Abstract
Un paziente uremico ha sviluppato ipercalcemia dopo l’infezione da tubercolosi, e i suoi livelli di calcio ionizzato erano correlati ai livelli di 1,25-diidrossivitamina D3 (1,25(OH)2D3). Abbiamo eseguito ulteriori studi per determinare se i monociti sono siti alternativi di conversione della 1,25(OH)2D3 oltre alle cellule tubulari renali. Utilizzando un biotest ex vivo, in questo studio, abbiamo scoperto che l’attività della 1-α idrossilasi (CYP27B1) nei monociti è significativamente più alta nei pazienti con tubercolosi attiva (TB) rispetto a quelli con frequenti contatti con la TB. Tuttavia, quando i monociti dei pazienti con TB attiva sono stati ristimolati con l’antigene derivato dal Mycobacterium tuberculosis, è stata osservata una minore quantità di 1,25(OH)2D3. Al contrario, il livello di 1,25(OH)2D3 era invariato in quelli con frequenti contatti con la TBC. Concludiamo che i monociti possono essere una fonte alternativa di 1-α idrossilasi che potrebbe convertire la 25-idrossivitamina D3 nella più attiva 1,25(OH)2D3.
1. Introduzione
La tubercolosi ha afflitto il mondo fin dalla preistoria. Secondo un recente rapporto, un milione di pazienti soccombe annualmente alla tubercolosi e alle relative comorbidità. Negli ultimi decenni, sono stati fatti enormi sforzi per comprendere il processo fisiopatologico della malattia. Modelli animali e studi umani hanno aperto la strada al chiarimento delle risposte immunitarie individuali al Mycobacterium tuberculosis (MTB). Questi studi forniscono la prova che la vitamina D gioca un ruolo importante nella resistenza umana alla tubercolosi. La vitamina D è stata usata per combattere la tubercolosi per più di 200 anni. L’olio di fegato di merluzzo e il calciferolo, importanti fonti di vitamina D, sono stati utilizzati fin dal XVII secolo per trattare i pazienti affetti da tubercolosi. Nella fisiologia normale, dopo l’esposizione al sole, il 7-deidrocolesterolo immagazzinato nella pelle viene convertito in previtamina D3 seguita da isomerizzazione termica in vitamina D3. Successivamente, la vitamina D3 viene idrossilata nel fegato a 25-idrossivitamina D3 (25(OH)D3). Poi, la 25(OH)D3 è ulteriormente idrossilata nella forma più attiva della vitamina D3, 1,25(OH)2D3, dalla 1-idrossilasi (CYP27B1). Le cellule epiteliali tubulari renali sono una fonte importante di 1-idrossilasi e svolgono un ruolo critico nel determinare la concentrazione di 1,25(OH)2D3 nel siero. La presenza del CYP27B1 nei tessuti extrarenali è stata riconosciuta da decenni. L’impatto del CYP27B1 extrarenale sulla concentrazione sierica di 1,25(OH)2D3 deve ancora essere determinato.
Abbiamo incontrato un paziente di 34 anni con uremia che aveva ricevuto una regolare emodialisi per 2 anni. Il paziente ha sperimentato debolezza muscolare con affaticamento per 2 giorni prima di visitare un medico di famiglia. Gli esami ematochimici hanno rivelato elevati livelli di calcio ionizzato (5,44 mg/dl). Nonostante l’ipercalcemia, i sintomi del paziente sono stati alleviati dal trattamento convenzionale. Quattro mesi dopo, il paziente ha sperimentato una progressiva debolezza muscolare accompagnata da febbre. Al Pronto Soccorso, sono stati nuovamente notati elevati livelli di calcio ionizzato (6,88 mg/dl). Inoltre, un ECG ha rivelato un ritmo cardiaco anormale e un breve intervallo QT con onda T allargata. Una radiografia del torace ha mostrato un’infiltrazione polmonare del lobo superiore destro che è stata successivamente determinata come tubercolosi polmonare. Il paziente ha quindi ricevuto 9 mesi di trattamento antitubercolare. Quattro mesi dopo il trattamento, i livelli di calcio ionizzato del paziente si sono normalizzati (5.2 mg/dL), con una risoluzione completa dei sintomi. Per chiarire la patogenesi dell’ipercalcemia di questo paziente, abbiamo misurato i livelli di 1,25(OH)2D3 oltre ai livelli di calcio ionizzato. Come mostrato nella Figura 1, i livelli di 1,25(OH)2D3 erano altamente correlati a quelli del calcio ionizzato.
