Frontiers in Immunology

FIGURA 1

Figura 1. Integrazione dei risultati degli autoanticorpi NMDAR1 (AB) in un modello esplicativo.

FIGURA 2

Figura 2. Si prega di notare che la nuova nomenclatura GluN1 per NMDAR1/NR1 è ignorata qui per coerenza con la maggior parte della letteratura rivista.

Recettori NMDA nel cervello e periferia

Recettori N-metil-d-aspartato (NMDAR) sono canali ionici glutammato-gated, abbondantemente espressi nel cervello dei mammiferi (1). Essi formano eteromeri di NR1, NR2 e NR3 subunità, con NR1 è l’unico partner obbligatorio. NMDAR sono fondamentali per regolare la funzione neuronale/sinapsi e sono anche espressi da tipi di cellule non neuronali nel cervello come astrociti, oligodendrociti o cellule endoteliali (2-5). Inoltre, l’espressione periferica è stata riportata, ad esempio, nel tratto gastrointestinale o nelle cellule immunitarie (6).

Encefalite anti-NMDAR

Autoanticorpi della classe immunoglobulina G (IgG) diretti contro NMDAR1 sono stati originariamente collegati con una condizione chiamata “encefalite anti-NMDAR” (7-10). Nel 2007, Dalmau e colleghi hanno descritto per la prima volta una sindrome paraneoplastica, basata su 12 donne con teratoma ovarico, portatrici di IgG AB contro le subunità NMDAR NR1/2. La sindrome consisteva variabilmente in psicosi, declino cognitivo, crisi epilettiche, discinesia, diminuzione della coscienza e instabilità autonomica. Gli autori hanno riportato in molte pubblicazioni successive, sulla base di un numero crescente di individui con encefalite anti-NMDAR, elevati titoli sierici e del liquido cerebrospinale (CSF) di NMDAR1-AB della classe IgG in questa condizione così come la risposta spesso favorevole alla terapia immunosoppressiva (7-10). Come meccanismo fisiopatologico della sindrome, è stata suggerita la diminuzione indotta da NMDAR1-AB delle correnti mediate da NMDAR, dovuta a una maggiore internalizzazione del recettore e quindi a una ridotta espressione di superficie (11). Tuttavia, per diversi anni, i soggetti sani non sono stati nemmeno indagati in numero apprezzabile per la sieroprevalenza di NMDAR1-AB. Ciononostante, la presenza di NMDAR1-AB della classe IgG nel siero (non solo nel CSF) è stata e continua ad essere considerata specifica per la malattia (7-10), causando una certa confusione in letteratura e purtroppo anche nella pratica clinica.

Sindromi che ricordano l’antagonismo NMDAR1

Siccome l’ipofunzione NMDAR era stata ipotizzata come un meccanismo centrale nella schizofrenia, a causa dell’induzione dei sintomi psicotici da parte degli antagonisti (12, 13), diversi anni fa è sorta la domanda se una sottopopolazione di soggetti schizofrenici possa essere un caso di encefalite anti-NMDAR precedentemente trascurato. Finora, la letteratura – per lo più basata su campioni di piccole dimensioni e seguendo l’originale “affermazione di specificità della malattia di NMDAR1-AB della classe IgG” – ha dato risultati discordanti (14-20). Analogamente, altre condizioni patologiche, che ricordano allo stesso modo l’antagonismo NMDAR, ad esempio l’epilessia o la demenza, sono state studiate per la presenza di NMDAR1-AB. Una marea di pubblicazioni è apparso – molti di loro case report – che descrive le associazioni di NMDAR1-AB con una grande varietà di sindromi. Infine, anche NMDAR1-AB di altre classi di immunoglobuline (Ig) (IgM e IgA) sono stati segnalati come associati a condizioni patologiche (17, 21-23). Una domanda interessante che è rimasta totalmente aperta fino ad ora è se NMDAR1-AB può anche portare a “fenotipi periferici”, considerando l’espressione di NMDAR in organi e tessuti periferici (6).

