Frontiers | Miosina catena leggera chinasi: A Potential Target for Treatment of Inflammatory Diseases | Pharmacology

Nei mammiferi, la miosina catena leggera chinasi (MLCK) è codificata dai geni mylk1 e mylk2 (Herring et al., 2006). mylk2 codifica una isoforma MLCK che è espressa esclusivamente nelle cellule muscolari scheletriche (Herring et al., 2006; Wang L. et al., 2016). A causa della mancanza di dati sui prodotti di codifica del gene mylk2, discutiamo principalmente i prodotti del gene mylk1, che includono MLCK a catena lunga (220 kDa), MLCK a catena corta (130 kDa), e la proteina non catalitica carbossi-terminale (17 kDa), telokin (Chen et al, 2013; Chen C. et al., 2014; An et al., 2015). I prodotti che codificano il gene mylk1 sono espressi in diversi tipi di cellule e tessuti tra cui muscoli, piastrine e cellule secretorie e cerebrali (Jin et al., 2002). Numerose attività delle cellule, come la contrazione, l’adesione, la migrazione cellulare e la formazione della barriera epiteliale si verificano in una catena leggera di regolazione della miosina (MLC) fosforilazione modo dipendente o indipendente (Chen et al., 2013; Chen C. et al., 2014; Kim e Helfman, 2016). L’espressione anomala di MLCK è stata osservata in molte malattie infiammatorie tra cui pancreatite (Shi et al., 2014), malattie respiratorie (Zhou et al., 2015), malattie cardiovascolari (Cheng et al., 2015), cancro (Zhou et al., 2014) e malattie infiammatorie intestinali (IBD) (Yi et al., 2014). Il coinvolgimento di MLCK e la via di segnalazione MLCK che sono alla base di malattie infiammatorie rappresentative è discusso. Alcune malattie in cui MLCK è coinvolto sono elencate nella tabella 1.

TABELLA 1

TABELLA 1. Ruolo della miosina catena leggera chinasi (MLCK) in malattie selezionate.

MLCK in malattie respiratorie, aterosclerosi e pancreatite

Nelle patologie polmonari infiammatorie, il danno all’integrità della barriera delle cellule endoteliali polmonari altera la permeabilità vascolare, e l’allagamento alveolare spesso risulta (Mao et al., 2015). L’espressione anormale di MLCK si verifica nel danno polmonare, e l’inibitore MLCK ML-7 o la delezione del gene MLCK possono attenuare il danno polmonare (Wang T. et al., 2016). MLCK ha un’attività simile nell’asma e nell’infiammazione polmonare, e la variazione del gene MYLK è fortemente associata al danno polmonare acuto e alla suscettibilità all’asma (Wang et al., 2014, 2015; Wang T. et al., 2016).

La disfunzione della barriera endoteliale indotta da MLCK è anche coinvolta nella pancreatite e nell’aterosclerosi (Cheng et al., 2015; Wang et al., 2014; Wang T. et al., 2016). La pancreatite acuta grave è associata ad alta morbilità e mortalità. La sua patogenesi non è completamente compresa (Zerem, 2014), ma l’espressione di MLCK è significativamente aumentata nei modelli di ratto di pancreatite acuta (Shi et al., 2014), e l’elevazione del fattore di necrosi tumorale (TNF)-α nella pancreatite acuta grave ha dimostrato di mediare la regolazione MLCK-dipendente del citoscheletro, portando alla distruzione della funzione della barriera endoteliale (Shi et al., 2014; Yu et al., 2016). L’inizio e lo sviluppo dell’aterosclerosi portano spesso a una progressiva lesione vascolare, che è accompagnata da una disfunzione endoteliale (Phinikaridou et al., 2015). Il coinvolgimento di MLCK nella storia naturale dell’aterosclerosi è stato confermato dall’alleviamento del danno vascolare e dell’aterosclerosi da ML-7, un inibitore MLCK (Cheng et al, 2015).

MLCK nello sviluppo del cancro

L’espressione anomala di MLCK è stata osservata in linee cellulari di cancro al pancreas, al polmone e alla prostata (Tohtong et al., 2003; Nagaraj et al., 2010; Chen et al., 2011). Cambiamenti rapidi e dinamici del citoscheletro sono necessari per l’invasione e la metastasi delle cellule tumorali. La fosforilazione MLCK-dipendente della miosina II citoscheletrica aumenta il potenziale metastatico delle cellule tumorali, e il riarrangiamento del citoscheletro MLCK-dipendente modula le funzioni della barriera vascolare endoteliale associate all’angiogenesi, che è un passo critico nello sviluppo del cancro (Dudek e Garcia, 2001). D’altra parte, il potenziale metastatico delle cellule del cancro al seno è aumentato dalla perdita di MLCK (Kim e Helfman, 2016). I cambiamenti nella migrazione e nell’adesione delle cellule sono anche fasi iniziali caratteristiche dell’infiammazione, ma ci sono pochi rapporti sulla regolazione MLCK della migrazione delle cellule infiammatorie.

