I criptocromi

Gli orologi biologici circadiani sono oscillatori biochimici che vanno in ciclo ogni 24 ore circa e che possono essere resettati (trascinati) dall’esposizione alla luce e ad altri segnali ambientali. Negli animali c’è un oscillatore centrale nel cervello che controlla il comportamento circadiano dell’intero organismo, così come oscillatori periferici in alcuni tessuti. L’oscillazione deriva da un ciclo di feedback trascrizionale che coinvolge una serie di fattori di trascrizione dell’orologio, tra cui il tempo (Tim), il periodo (Per), l’orologio (Clk) e Bmal1, nonché i criptocromi. I criptocromi sono espressi ubiquitariamente negli organi e nei tessuti di tutti gli organismi, e sono generalmente proteine nucleari che regolano l’espressione genica. I criptocromi animali più studiati sono il criptocromo Cry di Drosophila e i criptocromi Cry1 e Cry2 del topo, e anche i due criptocromi CRY1 e CRY2 dell’Arabidopsis sono stati ampiamente studiati.

Criptocromi di Drosophilac

Drosophila Cry è una proteina prevalentemente nucleare che media la regolazione dell’orologio circadiano dalla luce, sebbene possa essere trovata anche nel citosol. Regola l’orologio circadiano interagendo direttamente con la proteina Tim per sopprimere il ciclo di feedback negativo dell’orologio (Figura 3a). La luce stimola l’interazione Cry-Tim, che promuove l’ubiquitinazione e la degradazione proteosoma-dipendente di Tim e reprime la formazione dell’eterodimero Per-Tim. L’inibizione di un eterodimero delle proteine Clock e Cycle da parte dell’eterodimero Per-Tim viene così rilasciata e la fase dell’oscillazione circadiana viene resettata (Figura 3a). Il criptocromo non è apparentemente l’unico fotorecettore che trascina l’orologio circadiano in Drosophila, tuttavia. La ritmicità comportamentale della mosca crybmutant, che manca della funzione Cry, può comunque essere trascinata in risposta alla luce, a meno che la trasduzione del segnale da parte del pigmento visivo sia anch’essa eliminata. Oltre al suo ruolo come fotorecettore per il trascinamento dell’oscillatore centrale di Drosophila, Cry ha anche un ruolo indipendente dalla luce nella funzione dell’oscillatore circadiano periferico.

Criptocromi dei mammiferi

Le due funzioni di Drosophila Cry – come fotorecettore per il trascinamento dell’orologio circadiano insieme ai pigmenti visivi e come componente integrale del complesso proteico oscillatore circadiano – sono anche caratteristiche dei criptocromi dei mammiferi. I criptocromi dei mammiferi sono prevalentemente proteine nucleari, ma possono anche essere trovati nel citosol. Come Drosophila Cry, i criptocromi dei mammiferi svolgono sia funzioni dipendenti dalla luce che indipendenti dalla luce nella regolazione dell’orologio circadiano. Diverse osservazioni dimostrano il ruolo luce-dipendente delle proteine Cry dei mammiferi. I topi knockout privi di uno o entrambi i geni Cry hanno una capacità ridotta o abolita di indurre l’espressione di geni come per e il protooncogene c-fos in risposta alla luce. Inoltre, le pupille dei topi mutanti privi sia di Cry1 che di Cry2 hanno ridotte risposte riflesse alla luce.

D’altra parte, il topo mutante doppio cry1 cry2 mostra una ritmicità apparentemente normale in condizioni di ciclismo luce-buio, ma perde la ritmicità istantaneamente e completamente in condizioni di corsa libera (sempre buio). Queste osservazioni indicano che le proteine Cry svolgono una funzione essenziale e indipendente dalla luce nell’oscillatore circadiano centrale dei mammiferi, e che i criptocromi non sono gli unici fotorecettori che mediano il controllo della luce dell’orologio. Il fatto che i criptocromi siano parti integranti dell’oscillatore centrale del topo rende quasi impossibile testare direttamente il loro ruolo nel trascinamento luminoso dell’orologio. Tuttavia, è stato trovato che, in qualche modo analogo alla situazione per la Drosophila, il topo cry mutante mantiene la sua capacità di mediare l’ingresso della luce a meno che la funzione dei pigmenti visivi sia anche interrotta allo stesso tempo. Topi triplo-mutanti che portano mutazioni di entrambi i criptocromi insieme ad una mutazione retinica-degenerativa sono quasi aritmici in condizioni di ciclismo luce-buio. Questi risultati dimostrano che le proteine Cry dei mammiferi sono effettivamente coinvolte nella regolazione dell’orologio circadiano dalla luce, ma il loro ruolo nel trascinamento della luce dell’orologio circadiano è svolto in modo ridondante da altri fotorecettori. Sembra ora chiaro che i fotorecettori aggiuntivi che agiscono insieme ai criptocromi per il trascinamento dell’oscillatore circadiano dei mammiferi sono le opsine visive del cono dell’asta e la relativa proteina melanopsina.