Distribuzione equa di NMDAR1-AB nel siero attraverso la salute e la malattia

Inaspettatamente, il recente lavoro nostro e di altri su >5.000 individui ha sfidato la “pretesa specificità della malattia” di qualsiasi NMDAR1-AB dimostrando età dipendente fino a >20% NMDAR1-AB sieroprevalenza, compresi IgM, IgA e IgG, sia in soggetti sani che malati. È interessante notare che NMDAR1-AB della classe IgE sono stati cercati ma mai rilevati (24). Le malattie indagate in questi studi comprendono condizioni neuropsichiatriche (schizofrenia, disturbi affettivi, morbo di Parkinson, sclerosi laterale amiotrofica, morbo di Alzheimer, ictus, sclerosi multipla e disturbi della personalità) e condizioni mediche generali, ad esempio, diabete o ipertensione (24-28). Anche la gamma di titoli di NMDAR1-AB nel siero e la distribuzione delle classi di Ig erano comparabili in tutti i gruppi di malattie studiati e negli individui sani (24-28). Ogni persona di 40 anni ha un ~10% e ogni persona di 80 anni ha un ~20% di possibilità di mostrare la sieropositività NMDAR1-AB (24).

Funzionalità di NMDAR1-AB

Questa sorprendente scoperta ha sollevato la questione se questi AB sono tutti funzionali. Poiché per tutte queste determinazioni di NMDAR1-AB sono stati utilizzati mosaici di biochip e un saggio basato su cellule, la procedura standard clinica (cellule HEK293T trasfettate con NMDAR1 e AB secondario contro IgG, IgM o IgA umane; Euroimmun, Lubecca, Germania), è stato necessario eseguire ulteriori saggi per consolidare ulteriormente questi risultati imprevisti dimostrando la funzionalità AB. Questi saggi in vitro (tutti condotti con i sieri dopo la precipitazione solfato di ammonio delle immunoglobuline e la dialisi) hanno rivelato effetti simili di NMDAR1-AB-indipendentemente dalla classe Ig-per l’internalizzazione del recettore nei neuroni umani IPSC-derivati così come nei neuroni primari del topo. Allo stesso modo, NMDAR1-AB di tutte le classi Ig ha ridotto le correnti evocate dal glutammato negli ovociti di Xenopus laevis che esprimono NR1-1b/NR2A (26, 28, 29). Studi in vivo nel topo e nell’uomo suggeriscono effetti comparabili di siero NMDAR1-AB di tutte le classi Ig per quanto riguarda la modulazione delle funzioni cerebrali (vedi maggiori dettagli sotto).

Metodi di AB Detection-Still Room for Improvement

Un problema ancora in sospeso che richiede la standardizzazione è la diversità dei metodi applicati per la determinazione AB con diversa specificità e sensibilità. Per quanto riguarda NMDAR1-AB (dove abbiamo la più solida esperienza propria), saggi basati su cellule sono certamente il metodo superiore per rilevare NMDAR1-AB poiché epitopi sono esposti in modo naturale per consentire AB per rilevare specificamente loro. Ma anche questi saggi differiscono, con alcuni autori che usano cellule vive trasfettate transitoriamente accettando la loro potenziale variabilità e problemi di variazione da lotto a lotto, contro altri che usano cellule fisse e permeabilizzate che esprimono l’intera subunità NMDAR1, permettendo probabilmente una migliore standardizzazione (Euroimmun). Quest’ultimo test è attualmente utilizzato in tutto il mondo per diagnosticare l’encefalite NMDAR1-AB. Sulla base della nostra esperienza con questo test in associazione con studi di funzionalità eseguiti in parallelo (internalizzazione del recettore, elettrofisiologia e studi in vivo), sembra essere il metodo più affidabile a questo punto. È, tuttavia, fortemente raccomandato di utilizzare questo test in combinazione con AB secondario che sono altamente specifici per le varie classi Ig (anti-IgG umane, anti-IgA umane e anti-IgM umane) poiché cross-reagenti AB può portare a conclusioni errate per quanto riguarda, ad esempio, la prevalenza di IgG AB. L’uso di sezioni cerebrali di ratto, topo, uomo o scimmia per il rilevamento immunoistochimico di AB specifico può essere un’utile aggiunta che fornisce prove di supporto. Al contrario, il tipico ELISA basato su peptidi non può essere raccomandato come metodo di rilevamento per NMDAR1-AB, poiché molti risultati falso-positivi e/o falso-negativi possono essere ottenuti a causa dell’esposizione innaturale (rimossa dalla posizione nella membrana cellulare) dell’epitopo. Questi saggi sembrano adatti solo per analisi di follow-up, per esempio, la determinazione del corso del titolo AB utilizzando una serie di campioni dallo stesso donatore, precedentemente chiaramente diagnosticato come sieropositivo da saggi cellulari e funzionali.