MCLK nelle IBD

La malattia infiammatoria intestinale, compresa la colite ulcerosa e il morbo di Crohn, è caratterizzata da un’infiammazione gastrointestinale cronica, ed è associata a una significativa compromissione del paziente e ad alti costi di trattamento (Rai et al., 2015). Anche se la patogenesi delle IBD rimane oscura, ci sono prove che la disfunzione della barriera intestinale è il driver primario (Hindryckx e Laukens, 2012; Pastorelli et al., 2015). La disfunzione delle giunzioni strette porta al danneggiamento della barriera intestinale, che permette il passaggio di diversi agenti patogeni (Jin e Blikslager, 2016). Le giunzioni strette sono costituite da proteine transmembrana come le occludine e le claudine e da proteine di membrana periferiche, cioè le proteine della zonula occludens (Van Itallie e Anderson, 2014). Le giunzioni strette sono situate nella regione apicolaterale delle cellule endoteliali e sono legate a un anello di actomiosina perijunzionale. La fosforilazione indotta da MLCK dell’actomiosina perifunzionale media la perdita della giunzione stretta, che può innescare l’inizio e lo sviluppo delle IBD. L’espressione e l’attività di MLCK è aumentata nelle IBD umane ed è associata all’evidenza istologica dell’attività della malattia (Blair et al., 2006). L’elevazione anormale di MLCK è stata osservata anche nella colite sperimentale indotta dalla somministrazione gavage di destrano solfato sodico o dalla somministrazione intracolonica di acido trinitrobenzensolfonico (Su et al., 2013; Xiong et al, 2016).

AttivazioneMLCK in IBD

TNF-α è una citochina proinfiammatoria che causa la disfunzione della barriera della giunzione stretta intestinale, che è centrale nella patogenesi di IBD (Saleh et al., 2016). In IBD, TNF recettore 2 (R2) – segnalazione mediata contribuisce ad aumentare l’espressione epiteliale MLCK (Su et al., 2013; Suzuki et al., 2014). In un recente rapporto di Al-Sadi et al. (2013), la permeabilità della giunzione stretta dei monostrati di cellule Caco-2, in un modello in vitro di epitelio intestinale, è stata aumentata dall’attivazione del TNF-α della via di segnalazione ERK1/2. L’attivazione della via ERK1/2 ha indotto la fosforilazione del fattore di trascrizione Elk-1 contenente il dominio ETS. Elk-1 attivato si è poi spostato nel nucleo e si è legato al promotore di MLCK, risultando infine nell’espressione epiteliale di MLCK. LUCE (lymphotoxin-like inducible protein che compete con la glicoproteina D per l’ingresso del virus dell’herpes sulle cellule T) è un membro della famiglia TNF core che è coinvolto nella patogenesi delle IBD umane (Krause et al., 2014), e in epiteli in coltura, l’inibizione di MLCK ha alleviato la perdita della barriera indotta dalla LUCE, il che ha suggerito che la perdita della barriera epiteliale indotta dalla LUCE può dipendere dall’attivazione di MLCK (Schwarz et al., 2007).

L’aumento della permeabilità della giunzione stretta attraverso l’aumento mediato da IL-1β dell’espressione di MLCK è stato dimostrato nelle malattie infiammatorie (Beard et al., 2014). Nella migrazione delle cellule staminali mesenchimali, IL-1β ha dimostrato di causare un aumento dell’espressione di MLCK epiteliale attraverso l’attivazione della via PKCd/NF-κB; ha anche stimolato l’attività MLCK attraverso la via di segnalazione PKCa/MEK/ERK (Lin et al, 2014).

IFN-γ è stato anche associato all’attivazione di MLCK promuovendo l’adesione e l’internalizzazione di batteri commensali da parte di epitelio MLCK-attivato brush border fanning (Wu et al., 2014). Tuttavia, come per la regolazione mediata dalla LUCE di MLCK, sono necessari ulteriori studi sulla regolazione mediata da INF-γ di MLCK per determinare se è diretta. Percorsi di segnalazione associati alla regolazione di MLCK sono mostrati nella Figura supplementare S1.