Come il Cry della drosofila, i criptocromi dei mammiferi interagiscono fisicamente con le proteine dell’orologio, compresi i regolatori di trascrizione Per, Clk e Bmal1 (Figura 3b). Contrariamente a Drosophila Cry, le proteine Cry dei mammiferi sono componenti del ciclo di feedback negativo dell’orologio circadiano (Figura 3b). L’interazione fisica del criptocromo con altri componenti dell’orologio influenza la loro attività, interazione, degradazione o traffico nucleare, e di conseguenza altera la regolazione trascrizionale dei geni dell’orologio. Ma l’interazione tra i criptocromi e altre proteine dell’orologio come Per, Clk e Bmal1 non sembra essere influenzata dalla luce, suggerendo che tali interazioni potrebbero non essere il meccanismo di foto-entrainment dell’orologio circadiano, come sono in Drosophila. Oltre alla regolazione diretta della trascrizione attraverso l’interazione fisica con i regolatori di trascrizione legati al promotore, i criptocromi possono anche influenzare l’orologio circadiano partecipando alla regolazione delle modifiche degli istoni, ma come questo funziona rimane da chiarire.

Arabidopsiscryptochromes

Arabidopsis CRY1 e CRY2 sono proteine prevalentemente nucleari che mediano la regolazione dell’espressione genica e il trascinamento dell’orologio circadiano in risposta alla luce . CRY1 e CRY2 svolgono ruoli importanti nella fotomorfogenesi delle piante, come l’inibizione dell’allungamento del fusto da parte della luce blu, la stimolazione dell’espansione delle foglie da parte della luce blu e la regolazione dell’inizio floreale in base alla lunghezza del giorno. Sembra che i criptocromi controllino i cambiamenti di sviluppo nelle piante attraverso i cambiamenti di espressione genica in risposta alla luce. CRY1 e CRY2 insieme sono responsabili dei cambiamenti dipendenti dalla luce blu nell’espressione genica fino al 10-20% del genoma dell’Arabidopsis.

Ci sono almeno due meccanismi attraverso i quali i criptocromi possono influenzare i cambiamenti dell’espressione genica nucleare in risposta alla luce. In primo luogo, una molecola di criptocromo può interagire con proteine associate al macchinario trascrizionale per influenzare direttamente la trascrizione. Arabidopsis CRY2 si lega alla cromatina in un modo indipendente dalla sequenza del DNA (e M. Maymon e C.L., osservazioni non pubblicate), ma non è chiaro come una proteina che interagisce con la cromatina indipendente dalla sequenza possa regolare l’espressione genica. A differenza dei criptocromi animali che hanno dimostrato di regolare la trascrizione attraverso interazioni fisiche con i regolatori di trascrizione legati al promotore, nessuna interazione di questo tipo è stata riportata per i criptocromi vegetali. Un modello alternativo è che i criptocromi vegetali possono interagire con proteine che esercitano altre funzioni cellulari per regolare la stabilità, la modifica e il traffico cellulare dei regolatori trascrizionali. Per esempio, i criptocromi vegetali sono stati trovati per interagire con una ligasi E3 ubiquitina, COP1, suggerendo che i criptocromi vegetali possono agire nel modo non ancora scoperto per i criptocromi animali. Coerentemente con questo punto di vista, è stato anche trovato recentemente che i criptocromi dell’Arabidopsis mediano la soppressione dalla luce blu della degradazione proteasoma-dipendente di un importante regolatore floreale, CONSTANS. Il meccanismo catalitico dei criptocromi non è stato completamente chiarito, ma alcuni indizi possono essere trovati nel meccanismo delle fotolisi CPD, dove il FAD gioca il ruolo catalitico principale. In una reazione di riparazione del DNA, la fotolisi CPD si lega al dimero della pirimidina del DNA e lo “ribalta” dall’interno del duplex del DNA nella cavità di accesso al FAD dell’enzima, per formare un complesso stabile. L’altro cromoforo (pterina o deazaflavina), chiamato anche cromoforo “antenna”, assorbe fotoni di luce blu o UV-A e trasferisce l’energia di eccitazione alla flavina del FAD. La flavina nello stato eccitato dona un elettrone al dimero della pirimidina per dividere l’anello ciclobutano. L’elettrone viene ritrasferito alla flavina in questo processo, con conseguente rigenerazione della flavina allo stato di terra. Il dinucleotide riparato non si adatta più alla cavità di accesso del FAD, quindi si dissocia dalla fotolisi. Il ruolo esatto del FAD e della cavità di accesso al FAD nella funzione dei criptocromi rimane poco chiaro, ma è ipotizzabile che possa anche essere coinvolto nelle reazioni di trasferimento di elettroni.