Cambiamenti nelle concentrazioni di calcio ionizzato e 1,25(OH)2D3 nel siero di un paziente con TB attiva e uremia.
Oltre all’espressione renale del CYP27B1, i macrofagi e i monociti sono considerati importanti siti extrarenali di espressione del CYP27B1. In questo studio, abbiamo valutato il ruolo dei monociti nel metabolismo della vitamina D3 utilizzando un biotest ex vivo. Inoltre, abbiamo stimolato i monociti con l’antigene derivato dalla MTB per ottenere ulteriori informazioni su come i monociti modulano il metabolismo della vitamina D3 in risposta alla sfida batterica.
2. Materiali e metodi
2.1. Popolazione di soggetti
Questo studio è stato eseguito presso la Kaohsiung Medical University. I partecipanti sono stati stratificati in due gruppi: (1) TB attiva e (2) contatto frequente con la TB. Quelli con tubercolosi polmonare attiva confermata da una coltura dell’espettorato e da una lastra del torace sono stati assegnati al gruppo TB attiva (). I contatti frequenti con la TB () includevano i seguenti: (1) personale medico che aveva lavorato al centro TBC per almeno 10 anni e non era mai stato infettato e (2) familiari di pazienti con TBC, medici e infermieri che avevano contatti a lungo termine con pazienti con TBC e non erano mai stati infettati. Tutti i contatti frequenti con la TBC erano stati vaccinati con BCG e sottoposti a una radiografia del torace annuale; quando le lastre del torace erano anormali, veniva eseguito un test di Mantoux. Abbiamo escluso i soggetti con diabete, malignità o qualsiasi altra malattia che potesse causare immunodeficienza. I due gruppi erano abbinati per sesso ed età (tabella 1).
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| La durata della malattia è stata definita come l’intervallo dalla diagnosi alla raccolta del sangue. La durata dell’esposizione è stata definita come l’intervallo dall’inizio del lavoro in un centro TBC alla raccolta del sangue. |
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2.2. Preparazione delle cellule
Le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) sono state isolate dal sangue trattato con eparina raccolto dai 2 gruppi di donatori usando un gradiente standard Ficoll-Paque (Pharmacia, Uppsala, Svezia). Le PBMC (cellule/mL) sono state risospese in un terreno RPMI 1640 integrato con L-glutamina e 10% di siero fetale di vitello. Dopo l’incubazione per 1 ora in un pallone di 75 cm2 in un incubatore umidificato a 37°C, 5% CO2, il mezzo contenente cellule non aderenti è stato decantato in una provetta conica, e il pallone è stato lavato due volte con mezzo privo di siero per rimuovere ogni residuo di cellule non aderenti. I monociti aderenti sono stati rimossi raschiando delicatamente con un raschietto di plastica. Le cellule sono state trasferite in una provetta conica, centrifugate per rimuovere la soluzione di lavaggio, e risospese a cellule/mL in mezzo integrato. La popolazione cellulare aderente conteneva più dell’85% di cellule CD14+.
2.3. Antigene
Il TB isolato da pazienti con tubercolosi è stato risospeso in soluzione salina a base di fosfato e ucciso a caldo in un bagno d’acqua a 70°C per 70 minuti. I batteri sono stati poi sonicati utilizzando un sonicatore New Highway (Farmingdale, NY, USA). La concentrazione proteica dell’omogeneizzato batterico è stata determinata utilizzando il kit Pierce BCA protein assay (IL, USA) e conservata a -20°C.
2.4. Analisi citofluorimetrica
L’analisi citometrica è stata eseguita utilizzando un citometro FACS (Becton Dickinson). Un totale di cellule sono state incubate con ogni anticorpo monoclonale in quantità saturante in 50 μL di tampone di colorazione (soluzione salina bilanciata di Hank: 1% BSA e 0,1% sodio azide) per 1 ora a temperatura ambiente e poi lavate tre volte con PBS. Le cellule sono state preparate per l’analisi mediante sospensione in 500 μL di paraformaldeide all’1% in PBS. La popolazione di monociti è stata gated per l’analisi sulla base di un lato-scatter e forward-scatter dot plot. Un totale di 5.000 cellule gated sono stati utilizzati per ogni analisi. Le cellule gated sono state ulteriormente analizzate mediante colorazione a fluorescenza utilizzando fluoresceina-isotiocianato- (FITC-) coniugato anti-CD14 (Ancell).