Un ruolo decisivo della barriera emato-encefalica (BBB) per la rilevanza sindromica

Chiedendoci perché così tanti portatori di NMDAR1-AB nel siero rimangono sani, abbiamo ipotizzato che una BBB compromessa potrebbe decidere il loro significato fisiopatologico. È importante notare che una maggiore permeabilità della BBB può differire a livello regionale, spiegando così le conseguenze sintomatiche individuali variabili (30). Come modello animale, abbiamo studiato i topi ApoE-/- con perdita nota della BBB rispetto ai compagni di cucciolata wild-type (31). L’iniezione endovenosa di frazioni Ig purificate da soggetti umani sieropositivi per NMDAR-AB (IgM, IgG e IgA) ha portato ad alterazioni nell’attività spontanea in campo aperto e nella risposta ipersensibile (legata alla psicosi) a MK-801 in campo aperto esclusivamente nei topi ApoE-/- (28). Esplorando il ruolo di una BBB compromessa successivamente anche negli esseri umani, abbiamo visto infatti più gravi sintomi neurologici in NMDAR1-AB portatori (di qualsiasi classe Ig) con una storia di complicazioni di nascita o neurotrauma, condizioni con probabile cronicamente leaky BBB (28). Sulla stessa linea, abbiamo studiato i portatori di APOE4 poiché l’aplotipo APOE4 è stato associato a una BBB permeabile (32, 33). Abbiamo ottenuto i primi indizi che NMDAR-AB può aumentare i deliri di grandiosità e la mania nei portatori APOE4 neuropsichiatrici malati, che sono poi più probabilmente diagnosticati schizoaffettivi (29). Un ruolo modificatore di preesistente circolante NMDAR1-AB (di nuovo di tutte le classi) è stato visto anche in ictus ischemico umano. Nei pazienti con BBB intatta prima del verificarsi dell’insulto, NMDAR1-AB erano protettivi rispetto all’evoluzione delle dimensioni della lesione, mentre nei portatori di APOE4, NMDAR1-AB erano associati a maggiori volumi di insulto (24). Questi risultati sottolineano che non solo il grado ma anche la durata della disfunzione della BBB, acuta rispetto alla cronica, può giocare un ruolo fondamentale nella formazione della sindrome da NMDAR1-AB.

Il cervello come immunoprecipitatore di NMDAR1-AB

NMDAR1-AB circolante di tutti gli isotipi Ig temporaneamente diminuito dopo l’ictus (24). Questo ci ha portato a ipotizzare che il tessuto cerebrale con il suo NMDAR1 densamente espresso (accessibile dopo la rottura della BBB) può agire come una trappola per NMDAR1-AB circolante (25). Abbiamo prima affrontato la questione se siero NMDAR1-AB sarebbe rilevabile nel CSF. Di N = 271 soggetti di mezza età (con diagnosi di sclerosi multipla o controlli di malattia) con coppie siero- CSF disponibili, 26 erano sieropositivi NMDAR1-AB (che è nella gamma prevista), ma, notevolmente, solo 1 era positivo CSF. Al contrario, tetano-AB (onnipresente a causa della vaccinazione obbligatoria, ma non si lega al tessuto cerebrale) erano presenti nel siero e nel CSF di tutti i soggetti, con livelli CSF più alti su BBB compromessa. Esperimenti traslazionali nei topi hanno dimostrato l’ipotesi che il cervello agisce come “immunoprecipitatore”: l’iniezione simultanea di NMDAR1-AB IgG e di un “non-senso-AB” non legante il cervello (anti-GFP IgG) ha portato ad un’alta rilevabilità del primo solo nel cervello (nettamente più pronunciato su disfunzione BBB) e il secondo solo nel CSF (25). Questi dati possono aiutare a spiegare le potenziali conseguenze sintomatiche del siero AB diretto contro gli antigeni del cervello. Mentre la perdita della BBB ha un ruolo importante e dovrebbe essere valutata nei casi in cui si sospetta la rilevanza patologica di NMDAR1-AB circolante, i risultati negativi riguardanti i titoli AB nel CSF non possono escludere automaticamente gli effetti cerebrali.

