Abstract
Dalla scoperta iniziale che un sottogruppo di pazienti con melanoma cutaneo ospita mutazioni BRAF, una ricerca sostanziale si è concentrata nel determinare le conseguenze patologiche delle mutazioni BRAF, ottimizzando le tecniche diagnostiche per identificare queste mutazioni, e sviluppando interventi terapeutici per inibire la funzione di questo target nei tumori portatori di mutazioni. Recentemente, sono stati fatti progressi che stanno rivoluzionando lo standard di cura per i pazienti con melanoma BRAF mutante. Questo articolo fornisce una panoramica sulle ramificazioni patogenetiche della segnalazione BRAF mutante, gli ultimi metodi di test molecolari per rilevare le mutazioni BRAF e i dati clinici più recenti degli inibitori del percorso BRAF in pazienti con melanoma e mutazioni BRAF. Infine, vengono discussi i meccanismi emergenti di resistenza agli inibitori BRAF e i modi per superare questa resistenza.
1. Introduzione
Il melanoma è attualmente il 5° e 7° cancro più comune negli uomini e nelle donne americane, rispettivamente. Inoltre, l’incidenza del melanoma è aumentata drammaticamente negli ultimi 60 anni, aumentando più velocemente di tutti gli altri tumori solidi. Anche se i pazienti allo stadio iniziale possono essere trattati con successo con la resezione chirurgica nella maggior parte dei pazienti, molti svilupperanno una malattia diffusa. La prognosi per i pazienti con metastasi a distanza dal melanoma è triste, e nonostante il trattamento standard, più del 95% dei pazienti con melanoma in stadio IV morirà entro cinque anni e la maggior parte dei pazienti soccomberà entro un anno.
Più recentemente, le scoperte precliniche hanno portato a significativi progressi nella comprensione degli eventi di segnalazione molecolare chiave alla base della patogenesi del melanoma. In particolare, un’alta percentuale di tumori di origine melanocitica ha dimostrato di ospitare mutazioni attivanti di BRAF, che portano alla sua attività costitutiva. Circa il 70-80% dei nevi melanocitici acquisiti e il 40-60% del melanoma maligno contengono una mutazione di BRAF, la maggior parte della quale risulta in un singolo cambiamento di aminoacido al codone 600 (BRAFV600E). La risultante attivazione non contrastata e costitutiva della chinasi regolata dal segnale extracellulare (ERK) porta alla promozione della crescita cellulare e all’opposizione dell’apoptosi e, infine, alla trasformazione in melanoma. Questa segnalazione potenziata, tuttavia, rende anche le cellule mutate suscettibili all’uso di inibitori di piccole molecole che mirano a vari mediatori della via BRAF.
2. Segnalazione RAF e patogenesi del melanoma
L’interazione tra un recettore del fattore di crescita e il suo ligando induce tipicamente una serie di eventi, che promuovono la crescita e la sopravvivenza cellulare. I membri della famiglia RAS sono GTPasi che agiscono come mediatori critici nella trasduzione di tali segnali. Sebbene RAS svolga un ruolo importante nell’omeostasi del normale ricambio, morte e sopravvivenza delle cellule, mutazioni attivanti nei membri della famiglia RAS (HRAS, KRAS e NRAS) sono state identificate e associate a vari tumori maligni umani. Nel melanoma, le mutazioni NRAS sono state identificate nel 10-25% dei campioni di tumore e si pensa che siano un importante driver di oncogenesi in questi pazienti. L’oncogenesi è mediata attraverso l’upregulation di diversi meccanismi di segnalazione a valle, in particolare la proteina chinasi attivata da mitogeni (MAPK) e la via della phophatidy-inositol-3-kinase (PI3K).
