Ciclo GroEL/GroES: L’ATP si lega ad un anello aperto prima della proteina substrato favorendo il legame della proteina e la produzione dello stato nativo

Risultati

Rapido legame di ATP a GroEL come rivelato dai cambiamenti di intensità di fluorescenza di GroEL F44C etichettato con Oregon Green 488.

Per monitorare il legame di ATP da parte di GroEL, ci siamo basati su una variante di GroEL prodotta in precedenza, F44C, contenente una singola cisteina in una versione altrimenti “cisteina-zero” di GroEL in cui tutte le 3 cisteine naturali nella subunità GroEL (aminoacidi 138, 458 e 519) sono state sostituite con alanina (21). Come illustrato nella Fig. 1A, F44 si trova in un loop che punta verso l’alto nella cavità centrale di GroEL a livello del dominio equatoriale, posizionato tra β-fili equatoriali antiparalleli vicino alle cui estremità ci sono residui che formano contatti di legame a idrogeno con il fosfato terminale dell’ATP legato attraverso una molecola d’acqua e uno ione potassio. Il loop e il residuo 44 sono quindi disposti ad essere influenzati dall’assenza o dalla presenza di ATP. Uno studio precedente ha riportato che una sostituzione F44W potrebbe riferire sul legame con l’ATP (16). Qui, abbiamo usato il mutante F44C, che era stato precedentemente osservato essere pienamente funzionale, come indicato dalla capacità del suo plasmide codificante di salvare la crescita di un mutante carente di GroEL e dalla capacità della proteina purificata di effettuare un efficiente refolding proteico ATP/GroES-dipendente in vitro (21). F44C è stato marcato con Oregon Green 488 (OG488)-maleimide ad un livello di occupazione del ≈70%. È rimasto pienamente funzionale nel mediare il refolding della malato deidrogenasi (MDH) in vitro, esibendo una cinetica quasi identica a quella di WT GroEL. Il tasso di stato stazionario di ATP turnover dal mutante modificato, chiamato EL44-OG, anche assomigliava a quello di WT GroEL (Fig. S1B).

Spettri di emissione in fluorescenza di EL44-OG (eccitato a 496 nm) hanno rivelato che l’aggiunta di ATP ha prodotto un grande calo di intensità di fluorescenza allo stato stazionario (≈65% in 500 μM ATP), accompagnato da un piccolo spostamento blu del massimo di emissione (Fig. 1B). Al contrario, l’ADP ha prodotto un minore calo di intensità, sostenendo che il γ-fosfato dell’ATP ha un effetto specifico sulla conformazione del ciclo 44-containing.

Su stopped-flow miscelazione di 0,5 mM ATP con EL44-OG, un rapido calo di intensità di emissione è stato osservato, con una curva che potrebbe essere adatto come la somma di 2 esponenziali, uno con una costante di tasso di ≈100 s-1 e un altro con una costante di tasso di 4 s-1 (Fig. 1C). Il primo tasso indica una rapida interazione di ATP con GroEL unliganded e corrisponde ai tassi riportati in precedenza sia per F44W (rif. 16; 80 ± 5 s-1) e per 2 altre versioni triptofano-sostituito di GroEL: Y485W, dove un triptofano è stato sostituito altrove nel dominio equatoriale (rif. 18; 123 ± 2 s-1), e R231W (rif. 17; 80 s-1), dove un triptofano è stato sostituito nell’aspetto rivolto alla cavità del dominio apicale (GroEL è altrimenti privo di triptofano). Come previsto, il tasso di interazione dell’ATP con EL44-OG era dipendente dalla concentrazione di ATP (Fig. 1D), e una costante di velocità bimolecolare di 2 × 105 M-1 s-1 è stata determinata per la fase più veloce. La fase cinetica più lenta, anche dipendente dalla concentrazione di ATP, corrisponde probabilmente alla terza fase fluorescente osservata per R231W e Y485W di GroEL sul legame ATP (17, 18). La possibilità che questa fase rifletta l’idrolisi dell’ATP è stata esclusa impiegando una chaperonina D398A/EL44-OG con difetto di idrolisi.

Cambiamento di fluorescenza equamente rapido sul legame dell’ATP all’anello trans aperto del complesso asimmetrico GroEL/GroES/ADP.

