RECETTORE
Il recettore dell’eritropoietina è stato clonato con una strategia di espressione da una libreria di cDNA di cellule eritroleucemiche murine (D’Andrea et al., 1989). Il gene umano del recettore dell’eritropoietina è localizzato sul cromosoma 19p (Winkelman et al., 1990). Ci sono otto esoni e sette introni, che codificano un peptide di 507 aminoacidi con un peso molecolare di 66 kDa. Nel gene umano, gli esoni 1-5 codificano il dominio extracellulare di 251 aminoacidi, l’esone 6 una regione a-elica che attraversa la membrana di 20 aminoacidi, e gli esoni 7-8 il dominio citoplasmatico di 236 aminoacidi (Youssoufian et al., 1993). Il recettore umano dell’eritropoietina non ha siti di glicosilazione N-linked, ma un’alta frequenza di residui di serina e treonina (Jones et al., 1990). C’è un’identità dell’82% tra l’eritropoietina umana e quella murina. Il cross-linking dell’eritropoietina alla superficie cellulare delle cellule eritroidi ha rivelato due molecole accessorie di 85 e 100 kDa che non sono riconosciute dagli anticorpi anti-p66 (D’Andrea e Zon, 1990; Mayeux et al., 1991). Tuttavia, la loro funzione deve essere determinata.
Il recettore dell’eritropoietina appartiene alla famiglia di tipo 1 dei recettori monotransmembrana delle citochine. Questa famiglia condivide un dominio extracellulare conservato composto da sottodomini di fibronectina di tipo III (FNIII), così come un motivo conservato α-catena citoplasmatica box 1 che si lega selettivamente alle Janus chinasi (JAK) (Bazan, 1990b). La regione extracellulare del recettore dell’eritropoietina contiene due sottodomini FNIII (D1 e D2), che formano una forma a L, con l’asse lungo di ciascun dominio allineato a circa 90° rispetto all’altro asse. Il dominio D1 NH2-terminale consiste di quattro su quattro a-strands, e il dominio D2 di sette a-strands aniparalleli (Livnah et al., 1996). Il dominio D1 forma una piega di tipo H con una topologia ibrida FNIII/immunoglobina-like, e due coppie distali di residui di cisteina formano ponti disolfuro. Il dominio D2 prossimale alla membrana si ripiega con una topologia FNIII standard di tipo s, e contiene un motivo WSXWS conservato (cioè triptofano-serina-qualsiasi aminoacido-triptofano-serina), che è importante per il ripiegamento del recettore dell’eritropoietina (Quelle et al., 1992). I domini D1 e D2 contribuiscono insieme a sei loop per le interazioni con l’eritropoietina. La regione citoplasmatica che è ricca di aminoacidi prolina, glutamina e aspartasi contiene un dominio box 1 (residui 257-264) che è specifico per JAK2 (Zhuang et al., 1994; Jiang et al, 1996), un dominio box 2 (residui 303-313), e otto siti di fosfotirosina (Tyr 343, 401, 429, 431, 443, 460, 464, 479) che mediano il reclutamento di effettori codificanti il dominio Src homology-2 (SH2). Un box2 esteso (residui 329-372) è essenziale per legare il recettore tirosin-chinasico KIT dopo l’attivazione da parte del suo ligando e causa la fosforilazione della tirosina del recettore dell’eritropoietina indicando un’interazione funzionale tra i due recettori (Wu et al., 1995a). L’eritropoietina attiva il recettore dell’eritropoietina tramite dimerizzazione (Philo et al., 1996). Una molecola p66 lega l’eritropoietina con alta affinità (Kd circa 1 nM), l’altra con un’affinità inferiore (Kd circa 2 μM). Usando mutazioni e delezioni, i siti attivi dell’eritropoietina sono stati mappati (Boissel et al., 1993; Wen et al., 1994; Elliott et al., 1997). Anticorpi monoclonali bivalenti, ma non monovalenti, diretti al dominio extracellulare del recettore dell’eritropoietina inducono la proliferazione delle linee cellulari eritropoietina-dipendenti e la formazione di BFU-E, suggerendo un’attivazione del recettore attraverso la sua dimerizzazione (Elliot et al., 1996). Lo stesso effetto può essere ottenuto utilizzando piccoli peptidi mimetici dell’eritropoietina (EMP) (Livnah et al., 1996; Wrighton et al., 1996). Sebbene gli EMP non condividano alcuna omologia di sequenza con l’eritropoietina, si legano specificamente al recettore dell’eritropoietina. Mutazioni puntiformi nel dominio extracellulare (R129C, E132C o E133C) formano legami disolfuro e attivano costitutivamente anche il recettore (Watowich et al., 1994). In particolare, la mutazione del residuo arginina 129 in cisteina è oncogena e induce l’eritroleucemia (Longmore e Lodish, 1991). Al contrario, EMP33 è in grado di dimerizzare, ma non di attivare, il recettore indicando un ruolo essenziale del cambiamento conformazionale nel recettore dimerizzato per la sua segnalazione (Livnah et al., 1998; Remy et al., 1999). È stata proposta l’esistenza di dimeri inattivi preformati del recettore sulla superficie cellulare, mediati dalle regioni D1-D2 che intervengono e che forniscono una separazione di 79 A alla base dei loro domini extracellulari (Livnah et al., 1996). Dopo aver legato un agonista, i domini extracellulari del recettore cambiano la loro struttura in un orientamento definito con una spaziatura di 39 Å, fornendo un adattamento dei loro componenti citoplasmatici e portando alla segnalazione (Wilson e Jolliffe, 1999).
Oltre a legare l’eritropoietina, il recettore dell’eritropoietina può essere attivato da altri meccanismi. La proteina dell’involucro gp55 codificata dal virus Friend murino induce l’eritroleucemia nei topi dopo aver legato e attivato il recettore dell’eritropoietina murina (Wolff e Ruscetti, 1985; Li et al., 1990). Inoltre, i peptidi sintetici che non condividono alcuna omologia di sequenza con l’eritropoietina sono in grado di stimolare il recettore dell’eritropoietina (vedi sotto).