RAS attivato innesca l’attivazione della via MAPK attraverso le interazioni con le oncoproteine RAF (BRAF e CRAF) portando all’inizio di una cascata di segnalazione di progressione. Non è chiaro se sia BRAF o CRAF a trasmettere il segnale da NRAS mutato a MEK, ma la preponderanza delle prove suggerisce che CRAF è il mediatore primario. RAF interagisce con la MAPK/ERK chinasi (MEK) iniziando così la fosforilazione di MEK che a sua volta porta a una fosforilazione attivante di ERK. L’attivazione di ERK porta ad un segnale di progressione e trasformazione, che sembra essere fondamentale per la patogenesi di molti tumori maligni. Questo percorso può essere avviato da entrambe le isoforme RAF, BRAF o CRAF, anche se CRAF ha anche effetti pro-sopravvivenza, in parte attraverso l’upregolazione delle proteine anti-apoptotiche, fattore nucleare kappa B (NF-κB) e leucemia a cellule B 2 (BCL-2). È interessante notare che, a differenza di CRAF, BRAF attivato non ha altri substrati noti. Così, i melanomi mutanti BRAF segnalano esclusivamente attraverso MEK e successivamente ERK portando all’oncogenesi. Questa caratteristica rende questi tumori squisitamente sensibili ai potenti inibitori della via MAPK.
3. Diagnostica/rilevamento
Dall’identificazione delle mutazioni attivanti di BRAF nel melanoma, la tecnologia di rilevamento è migliorata notevolmente. I test mutazionali standard per BRAF nel tessuto tumorale utilizzano tipicamente tecniche come il sequenziamento fluorescente diretto bidirezionale e la reazione a catena della polimerasi allele-specifica, che sono disponibili in commercio e offrono un’alta specificità. La sensibilità di questi test, tuttavia, è limitata in quanto sono solo in grado di rilevare la mutazione se le cellule tumorali costituiscono >5-10% del campione sottoposto ad analisi genetica. Mentre questo grado di sensibilità è tipicamente sufficiente per rilevare la presenza della mutazione BRAFV600E in un nodulo tumorale omogeneo, questo non è probabilmente abbastanza sensibile per rilevare poche cellule tumorali sullo sfondo di un’alta percentuale di elementi stromali o linfatici, linfociti infiltranti, o cellule del sangue periferico.
Una preoccupazione riguardante l’utilizzo di tecniche di rilevamento delle mutazioni con una maggiore sensibilità è che un test positivo potrebbe effettivamente riflettere il rilevamento di un piccolo sottoinsieme di cellule mutanti. Mentre questo potrebbe avere interessanti conseguenze scientifiche, la rilevanza clinica di un tumore contenente una piccola quantità di cellule BRAF mutanti è nulla, poiché non ci si aspetta che questi pazienti beneficino degli inibitori BRAF. Questa preoccupazione è giustificata, poiché l’eterogeneità tumorale è stata descritta nei melanomi primari. Inoltre, mentre le mutazioni BRAF sono viste nella grande maggioranza dei nevi melanocitici, nei melanomi in fase di crescita verticale e nel melanoma metastatico, esse sono raramente rilevate nei melanomi in fase di crescita radiale (10%), che si pensa essere la lesione maligna iniziale prima di una lesione francamente invasiva. Questo suggerisce che la mutazione BRAF può effettivamente essere un evento acquisito nel melanoma precoce che porta all’espansione clonale e alla progressione del tumore. Tale policlonalità non è stata vista in singoli tumori metastatici né quando i tumori in più siti da singoli pazienti sono campionati. Tuttavia, l’applicazione dell’analisi mutazionale a sensibilità aumentata potrebbe non essere solo l’analisi di campioni tumorali, ma il rilevamento di piccoli numeri di cellule tumorali rappresentative in uno sfondo di cellule non maligne, come nei linfonodi e nel sangue periferico.
Sono state sviluppate tecniche e saggi più avanzati che forniscono una maggiore sensibilità o ovviano alla necessità di una maggiore sensibilità. Questi test di nuova generazione permettono test più accurati su campioni che contengono solo una piccola quantità di tumore, così come la rilevazione di mutazioni in vari componenti del sangue periferico (cioè, linfociti, cellule mononucleate, plasma, siero). L’utilità di molti di questi test sono stati esplorati in campioni di pazienti con melanoma con risultati variabili.