Epitopi riconosciuti da NMDAR1-AB

La domanda successiva era se questi NMDAR1-AB apparentemente funzionali riconoscessero lo stesso epitopo e se questo potrebbe potenzialmente spiegare la loro alta sieroprevalenza. Ancora una volta inaspettatamente, la mappatura dell’epitopo utilizzando sette diversi costrutti NMDAR1 ha rivelato il riconoscimento da parte dei sieri NMDAR1-AB-positivi di diversi epitopi, situati nel legame extracellulare del ligando e nel dominio N-terminale (NTD) così come il C-terminale intracellulare e il dominio extra large pore. La sieropositività di NMDAR1-AB era policlonale/polispecifica nella metà dei sieri esaminati e probabilmente mono o oligoclonale/oligospecifica (principalmente IgG) nell’altra metà. Nel complesso, non è apparso alcun modello particolare legato alla malattia: Gli epitopi NMDAR1 erano comparabili tra i gruppi di malattie (26). I lavori pubblicati sugli epitopi NMDAR1-AB sono stati scarsi prima di questa indagine sistematica e si sono concentrati sulle IgG che riconoscono l’NTD e il dominio NTD-G7 (N368/G369), probabilmente perché questa regione e questa classe di Ig sono state considerate patognomoniche per l’encefalite anti-NMDAR (8, 34). In effetti, sembra che i fattori che predispongono le giovani donne alle manifestazioni neuropsichiatriche dell’autoimmunità associata a NMDAR1 siano collegati agli epitopi NTD o NTD-G7. Il ruolo accentuato delle IgG in questo contesto è ancora oggetto di speculazione, ma probabilmente legato al cambio di classe indotto dall’infiammazione nel cervello (36).

Fattori predisponenti a portare o potenziare NMDAR1-AB

Sulla base di questi risultati in vitro e in vivo, dobbiamo assumere che fondamentalmente tutti gli NMDAR1-AB presenti in natura hanno un potenziale patogeno indipendentemente dall’epitopo e dalla classe Ig. Questo, tuttavia, non significa che il tipo di classe Ig non possa avviare cascate distinte di eventi secondari e quindi modellare ulteriormente la risposta finale del tessuto. Ma ora sorgono ancora più domande: come possiamo spiegare l’alta sieroprevalenza indipendente dalla malattia di NMDAR1-AB, che aumenta con l’età? Conosciamo qualche fattore predisponente e, se sì, come possiamo integrare il loro ruolo nel quadro completo? Gli NMDAR1-AB sono stati inizialmente associati a condizioni oncologiche (teratoma) (7). Più tardi, una predisposizione a portare questi AB è stato visto su influenza A e B sieropositività, una scoperta replicata in un campione indipendente (25, 28). Anche un marcatore genomico significativo, rs524991, anche legato alla biologia NMDAR, è stato trovato associato a NMDAR1-AB (28). Se una BBB che perde, causando una maggiore esposizione di NMDAR1 centrale alle cellule del sistema immunitario, può indurre la formazione di NMDAR1-AB e/o aumentare cloni di cellule B specifiche preesistenti non è attualmente chiaro e deve essere studiato sistematicamente. Un’altra idea attraente che non è stata ancora perseguita nel campo di NMDAR1-AB è la potenziale influenza modulatoria del microbioma sull’aumento di NMDAR1-AB (37).