In condizioni fisiologiche, il normale stato di accettazione dell’ATP è l’anello trans aperto di un complesso GroEL/GroES/ADP asimmetrico. Con la miscelazione a flusso fermo, abbiamo osservato che il tasso di legame di ATP all’anello trans dei complessi EL44-OG/GroES/ADP era simile a quello di un anello GroEL non legato (Fig. 1E, confrontare con Fig. 1F). Qui, c’era anche una dipendenza dalla concentrazione di ATP simile a quella di EL44-OG non legato (Fig. 1D).

Il polipeptide substrato legato all’anello trans non influenza il tasso di legame di ATP.

In una serie di studi in vitro, il polipeptide non nativo è stato prima complessato all’anello trans aperto di un complesso asimmetrico ADP GroEL/GroES prima di aggiungere ATP e GroES in eccesso (8, 9). In queste condizioni, il legame dell’ATP seguito dal legame di GroES è chiaramente in grado di incapsulare il polipeptide non nativo e dirigere il ripiegamento produttivo. Il tasso di legame dell’ATP in un tale contesto è influenzato dalla proteina substrato legata? Per testare questo, MDH non nativo è stato legato ai complessi asimmetrici EL44-OG/GroES/ADP, e l’ATP è stato poi aggiunto con miscelazione a flusso fermo. In queste condizioni, il tasso di variazione dell’intensità di fluorescenza era praticamente identico a quello del complesso EL44-OG/GroES/ADP in assenza di polipeptide (confrontare Fig. 1G con Fig. 1E). Quindi, la presenza di un substrato non nativo legato ai domini apicali dell’anello trans non ha alcun effetto rilevabile sul rapido ingresso di ATP nelle tasche di legame del nucleotide equatoriale dell’anello trans.

Il rapido movimento del dominio apicale accompagna il legame di ATP.

Quando l’ATP si lega rapidamente a GroEL, questo provoca un aggiustamento significativo nei domini leganti il polipeptide apicale sulla stessa rapida scala temporale, o i cambiamenti apicali in risposta al legame dell’ATP sono relativamente lenti, così che gli effetti del legame dell’ATP devono essere considerati come avvenuti in un momento successivo? Lo studio precedente di R231W aveva già indicato che gli effetti apicali si verificavano rapidamente con quel mutante (17). Anche nel presente studio, una sonda fluorescente sull’aspetto esterno dei domini apicali, a distanza dal sito di legame dell’ATP all’interno del cilindro (GroEL E315C in uno sfondo cisteina-zero etichettato con OG), ha mostrato un rapido cambiamento di intensità di fluorescenza, sulla stessa scala temporale del legame dell’ATP. Per esempio, una costante di tasso di 20 s-1 è stata osservata per un complesso asimmetrico GroEL315-OG/GroES/ADP ad una concentrazione di ATP di 150 μM (Fig. 1H, confrontare con 25 s-1 in Fig. 1E). Tali cambiamenti apicali si sono verificati nello stesso anello a cui è legato l’ATP, perché l’analisi di un OG-modificato versione singolo anello di E315C, SR315-OG, ha mostrato un tasso simile di cambiamento di intensità di fluorescenza (Fig. 1I). Il tasso di movimento apicale era anche ATP concentrazione-dipendente, con i tassi paralleli a quelli di ATP vincolante (Fig. S2, confrontare con Fig. 1D).

Lento legame relativamente di polipeptide substrato come misurato da FRET.

Per consentire un confronto del tasso di legame polipeptide substrato non nativo con quella di ATP vincolante, abbiamo poi misurato il tasso di legame delle proteine substrato per GroEL asimmetrico / GroES / ADP complessi utilizzando FRET. Sono state studiate tre diverse proteine substrato: MDH (33 kDa), Rubisco (51 kDa), e una forma doppiamente mutante della proteina legante il maltosio (DM-MBP; 41 kDa). Tutte e 3 le proteine si comportano come proteine substrato rigorose a 25 °C, richiedendo la presenza di GroEL, GroES e ATP per raggiungere la forma nativa (3). In loro assenza, aggregazione quantitativa deriva. Per il monitoraggio di legame, FRET è stata misurata tra la proteina substrato etichettato con cumarina propil maleimide (CPM; donatore) su un residuo di cisteina (vedi materiali e metodi) e EL44-OG (accettore). Eccitando al massimo di eccitazione per CPM (384 nm), gli spettri di emissione sono stati raccolti per il CPM (donatore) – substrati etichettati mentre legato a GroEL non etichettato (Fig. 2A, DM-MBP-CPM come esempio, traccia nera), per EL44-OG complessato con substrato non etichettato (Fig. 2A, accettore etichettato, traccia blu), o per i complessi con CPM-etichettato substrato legato a EL44-OG (Fig. 2A, traccia rossa). Sia per DM-MBP-CPM che per MDH-CPM, c’era un forte quenching del donatore sull’associazione con EL44-OG; allo stesso tempo, c’era la comparsa di un sostanziale segnale dell’accettore.