2.5. Quantificazione di 1,25(OH)2D3
I monociti purificati sono stati coltivati ad una densità di cellule/mL in 100 μL in ogni pozzetto di una piastra di coltura di tessuti a 96 pozzetti con 200 nM 25(OH)D3 sciolto in una concentrazione finale di 1% di etanolo. Dopo 3 ore di incubazione, 1 mL di acetonitrile è stato aggiunto per fermare la reazione. Le cellule e il mezzo sono stati raccolti e combinati con un volume uguale di metanolo per rimuovere i lipidi. La quantità di 1,25(OH)2D3 è stata determinata usando il kit 1,25-diidrossivitamina D 125I RIA (INCSTAR, Stillwater, MN, USA). In breve, 2 mL di acqua e 5 mL di metanolo/acqua (70 : 30) sono stati aggiunti a una cartuccia C18OH per rimuovere sali, lipidi polari e pigmenti sotto vuoto. Poi, 5 mL di esano/cloruro di metilene (90 : 10) sono stati aggiunti alla cartuccia C18OH per rimuovere 25(OH)D3, e 5 mL di esano/isopropanolo (99 : 1) sono stati aggiunti per rimuovere 24,25(OH)2D3/25,25(OH)2D3. Ciascuna cartuccia C18OH è stata inserita a tenuta stagna all’interno di una cartuccia di silice. Dopo aver aggiunto esano/isopropanolo (92 : 8) sotto vuoto, la cartuccia C18OH è stata rimossa. Infine, l’1,25(OH)2D3 purificato è stato eluito dalla cartuccia di silice in 5 mL di esano/isopropanolo (80 : 20). I livelli di 1,25(OH)2D3 sono stati quantificati mediante saggio radioimmunologico competitivo (RIA) utilizzando anticorpi anti-1,25(OH)2D3 e anti-1,25(OH)2D3 marcati con 125I.
2.6. Trattamento con antigeni MTB
I monociti (cellule/mL) sono stati incubati con 10 μg/mL MTB e 200 ng/mL 25(OH)D3. Dopo 3 ore di incubazione, è stato aggiunto 1 mL di acetonitrile per fermare la reazione. L’1,25(OH)2D3 risultante è stato purificato dalle cellule e dal mezzo e quantificato mediante RIA. Il resto della procedura è stato lo stesso del saggio precedente.
2.7. Analisi statistica
Tutti i dati sono stati analizzati utilizzando il test di Student.
3. Risultati
3.1. Concentrazioni di calcio ionizzato e 1,25 Diidrossivitamina D3 in un paziente con TB attiva e uremia
Il calcio ionizzato nel siero e la 1,25(OH)2D3 sono stati determinati in diversi momenti dalla prima visita a un anno dopo il completamento del trattamento antitubercolare. Come mostrato nella Figura 1, i livelli di calcio ionizzato erano correlati alla concentrazione di 1,25(OH)2D3 (Figura 1).
3.2. Popolazione dello studio
Ventiquattro persone sono state reclutate nel gruppo dei contatti frequenti con la TB e 25 pazienti nel gruppo della TB attiva. L’età media e il rapporto tra i sessi non differivano significativamente tra i gruppi. Le caratteristiche del set di dati sono presentate nella tabella 1.
3.3. Quantitazione di 1,25(OH)2D3
I monociti sono stati coltivati con 25(OH)D3 per 3 ore. Poi, l’1,25(OH)2D3 è stato purificato dalle cellule e dal mezzo e misurato tramite RIA. Come mostrato nella Figura 2, la quantità di 1,25(OH)2D3 nel gruppo con TB attiva era pg/mL (media ± SD), che era significativamente più alta di quella nel gruppo con contatto frequente con la TB () (). Quando i monociti sono stati incubati simultaneamente con MTB e 25(OH)D3 per 3 ore, la quantità di 1,25(OH)2D3 nel gruppo con TB attiva è diminuita significativamente rispetto a quella senza MTB ( e , resp.) () (vedi Figura 3). Non c’era alcuna differenza tra i monociti con o senza esposizione a MTB nel gruppo di contatto frequente TB ( e , resp.).
Quantitazione di 1,25(OH)2D3 in pazienti con TB attiva e contatti frequenti TB. Misurazione RIA di 1,25(OH)2D3 purificata da sospensioni di monociti coltivati con 25(OH)D3 per 3 ore. La quantità di 1,25(OH)2D3 nel gruppo con TBC attiva era significativamente più alta di quella del gruppo con contatti frequenti di TBC. Ogni colonna rappresenta la media della quantificazione di 1,25(OH)2D3. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard. *.