Altri AB guidati dall’antigene del cervello

Perché vediamo NMDAR1-AB così abbondantemente nella salute e nella malattia? Questo vale anche per altri AB diretti contro antigeni cerebrali? Per rispondere a queste domande, abbiamo studiato analogamente altri 24 AB sierici diretti contro antigeni cerebrali, precedentemente collegati a condizioni patologiche. Ancora una volta, con una certa sorpresa, questo lavoro ha rivelato una frequenza, titoli e distribuzione delle classi Ig comparabili in soggetti sani e malati. La sieroprevalenza, tuttavia, di tutti questi 24 AB era nettamente inferiore (<2%) in contrasto con NMDAR1-AB (fino a >20%) (27). Sorprendentemente, la classe Ig predominante non dipendeva dallo stato di salute o di malattia, ma dalla posizione dell’antigene, con epitopi intracellulari che predisponevano alle IgG (27). L’uguale distribuzione di questi altri 24 AB nella salute e nella malattia è meno sorprendente se si considera che sono stati riportati molteplici AB cerebrali nel siero di esseri umani sani e di diverse altre specie di mammiferi (38, 39), nonché abbondantemente nel CSF di casi di encefalite (40), anche se i rispettivi antigeni cerebrali non erano specificati. Per riassumere, gli antigeni cerebrali AB in generale e NMDAR1-AB in particolare sembrano essere parte di un repertorio autoimmune preesistente (37, 41-44) che guadagna significato (pato)fisiologico in condizioni di sintesi intratecale o BBB compromessa, per esempio, a seguito di lesioni, infezioni, infiammazione cerebrale, o predisposizione genetica alla perdita della BBB (aplotipo APOE4).

Conclusioni e raccomandazioni

Tutti gli NMDAR1-AB presenti naturalmente nel siero hanno ovviamente un potenziale patogeno. Per ragioni ancora ampiamente inesplorate, sono altamente frequenti (più di altri AB cerebrali finora identificati), e la loro prevalenza aumenta chiaramente con l’età. La sieropositività al NMDAR-AB da sola non giustifica assolutamente un trattamento immunosoppressivo. La rilevanza sindromica del siero NMDAR1-AB dipende dall’accessibilità al cervello, cioè dalla permeabilità della BBB. Inoltre, l’infiammazione cerebrale gioca probabilmente un ruolo cruciale nel determinare l’acutezza e la gravità della sindrome, come contribuito dal NMDAR1-AB circolante e ancora più pronunciato dalle rispettive plasmacellule che risiedono o potenzialmente migrano al cervello in condizioni infiammatorie per produrre AB a livello intratecale (40). Nell’ambiente infiammatorio, sono potenziati dall’esposizione all’epitopo e sperimentano il passaggio di classe a IgG (36). I risultati in individui con encefalite da herpes possono supportare ulteriormente questo punto di vista (22, 45).

Qualunque encefalite sottostante, sia essa infettiva, indotta da lesioni, genetica o “idiopatica”, può subire una sindrome prominente modellata dalla presenza di NMDAR1-AB nel senso di “encefalite di Dalmau” (7-10), che poi richiede una terapia immunosoppressiva oltre al trattamento dell’encefalite causale (se disponibile). Se l’NMDAR1-AB prodotto intratecalmente da solo, senza alcuna infiammazione preesistente sottostante, può causare “l’encefalite di Dalmau” rimane da determinare. In ogni caso di conseguenze sintomatiche altrimenti sospette di AB sierico diretto contro antigeni cerebrali in assenza di encefalite manifesta, dovrebbe essere valutata la perdita della BBB. Poiché il quoziente di albumina (impiegato come approssimazione clinica per diagnosticare la rottura della BBB) indica piuttosto il disturbo della barriera sangue-CSF e può non essere sempre patologico nei casi lievi di perdita della BBB (46-48), la determinazione aggiuntiva della rottura della BBB (globale o locale) con un nuovo metodo di risonanza magnetica (MRI) (47), che può essere stabilito come aggiunta alla RM di routine con contrasto, può rivelarsi utile per valutare la necessità e il beneficio soprattutto di interventi terapeutici immunosoppressivi estesi.

Contributi dell’autore

L’autore conferma di essere l’unico collaboratore di questo lavoro e lo ha approvato per la pubblicazione.

Dichiarazione di conflitto di interessi

L’autore dichiara che la ricerca è stata condotta in assenza di qualsiasi relazione commerciale o finanziaria che potrebbe essere interpretata come un potenziale conflitto di interessi.

Finanziamento

Questo lavoro è stato sostenuto dalla Max Planck Society, dalla Max Planck Förderstiftung, dalla DFG (CNMPB), EXTRABRAIN EU-FP7, e dalla Niedersachsen-Research Network on Neuroinfectiology (N-RENNT).