Su stopped-flow miscelazione di 125 nM DM-MBP-CPM con 125 nM EL44-OG, un calo di intensità di emissione donatore è stato osservato, con una curva che potrebbe essere adatto come la somma di 2 esponenziali, uno con una costante di tasso di 1,33 s-1 e l’altro con una costante di tasso di 0,65 s-1 (Fig. 2B). Il tasso più veloce (k1) era dipendente dalla concentrazione di chaperonin (Fig. 2C), ma quello più lento non lo era. Ad una concentrazione di GroEL di 125 nM (Fig. 2B), il tasso di legame del polipeptide substrato (k1 = 1,33 s-1) è 60 volte più lento del tasso di legame ATP (100 s-1 a 500 μM ATP; Fig. 1C). Anche se il tasso di legame del substrato sarebbe previsto per essere diverse volte maggiore alla concentrazione fisiologica GroEL di 1-2 μM (Fig. 2C), il tasso di legame ATP sarebbe anche probabilmente un po ‘più grande, considerando che la concentrazione fisiologica ATP è diversi millimolari (Fig. 1D). Così, il tasso di arrivo ATP in condizioni fisiologiche è probabile che sia almeno 10 volte maggiore di arrivo substrato.

In un ulteriore test, l’aggiunta di ATP al tempo stesso come fluorescentemente marcato DM-MBP ha avuto un effetto riproducibile di aumentare il tasso di DM-MBP legame (Fig. 2D e Tabella S2). In sintesi, l’ordine fisiologico di aggiunta a un anello trans sembra comprendere l’arrivo rapido di ATP seguito dall’arrivo più lento della proteina substrato. Questo ordine è opposto a quello programmato in studi recenti, dove il polipeptide è stato inizialmente legato all’anello trans e ATP è stato poi aggiunto (8, 9). L’ordine di aggiunta ha qualche effetto misurabile sul refolding della proteina substrato? Per testare questo, abbiamo effettuato esperimenti di ordine di aggiunta e misurato il recupero dell’enzima nativo in condizioni essenzialmente a rotazione singola.

Maggiore recupero dello stato nativo quando l’ATP viene aggiunto per primo, seguito dal polipeptide, rispetto all’ordine opposto.