Anche se la regione PHR che contiene i cromofori è la parte più conservata delle proteine, il dominio carbossi-terminale ha dimostrato di avere un ruolo nella funzione o nella regolazione dei criptocromi sia animali che vegetali. L’espressione dei domini carbossi-terminali dei criptocromi dell’Arabidopsis fusi all’enzima marcatore b-glucuronidasi conferisce una risposta di crescita costitutiva alla luce anche al buio in assenza della regione PHR. Al contrario, le regioni PHR dei criptocromi di Drosophila e Xenopus sono fisiologicamente attive in assenza del dominio carbossi-terminale. Il dominio carbossi-terminale di Drosophila Cry è importante per la stabilità della proteina, l’interazione con Tim, e la sensibilità del fotorecettore ai segnali luminosi circadiani, mentre il dominio carbossi-terminale di Xenopus Cry è richiesto per la sua localizzazione nucleare

I criptocromi sono regolati dalla fosforilazione. È stato dimostrato che i criptocromi dell’Arabidopsis sono fosforilati in risposta alla luce blu e che questo è associato alla funzione e alla regolazione dei fotorecettori. Inoltre, quando Arabidopsis CRY1 è stato espresso in cellule di insetti, è stato trovato per subire ATP-dipendente e autofosforilazione dipendente dalla luce blu. Non è noto se i criptocromi animali si legano anche all’ATP, anche se è stato dimostrato che i criptocromi del topo sono fosforilati.

L’interazione tra la regione PHR del CRY1 dell’Arabidopsis e l’ATP ha alcune caratteristiche interessanti che ricordano l’interazione tra il dimero della pirimidina e la fotolisi: i gruppi fosfato dell’ATP sono esposti al solvente; le società di adenina e ribosio sono sepolte in profondità nella cavità di accesso del FAD; e l’ATP può avere un contatto mediato dall’acqua con il FAD. L’interazione della regione CRY1 pHR dell’Arabidopsis con l’ATP manca anche di diverse caratteristiche che si trovano comunemente nelle interazioni proteina-ATP, come l’interazione proteina-fosfato, il contatto proteina-Mg2+, e un vicino residuo di serina per il fosfotrasferimento. Un esame della topologia della struttura della regione PHR di CRY1 mostra, tuttavia, che tutte queste caratteristiche potrebbero potenzialmente essere fornite dal dominio carbossi-terminale del criptocromo (Figura 4). L’osservazione che i domini carbossi-terminali ricchi di serina dei criptocromi dell’Arabidopsis fusi alla β-glucuronidasi sono costitutivamente fosforilati in vivo (, suggerisce che un fosfotrasferimento può avvenire dall’ATP legato alla cavità di accesso del FAD al vicino dominio carbossi-terminale (Figura 4a). È anche concepibile che il FAD eccitato dai fotoni possa innescare il trasferimento di elettroni al nucleotide e il fosfotrasferimento dall’ATP ai residui di serina sul dominio carbossi-terminale. Poiché la superficie della regione PHR è prevalentemente carica negativamente, specialmente nel punto in cui è probabile che il dominio carbossi-terminale interagisca con essa, il dominio carbossi-terminale fosforilato verrebbe quindi respinto dalla superficie della regione PHR, provocando un cambiamento di conformazione del criptocromo. Questo cambiamento conformazionale gli permetterebbe di interagire con altre proteine di segnalazione e di propagare il segnale luminoso (Figura 4a). In alternativa, un’altra molecola di criptocromo che si lega alla cavità di accesso del FAD può anche fornire le caratteristiche mancanti necessarie per una produttiva interazione ATP-criptocromo. Infatti, sia l’interazione CRY2-CRY2 che quella CRY1-CRY2 possono essere rilevate in Arabidopsis (D. Shalitin, X. Yu, e C.L., osservazioni non pubblicate). La formazione di un omo-oligomero o di un etero-oligomero di criptocromi fornirebbe un meccanismo per il fosfotrasferimento intermolecolare, che può cambiare la struttura dei criptocromi (Figura 4b, c).