MLCK-Associated Signaling Pathways That Can Trigger IBD

In IBD, MLCK-indotta disfunzione barriera epiteliale è innescato da due percorsi di segnalazione. In primo luogo, nell’intestino, l’epitelio forma una barriera contro gli agenti patogeni nel lume. L’espressione anormale di MLCK nelle malattie infiammatorie gastrointestinali porta alla fosforilazione della catena leggera regolatrice della miosina II (MLC), alla contrazione dell’anello di actomiosina e all’aumento della permeabilità intestinale (Yi et al., 2015). Quindi, la fosforilazione MLC-dipendente è un meccanismo essenziale alla base della disfunzione della barriera epiteliale indotta da MLCK. Un secondo meccanismo coinvolge MLCK-stimolato upregulation di claudin-2 e occludin endocitosi (Su et al., 2013; Jin e Blikslager, 2016). L’aumento dell’espressione di claudin-2 è stata associata alla disfunzione della barriera epiteliale intestinale (Hu et al., 2015; Krishnan et al., 2015), così come la diminuzione dell’assorbimento, la diarrea da flusso di perdita e le risposte infiammatorie (Hu et al., 2015). Down-regolazione di occludina in IBD diminuisce la permeabilità gastrointestinale, che può interrompere l’integrità della barriera contro una varietà di agenti patogeni (Yin et al., 2015).

Potenziale ruolo patologico di Smooth Muscle MLCK in IBD

Muscolo liscio (sm) MLCK è trascritto dallo stesso gene come MLCK epiteliale. È coinvolto nella regolazione della contrazione sm, e la variazione del contenuto smMLCK porta a disturbi della motilità (Chen et al., 2015). I disturbi della motilità causano secondariamente una crescita anomala della flora intestinale, che a sua volta aggrava la patogenesi dell’infiammazione intestinale (Chen D. et al., 2014; Welch et al., 2014). Se c’è un effetto diretto di smMLCK sulle malattie infiammatorie ha bisogno di ulteriori studi.

InibitoriMLCK con potenziale uso farmaceutico

La miosina catena leggera chinasi ha domini catalitico, inibitorio, e calmodulina-binding (Chang et al., 2016). L’attività del dominio catalitico può essere rivelata da una digestione triptica parziale, e può essere bloccata da inibitori MLCK (Luck e Choh, 2011; Chang et al., 2016). Gli inibitori di MLCK agiscono legandosi in modo competitivo al sito di legame all’ATP sulla molecola MLCK o nelle sue vicinanze (Saitoh et al., 1987; Luck e Choh, 2011). MLCK è stata ampiamente studiata in sm, ma è ampiamente distribuita in cellule e tessuti animali. Di conseguenza, determinare le attività di MLCK in altri tessuti è fondamentale; gli inibitori di MLCK sono buoni strumenti per questo. Gli inibitori di MLCK hanno anche un potenziale farmacologico come vasodilatatori e agenti antinfiammatori. Alcuni inibitori MLCK, le loro origini e le prove di effetto farmacologico sono elencati nella tabella 2.

TABELLA 2

TABELLA 2.

ML-9 e ML-7

ML-9 è un inibitore classico di MLCK (IC50 = 3,8 μM), che è stato trovato per inibire sia la smMLCK Ca2+-calmodulina-dipendente che indipendente (Saitoh et al., 1987; Shi et al., 2007). Sia ML-9 che i suoi derivati sintetici sono buoni inibitori selettivi di smMLCK (Ito et al., 2004). ML-9 ha dimostrato di ridurre la pressione intraoculare negli occhi di coniglio (Honjo et al., 2002).

Un altro inibitore MLCK, ML-7 , è un agente permeabile alla membrana (Shi et al., 2007). Sia ML-9 che ML-7 sono derivati della naftalene sulfonamide (Shi et al., 2007). L’inibizione di ML-7 è più di 30 volte più potente di quella di ML-9 (IC50 = 300 nM) (Shi et al., 2007). Tuttavia, rispetto a ML-9, l’inibizione MLCK specifica di smMLCK e altre isoforme MLCK può essere meno potente (Saitoh et al., 1987). Effetti benefici di ML-7 è stato dimostrato in molte condizioni tra cui cuore ischemia/riperfusione lesioni (Lin et al., 2012; Zhang et al., 2015), IBD (Cheng et al., 2015) e aterosclerosi (Cheng et al, 2015).

