Cos’è il sequenziamento in tempo reale a singola molecola (SMRT)?

Dr. Maho Yokoyama, Ph.D.Reviewed by Christian Zerfaß, Ph.D.

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• How does SMRT Sequencing Work?
• Studiare la metilazione del DNA nei batteri; un’applicazione del sequenziamento SMRT

Il sequenziamento del DNA funziona usando la DNA polimerasi per aggiungere nucleotidi a un modello. Ci sono diverse tecnologie disponibili per il sequenziamento del DNA. Un esempio è il sequenziamento Single-Molecule Real-Time, o sequenziamento SMRT.

Ricercatore che esamina il vetrino trasparente della sequenza del DNA. Credit: Shawn Hempel /

Come funziona il sequenziamento SMRT?

Come per altre tecnologie di sequenziamento del DNA, il primo passo dopo l’estrazione del DNA è quello di preparare una “libreria”. Questo processo prepara il DNA per il sequenziamento; in questo caso, gli adattatori vengono aggiunti ad entrambe le estremità di una molecola di DNA a doppio filamento, il che effettivamente permette al DNA di diventare un template circolare a filamento singolo. Questo significa che il DNA può essere sequenziato continuamente.

Questa libreria di DNA, o DNA modello, viene poi messa in un sequenziatore di DNA che contiene “guide d’onda a modalità zero” che hanno la DNA polimerasi immobilizzata ad una estremità. Una singola molecola di DNA viene immobilizzata in queste guide d’onda zero-mode, e la DNA polimerasi inizia ad aggiungere nuovi nucleotidi ad un filamento di DNA sintetizzato de novo e complementare al DNA modello. Le basi di questi nucleotidi sono etichettate, e l’incorporazione di queste basi nel filamento di DNA in crescita causa l’emissione di luce. Questa emissione di luce viene poi letta in tempo reale, e dato che l’emissione di ogni base è diversa, questo permette di identificare la base specifica.

Il vantaggio principale del sequenziamento SMRT è la generazione di lunghe letture di sequenziamento di alta precisione, che migliora l’assemblaggio di interi genomi. Questo perché le letture di sequenziamento più lunghe significano meno “costruzione” necessaria per assemblare il genoma.

Studio della metilazione del DNA nei batteri; un’applicazione del sequenziamento SMRT

Che cos’è la metilazione del DNA?

L’aggiunta di un gruppo metile al DNA, nota anche come metilazione, avviene in tutti i regni della vita. Ci sono tre nucleotidi metilati presenti nei batteri; m5C (C5-metil-citosina, presente anche negli eucarioti), m6A (N6-metil-adenina) e m4C (N4-metil-citosina, presente solo nei batteri). La metilazione avviene dopo la sintesi di nuovi filamenti di DNA, e avviene in nucleotidi specifici.

I gruppi metilici fuoriescono dalla doppia elica del DNA, e quindi possono influenzare il legame tra il DNA e le proteine leganti il DNA. Questo a sua volta ha un impatto sui processi tra cui la replicazione dei cromosomi, la riparazione del DNA mismatch, così come la tempistica della trascrizione dei geni e la formazione dei lignaggi epigenetici.

Meccanismi epigenetici: la metilazione o l’acetilazione del dna può attivare o meno la trascrizione genica. Image Credit: ellepigrafica /

Perché la metilazione del DNA è importante nei batteri?

I batteri sono infettati da virus, quindi hanno bisogno di un meccanismo di protezione per superare le infezioni virali. È qui che entrano in gioco i sistemi di restrizione-modificazione; questo sistema è composto da un enzima di restrizione, che rompe il DNA in siti specifici, e una DNA metiltransferasi, che aggiunge un gruppo metile all’adenina (A) o alla citosina (C).

Nella maggioranza dei sistemi di restrizione-modificazione, la DNA metiltransferasi agisce per proteggere il DNA batterico dall’enzima di restrizione. La presenza della DNA metiltransferasi significa che il DNA batterico viene metilato, mentre il DNA virale infettante non lo è. Questo a sua volta significa che il DNA virale viene degradato dall’enzima di restrizione, mentre il DNA batterico è protetto perché l’enzima di restrizione non agisce sul DNA metilato. Tuttavia, va notato che ci sono enzimi di restrizione che agiscono sul DNA modificato.

Studi recenti hanno suggerito che ci possono essere ulteriori ruoli per i sistemi di restrizione-modificazione. Per esempio, l’eliminazione di alcuni sistemi di restrizione-modificazione ha portato a un cambiamento nell’espressione genica, che è legata alla differenza nella metilazione del DNA. I sistemi di restrizione-modificazione possono anche causare rotture a doppio filamento e mutazioni C-T, influenzando così l’evoluzione dei batteri. Più recentemente, sono state sviluppate tecnologie in grado di determinare la metilazione di un intero genoma batterico, noto come “metiloma”.

Come si determina il metiloma usando il sequenziamento SMRT?

Poiché il sequenziamento SMRT dà risultati in tempo reale, può essere usato per rilevare le modifiche del DNA, comprese le metilazioni. La DNA polimerasi incorpora nucleotidi ad un tasso costante, ma questo tasso può essere cambiato se il nucleotide nel template è stato modificato. Questo può essere notato durante il processo di sequenziamento.

Blow al. ha usato il sequenziamento SMRT per mappare le modifiche del DNA in 230 microrganismi. Le modifiche cercate includevano m5C, m6A e m4C. Gli autori hanno scoperto che il 93% di questi microrganismi ha mostrato metilazione del DNA, e hanno anche trovato 834 motivi che erano metilati. Questo ha permesso agli autori di identificare quali motivi sono i bersagli per 620 metiltransferasi del DNA.

Interessante, gli autori hanno notato che mentre il 48% degli organismi studiati aveva una metiltransferasi del DNA, non c’erano prove che fosse presente anche un enzima di restrizione. Pertanto, è possibile che la metilazione del DNA giochi un ruolo importante nella regolazione del genoma, o un altro ruolo importante nei microrganismi che deve ancora essere identificato.

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Scritto da

Dr. Maho Yokoyama

Dr. Maho Yokoyama è un ricercatore e scrittore scientifico. Ha ottenuto il suo dottorato di ricerca presso l’Università di Bath, Regno Unito, dopo una tesi nel campo della microbiologia, dove ha applicato la genomica funzionale allo Staphylococcus aureus . Durante i suoi studi di dottorato, Maho ha collaborato con altri accademici su diversi articoli e ha anche pubblicato alcuni dei suoi lavori in riviste scientifiche peer-reviewed. Ha anche presentato il suo lavoro in conferenze accademiche in tutto il mondo.

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