Quantitazione di 1,25(OH)2D3 in pazienti con TB attiva e contatti frequenti di TB con o senza antigene M. tuberculosis (MTB). I monociti sono stati pulsati con 25(OH)D3 con o senza MTB. La quantità di 1,25(OH)2D3 con esposizione a MTB è diminuita significativamente rispetto a quella senza MTB nel gruppo con TB attiva. Ogni colonna rappresenta la media della quantificazione di 1,25(OH)2D3. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard. *.
4. Discussione
Abbiamo osservato che i livelli di 1,25(OH)2D3 erano correlati ai livelli di calcio ionizzato in un paziente uremico con tubercolosi polmonare. Nella tubercolosi polmonare attiva, i livelli sierici di 1,25(OH)2D3 in questo paziente erano alti, che a loro volta inducevano alti livelli di calcio ionizzato. Dopo il trattamento, sia i livelli di 1,25(OH)2D3 che di calcio ionizzato sono diminuiti. Teoricamente, in un paziente uremico, l’attività renale del CYP27B1 è banale. Bassi livelli sierici di 1,25(OH)2D3 sono spesso osservati nei pazienti uremici. Coerentemente con quanto osservato negli esseri umani, in un modello di topo anefrico, si osservano anche bassi livelli di 1,25(OH)2D3. Tuttavia, una fonte extrarenale di CYP27B1 è stata descritta per più di 6 decenni. Harrell e Fisher sono stati tra i primi a trovare la sintesi extrarenale di 1,25(OH)2D3 in condizioni patologiche. Questi autori hanno stabilito l’associazione tra omeostasi del calcio disregolata e sarcoidosi. I macrofagi tissutali hanno poi dimostrato di essere una fonte extrarenale di produzione di 1,25(OH)2D3 in questi gruppi di pazienti. Un numero crescente di tessuti è stato trovato per esprimere CYP27B1 da diversi gruppi di studio, come i melanociti della pelle, i macrofagi dei tessuti e le cellule residue della placenta. Sorprendentemente, non tutte le cellule che esprimono CYP27B1 possiedono attività enzimatica. Per chiarire il potenziale dei monociti circolanti di contribuire ad alti livelli di 1,25(OH)2D3, abbiamo utilizzato un biotest ex vivo utilizzando 25(OH)D3 come substrato per determinare l’attività del CYP27B1. I nostri risultati dimostrano che l’attività del CYP27B1 nei monociti di pazienti con TBC attiva è significativamente più alta di quella nei monociti di individui con frequenti contatti con la TBC. I monociti circolanti contribuiscono alla conversione di 25(OH)D3 nel più attivo 1,25(OH)2D3. Curiosamente, la vitamina D3 era tradizionalmente considerata un fattore endocrino; la 1,25(OH)2D3 prodotta in siti locali (tubuli renali) è trasportata dal sangue per influenzare altri tessuti o organi, per esempio l’osso. Tuttavia, negli ultimi decenni, è stato dimostrato che la vitamina D3 svolge ruoli diversi dalle funzioni endocrine. La 1,25(OH)2D3 prodotta dalle cellule infiammatorie può stimolare l’espressione del recettore della vitamina D sia nelle cellule vicine che nelle cellule infiammatorie stesse. Legandosi al recettore della vitamina D e al recettore dei retinoidi, il complesso ligando-recettore può legarsi ai promotori di molti geni infiammatori. A causa di questi effetti, la vitamina D3 è stata considerata avere sia funzioni paracrine che autocrine. In contrasto con la funzione endocrina della vitamina D3 come regolatore del calcio, le sue funzioni paracrine e autocrine inducono le cellule infiammatorie a produrre peptidi antibatterici e ad aumentare il processo di autofagia. Poiché l’1,25(OH)2D3 viene prodotto localmente e non viene trasportato ai siti bersaglio per la regolazione dell’omeostasi del calcio, la sua produzione non influisce sui livelli di calcio nel siero. È interessante notare che in questo studio abbiamo scoperto che l’1,25(OH)2D3 prodotto dai monociti è un caso speciale. Anche se l’1,25(OH)2D3 prodotto dai monociti può agire localmente, queste cellule sono trasportate dal sangue ai tessuti di tutto il corpo. L’1,25(OH)2D3 prodotto dai monociti si comporta anche come un fattore endocrino. I monociti possono essere le uniche cellule del nostro corpo che possono orchestrare le funzioni endocrine, paracrine e autocrine della vitamina D3. Una questione interessante è quale sia il contributo relativo della fonte monocitaria di 1,25(OH)2D3 al livello totale di 1,25(OH)2D3. Dusso et al. hanno osservato che la produzione massima di 1,25(OH)2D3 dai monociti è banale (in fmole/ora/microgramma di DNA) rispetto alla concentrazione di 1,25(OH)2D3 nel normale (in pmol/mL). Ma i dati provengono da un esperimento ex vivo, non sappiamo quanti monociti nel corpo sono stimolati a produrre 1,25(OH)2D3. Noi ipotizziamo che il contributo relativo della fonte monocitaria di 1,25(OH)2D3 al livello totale di 1,25(OH)2D3 sia piccolo nella maggior parte delle circostanze. Anche nei pazienti con malattia granulomatosa, solo pochi di loro hanno sintomi clinici di ipercalcemia derivanti da un alto livello di 1,25(OH)2D3. Il nostro caso indicatore è uno di questi.
