di PHMB. Miscele di PHMB e DNA visualizzato ellitticità ridotta a 260 nm, indicativo di modifiche strutturali al DNA su PHMB legame (Fig. 4c,d). Inoltre, la dispersione dinamica della luce (DLS) ha rivelato che PHMB legame ai risultati DNA nella formazione di nanoparticelle di circa 50-60 nm, con un basso indice di polidispersità (Supplementary Fig. 4a). Infine, la microscopia elettronica a trasmissione (TEM) e la microscopia a fluorescenza hanno anche indicato che il legame di PHMB al DNA porta alla formazione di nanoparticelle (Fig. 4b,c). Pertanto, questi risultati confermano i rapporti precedenti che il PHMB lega il DNA26 e rivelano che il PHMB lega il DNA cromosomico batterico isolato e può condensare i cromosomi in una popolazione a bassa polidispersità di nanoparticelle.

Gli effetti antibatterici del PHMB sono soppressi da un ligando dsDNA

I nostri risultati degli effetti del PHMB sui batteri non possono essere conciliati con il modello di distruzione della membrana per il meccanismo d’azione antibatterico primario del PHMB. Piuttosto proponiamo un nuovo modello, dove il PHMB entra nei batteri e poi condensa i cromosomi, come illustrato in Fig. 5a. Se corretto, il nuovo modello prevederebbe anche interazioni funzionali tra il PHMB e altri ligandi del DNA e questa idea ci ha fornito un modo per testare il modello. In breve, se questo modello fosse corretto, i leganti del DNA di piccolo peso molecolare dovrebbero sopprimere la potenza antibatterica del PHMB competendo per i siti di legame al DNA nei cromosomi. Per testare questa possibilità, sono state utilizzate combinazioni a coppie di PHMB e Hoechst 33258 in saggi di suscettibilità alla crescita. Hoechst 33258 è un ligando del DNA che si lega preferenzialmente al solco minore delle sequenze ricche di AT27 ed è permeabile alle cellule, rendendolo una scelta adatta per questo esperimento di competizione.

Le interazioni tra farmaci sono state calcolate come valori di indice di concentrazione inibitoria frazionale (FICI) utilizzando un pannello di specie batteriche divergenti. I valori FICI per PHMB:Hoechst erano significativamente più alti di quelli per PHMB combinato con uno dei due antibatterici non-DNA ligandi (Fig. 5b). Inoltre, i valori FICI per le combinazioni PHMB:Hoechst mostrano una correlazione positiva con il contenuto AT del cromosoma (Fig. 5c). In altre parole, gli effetti antimicrobici del PHMB dipendono dall’accesso al DNA all’interno delle cellule. In B. megaterium, gli effetti delle combinazioni PHMB:Hoechst sono stati sorprendenti, dove l’inibizione della crescita da parte del PHMB è stata soppressa utilizzando concentrazioni subinibitorie di Hoeschst 33258 (Fig. 5d). Pertanto, la piccola molecola DNA ligando Hoechst 33258 ha salvato i batteri da concentrazioni inibitorie di PHMB.

Queste interazioni farmacologiche a coppie rivelano che gli effetti antibatterici di PHMB si verificano principalmente attraverso il targeting del DNA nei batteri. Coerentemente con il profilo di cambiamento della permeabilità cellulare osservato per il PHMB (Fig. 1b), i risultati indicano anche la competizione tra il PHMB e un ligando del DNA per i siti di legame al DNA all’interno delle cellule. Pertanto, i risultati di esperimenti separati che coinvolgono due noti ligandi del DNA sono coerenti con il nostro nuovo modello per l’attività del PHMB.

PHMB entra nelle cellule dei mammiferi ma è escluso dai nuclei

Il modello prevalente per l’attività del PHMB sostiene che il PHMB uccide i batteri attraverso il danno alla membrana batterica e il polimero non interagisce con le membrane cellulari dei mammiferi (vedi sopra). Tuttavia, date le inaspettate proprietà di ingresso nelle cellule batteriche del PHMB e le nostre recenti osservazioni che il PHMB entra nei macrofagi in coltura28 e nei cheratinociti29, abbiamo deciso di valutare direttamente la sua capacità di entrare in un pannello di cellule di mammiferi. Il PHMB-FITC è stato aggiunto a diverse linee cellulari di mammiferi e a fibroblasti primari e l’assorbimento è stato valutato mediante microscopia a fluorescenza e citometria a flusso. Abbiamo osservato un chiaro assorbimento in tutti i tipi di cellule testate (Fig. 6a,b). Inoltre, queste condizioni non hanno portato alla rottura dell’integrità della membrana cellulare dei mammiferi (Fig. 5a supplementare). Un’attenta ispezione delle immagini al microscopio rivela che il PHMB-FITC era contenuto all’interno di vescicole ed escluso dai nuclei (Fig. 6a). Se è vero che gli endosomi intrappolano PHMB, allora il rilascio nel citoplasma dovrebbe de-quench PHMB-FITC e portare ad un aumento della fluorescenza. Questo perché la fluorescenza FITC è spenta a basso pH e il pH endosomiale tardivo è <630, mentre il pH citoplasmatico è 7,4. Abbiamo osservato che l’aggiunta di clorochina, un agente osmolitico/buffering31, ha aumentato la fluorescenza di PHMB-FITC cellule trattate (Fig. 6c), coerente con polimero intrappolamento all’interno endosomi. Pertanto, il PHMB entra efficacemente nelle cellule dei mammiferi, ma è intrappolato all’interno degli endosomi, il che sembra limitare l’ingresso nei nuclei.