Un esperimento di ordine di aggiunta è stato effettuato utilizzando la versione ad anello singolo di GroEL, SR1, consentendo un’analisi “a giro singolo”. Il polipeptide catturato da SR1 è quasi quantitativamente ripiegato in forma nativa, dopo il legame di GroES, all’interno della cavità cis a lunga durata del complesso stabile SR1/GroES (10, 11). Così, SR1 potrebbe essere incubato con ATP e polipeptide non nativo in entrambi gli ordini, seguita da aggiunta di GroES, e il grado di recupero della proteina nativa potrebbe essere misurato in relazione sia all’ordine di aggiunta e l’intervallo tra le aggiunte (Fig. 3A). Per questi test, GroES è stato aggiunto 2 secondi dopo ATP / polipeptide per consentire il completamento delle interazioni iniziali. In un primo esperimento, abbiamo riproducibilmente osservato che quando Rubisco non nativo è stato aggiunto prima seguita 2 secondi dopo da ATP, il grado di recupero Rubisco in forma nativa era solo ≈30%. Questo rispetto al >60% di recupero quando ATP è stato aggiunto per primo e con il ≈70% di recupero osservato quando ATP e GroES sono stati aggiunti a un complesso binario Rubisco-SR1 preformato (prodotto da un’incubazione di 10 minuti di Rubisco non nativa con SR1). Questo suggerisce che nel contesto di una reazione ciclica in cui l’anello trans di un complesso GroEL/GroES/ADP accettore è aperto e disponibile per legare il polipeptide solo per ≈1-2 s prima che GroES si leghi, la mobilizzazione dei suoi domini apicali da un rapido legame di ATP favorisce il legame del polipeptide non nativo. L’ordine opposto, l’aggiunta del polipeptide 2 s prima dell’ATP, sembra essere meno favorevole per il legame, anche se i domini apicali mobilizzati dall’ATP sono successivamente disponibili per 2 s prima dell’aggiunta di GroES. In particolare, quando l’intervallo tra le aggiunte di Rubisco e ATP è stato aumentato a 4 s (Fig. 3A), l’ordine-di-aggiunta effetto è stato sollevato, con la cinetica e l’estensione del recupero ora pari a quelli di aggiungere ATP prima, presumibilmente una funzione di più ampio legame polipeptide durante l’intervallo prima aggiunta ATP. Anche se l’estensione del recupero di Rubisco negli studi sull’ordine di aggiunta con un intervallo di 2-s era significativamente influenzato, la cinetica del recupero dello stato nativo all’interno dei complessi SR1/GroES stabili era simile, coerente con un effetto sul legame della proteina substrato e non sul tasso di ripiegamento nella camera incapsulata.

Binding più esteso di Rubisco con ATP aggiunto prima.

Per affrontare l’effetto dell’ordine di aggiunta sul legame della proteina substrato, abbiamo usato Rubisco marcato con 35S e misurato la quantità che è stata legata da SR1 durante le incubazioni per ordine di aggiunta utilizzando la filtrazione su gel delle miscele del prodotto finale per separare i complessi stabili SR1/GroES/Rubisco dal polipeptide non legato. Questo ha rivelato che ≈10.000 cpm 35S-Rubisco aveva legato quando 40.000 cpm 35S-Rubisco (125 nM) è stato aggiunto 2 secondi prima di ATP e che ≈30.000 cpm aveva legato quando ATP è stato aggiunto 2 secondi prima Rubisco (Fig. 3B). Quest’ultimo grado di legame è stato raggiunto anche quando SR1-Rubisco complessi binari formati in un periodo di 10 min sono stati poi incubati con ATP e GroES insieme (Fig. 3B). Queste misurazioni dell’entità del legame del substrato quindi parallelo l’entità del recupero di attività enzimatica (confrontare Fig. 3B con Fig. 3A) e sostenere la conclusione che nel contesto di un 2-s intervallo tra l’aggiunta di ATP / polipeptide, l’aggiunta di ATP inizialmente favorisce più efficiente legame proteina substrato.

Maggiore tasso di legame di Rubisco a un anello di chaperonin esposto all’ATP.

La precedente osservazione di una maggiore estensione del legame di Rubisco in un esperimento di ordine di aggiunta in cui l’ATP viene aggiunto inizialmente suggerisce che il tasso di associazione di Rubisco con domini apicali ATP-mobilizzati potrebbe essere maggiore. Per testare questo, una versione ATP idrolisi-difettosa D398A di SR1 con OG attaccato a una cisteina sostituita in posizione 44 (in uno sfondo C138A) è stato utilizzato per segnalare da FRET sul tasso di legame di CPM-marcato Rubisco (Fig. 3 C-E). Abbiamo osservato che il tasso di legame Rubisco, effettuata con le stesse condizioni come il precedente ordine di aggiunta esperimenti, è stato 2 volte maggiore in presenza vs assenza di ATP (confrontare Fig. 3D con Fig. 3C). Quando ATP e Rubisco non nativo sono stati aggiunti contemporaneamente, riflettendo la situazione fisiologica, il tasso di legame Rubisco assomigliava a quello quando ATP era stato aggiunto prima Rubisco (Fig. 3E, confrontare con Fig. 3D). Questi dati sostengono che Rubisco si associa più rapidamente con un anello i cui domini apicali sono stati ATP-mobilizzati e che, in condizioni fisiologiche in cui sono presenti sia ATP che substrato non nativo, sono i domini apicali ATP-mobilizzati che sono operativi nel legame del substrato.