Abbiamo anche trovato che quando i monociti di pazienti con TBC attiva sono coltivati con l’antigene MTB, la conversione 1,25(OH)2D3 è significativamente inferiore rispetto a quando non viene aggiunto alcun antigene. Nel gruppo dei contatti frequenti con la TBC, non c’era alcuna differenza tra l’essere con o senza antigene MTB. Ci sono due possibili spiegazioni per questa osservazione. In primo luogo, i monociti adescati da pazienti con TBC attiva possono indurre una maggiore attività della 24(OH) idrossilasi (CPY24) rispetto alle loro controparti, che idrossila attivamente la 1,25(OH)2D3 in acido calcitroico, quando sono ulteriormente stimolati con l’antigene MTB. la vitamina D3 induce non solo prodotti genici infiammatori ma anche l’espressione della CPY24 . CPY24 è un importante enzima catabolico della vitamina D3. Le attività di CYP27B1 e CYP24 sono modulate in modo diametralmente opposto per controllare i livelli sierici di 1,25(OH)2D3 . Grazie a questa azione concertata, l’ipercalcemia è raramente osservata nei pazienti. Il gruppo con contatto frequente con la TBC ha dimostrato un’azione concertata ancora migliore, motivo per cui non c’è stato alcun cambiamento nella conversione di 1,25(OH)2D3 dopo la stimolazione con l’antigene MTB. Una seconda spiegazione è che l’attività di CPY27B1 si esaurisca quando i monociti vengono ristimolati con l’antigene MTB.
L’espressione del mRNA non è stata determinata in questo studio per i seguenti motivi. In primo luogo, un gran numero di monociti dei partecipanti era necessario per il biotest ex vivo. Se avessimo eseguito sia l’espressione quantitativa dell’mRNA che il biotest ex vivo, avremmo dovuto raccogliere più di 30 mL di sangue da ogni partecipante. La raccolta di questo volume di sangue è stata respinta dal nostro comitato etico. In secondo luogo, come indicato in precedenza, alcuni tessuti possono esprimere CYP27B1 senza attività enzimatica rilevabile. I livelli di mRNA non sono sempre correlati all’attività enzimatica. Nonostante l’espressione del CYP27B1 in alcuni tessuti, non è stata rilevata alcuna attività enzimatica. In studi futuri, i livelli di CYP27B1 e CYP24 e i metaboliti della vitamina D3, come l’acido calcitroico e 24,25(OH)2D3, dovrebbero essere quantificati per chiarire il metabolismo della vitamina D3 nel processo fisiopatologico della tubercolosi.
5. Conclusione
In conclusione, i livelli di calcio erano correlati ai livelli di 1,25(OH)2D3 in un paziente uremico infettato dalla tubercolosi. Inoltre, abbiamo scoperto che l’attività CYP27B1 nei monociti è più alta tra i pazienti con tubercolosi attiva rispetto a quelli con frequenti contatti con la TB.
Approvazione etica
Questo progetto di studio è stato approvato dall’Institutional Review Board del Kaohsiung Medical University Hospital. Il numero di approvazione è KMUH-IRB-20130103.
Coflitto di interessi
Gli autori dichiarano che non c’è conflitto di interessi per questo articolo.
Contributo degli autori
Yi-Ching Tung e Wen-Chan Tsai hanno eseguito gli esperimenti e scritto l’articolo. Tsan-Teng Ou e Wen-Chan Tsai hanno progettato lo studio e raccolto i campioni. Tutti gli autori hanno letto e approvato il documento finale.