Inibitori di prodotti microbici di MLCK

K-252a, un alcaloide microbico purificato da colture microbiche, è un inibitore non selettivo di MLCK (Nakanishi et al., 1992) così come di altre protein chinasi tra cui la protein chinasi C e alcune protein chinasi dipendenti dal nucleotide ciclico (Nakanishi et al., 1992). KT592 è un derivato di K-252a con una maggiore selettività. La wortmannina, isolata e purificata dal ceppo fungino Talaromyces wortmannin KY12420, è un altro prodotto microbico inibitore di MLCK (Nakanishi et al., 1992), ha dimostrato di diminuire le risposte secretorie nelle cellule midollari surrenali di ratto attraverso l’inibizione di MLCK (Warashina, 2000) e di avere attività antifungina, emorragica e antinfiammatoria che potrebbe non essere collegata all’inibizione di MLCK (Nakanishi et al., 1992). I potenziali effetti farmacologici di questi inibitori richiedono ulteriori studi.

Potenziali inibitori naturali di MLCK

Come mostrato nella tabella 2, alcuni costituenti bioattivi presenti in natura possono essere inibitori di MLCK. In un sistema in vitro che include miosina purificata e MLCK, la quercetina ha inibito la fosforilazione della miosina. L’inibizione può essere bloccata dall’inibitore MLCK ML-7, indicando che la quercetina può essere un inibitore diretto di MLCK (Zhang et al., 2006). In un modello animale di disturbo della motilità intestinale, la somministrazione di capsaicina ha diminuito significativamente l’espressione di MLCK, il che implica anche MLCK come bersaglio dell’inibizione da parte della capsaicina (Chen et al., 2015). L’inibizione in risposta all’acido salvianolico B può essere indiretta; sono coinvolte altre segnalazioni. L’acido salvianolico B diminuisce l’espressione di MLCK attraverso l’upregolazione del microRNA1 (Xiong et al., 2016). L’upregolazione di microRNA-374a, microRNA-155, miR-520c-3p, e miR-1290 è stata anche trovata per ridurre l’espressione di MLCK in vari tessuti (Adyshev et al., 2013; Weber et al., 2014). I composti bioattivi presenti in natura che agiscono indirettamente attraverso i microRNA sono una via di inibizione alternativa. Tuttavia, sono necessari esperimenti farmacologici specifici per la malattia per confermare gli effetti dei potenziali inibitori naturali di MLCK.

Sommario

Questa revisione riassume le prove di un ruolo di MLCK nelle malattie infiammatorie, in particolare IBD. L’espressione anormale di MLCK è coinvolta in diversi eventi patologici, principalmente causando cambiamenti citoscheletrici che disturbano la funzione di barriera epiteliale. L’effetto degli agenti anti-MLCK in specifiche malattie infiammatorie dipende dal grado di coinvolgimento della funzione endoteliale. La prevenzione degli effetti collaterali legati al trattamento è una considerazione chiave perché MLCK è abbondantemente espresso in molti tessuti. La considerazione di due aspetti della selettività aiuta ad anticipare e prevenire gli effetti collaterali degli inibitori di MLCK. Il primo è l’inibizione selettiva di MLCK e di altre protein chinasi come la protein chinasi C e la protein chinasi dipendente dal nucleotide ciclico; l’altro è l’inibizione selettiva delle diverse isoforme di MLCK come smMLCK e nmMLCK. I potenziali agenti farmaceutici anti-MLCK offrono una nuova prospettiva per il trattamento delle malattie infiammatorie che differisce dalla tradizionale terapia antinfiammatoria.

Contributi degli autori

Hanno concepito e progettato la revisione: DC. Controllo dei riferimenti: DC, YX, CW, LW, ZZ e LS. Redatto il documento e rivisto criticamente per importanti contenuti intellettuali: DC, YX, CW, LW, ZZ e LS. Il manoscritto è stato approvato da tutti gli autori.

Conflict of Interest Statement

Gli autori dichiarano che la ricerca è stata condotta in assenza di relazioni commerciali o finanziarie che potrebbero essere interpretate come un potenziale conflitto di interessi.

Riconoscimenti

Questo studio è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (sovvenzione numero 81600440, 81273919) e Dalian Municipal Medical Research Foundation.

Materiale supplementare

Il materiale supplementare per questo articolo può essere trovato online all’indirizzo: https://www.frontiersin.org/article/10.3389/fphar.2017.00292/full#supplementary-material

FIGURA S1 | Sono mostrati i meccanismi alla base della regolazione indotta da MLCK della funzione della barriera endoteliale. Frecce solide indicano interazione diretta e frecce tratteggiate indicano interazioni indirette.

Adyshev, D. M., Moldobaeva, N., Mapes, B., Elangovan, V., e Garcia, J. G. (2013). MicroRNA regolazione dell’espressione non muscolare catena leggera miosina chinasi in endotelio polmonare umano. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 49, 58-66. doi: 10.1165/rcmb.2012-0397OC