I sistemi di mutazione refrattari all’amplificazione (ARMS) sono una tecnica allele-specifica recentemente descritta che ha una maggiore sensibilità (in grado di rilevare campioni di mutazioni contenenti l’1% di cellule mutanti) rispetto al sequenziamento standard del DNA di tessuti fissati in paraffina (FFPE). Un altro approccio che aumenta notevolmente la sensibilità per il rilevamento delle mutazioni è l’utilizzo di saggi che amplificano selettivamente il DNA/RNA mutante in un campione. Utilizzando una combinazione di primer allele-specifici e primer di acidi nucleici bloccati, è stato descritto il rilevamento di 10 cellule di melanoma in 1 mL di sangue. Un terzo approccio per aumentare la sensibilità del rilevamento delle mutazioni è riportato per essere in grado di rilevare una cellula mutante in un migliaio di cellule non-mutanti, approfittando di un sito unico enzima di restrizione negli alleli wild-type che permette la digestione degli alleli wild-type e quindi l’arricchimento degli alleli mutanti. Infine, l’incorporazione di COLD-PCR porta a un quasi raddoppio della sensibilità nel rilevamento della mutazione BRAF dal tessuto FFPE quando si usa il sequenziamento standard e il pirosequenziamento.
Oltre alle nuove tecnologie (ARMS) e alle modifiche delle tecniche di routine che portano a una maggiore sensibilità di rilevamento delle mutazioni, l’applicazione di saggi standard su campioni precedentemente non testati sta anche cambiando il nostro approccio ai test BRAF. L’analisi BRAF sul DNA libero nel siero e nel plasma è stata segnalata così come il rilevamento di mutazioni BRAF da cellule tumorali circolanti isolate (CTC). Mentre l’analisi BRAF su CTC, siero e plasma sembra possibile, è ancora da determinare se ci sarà un uso clinico di routine per uno o più di questi test o se questo rimarrà solo un approccio sperimentale.
Mentre il ruolo della diagnostica molecolare standard e sperimentale viene utilizzato per identificare mutazioni specifiche di interesse (ad esempio, BRAFV600E), sia nei tessuti che nel sangue, può anche essere utile testare per altre mutazioni e anomalie in quanto queste possono indicare la sensibilità a un particolare trattamento. Ad esempio, la tecnologia Sequenom MassARRAY viene utilizzata per interrogare pannelli più ampi di mutazioni oncogene, utilizzando una reazione di estensione del primer seguita dalla spettrometria di massa per rilevare i prodotti e identificare le mutazioni con potenziali conseguenze cliniche. L’ibridazione comparativa del genoma Array (aCGH) offre l’opportunità di esaminare l’intero genoma per i cambiamenti del numero di copie, comprese le amplificazioni e le delezioni che possono conferire sensibilità a una terapia mirata. Tuttavia, tutte queste tecnologie sono ovviamente limitate in quanto possono identificare solo anomalie note e preselezionate. L’analisi del genoma intero (WGA) ha il potenziale non solo di consolidare tutte o la maggior parte di queste modalità e test in una singola piattaforma tecnologica, ma anche di identificare ulteriori cambiamenti genetici al di fuori dei parametri di progettazione di questi altri saggi. WGA offre anche l’opportunità di scoprire mutazioni precedentemente sconosciute (forse specifiche del paziente) nei genomi del melanoma e di esplorare se particolari profili di mutazioni o polimorfismi possono essere predittivi di beneficio da una particolare terapia (ad esempio, inibitori BRAF, HD IL-2). Ancora, l’utilità clinica di questi test di “prossima generazione” nella cura dei pazienti con melanoma è completamente sconosciuta.
4. Inibitori della segnalazione RAF (da meno a più specifici mutanti BRAF, CRAF, MEK, forse menzionare inibitori ERK)
Sono stati sviluppati una serie di inibitori di piccole molecole che mirano, con varia selettività, al BRAF wild-type, BRAFV600E, altri mutanti BRAF (in posizione 600 e 601), e CRAF. Inoltre, si stanno sviluppando anche inibitori dei mediatori a valle dell’attivazione di RAF, cioè MEK ed ERK. In questa sezione, vengono rivisti solo gli agenti che sono stati testati clinicamente e riportati pubblicamente.
5. Inibitori BRAF
5.1. Sorafenib
Sorafenib, un inibitore tirosin-chinasico multitarget di BRAF, CRAF, recettore del fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGFR), recettore del fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGFR) 2, p38 e CKIT, è stato il primo inibitore di RAF attivamente studiato nei pazienti con melanoma, poiché era disponibile per la sperimentazione di fase II nello stesso anno in cui le mutazioni BRAF furono segnalate per la prima volta. Purtroppo, nonostante sia stato valutato in numerosi studi di fase I, II e III come agente singolo e in combinazione con la chemioterapia, l’utilità clinica del sorafenib è stata deludente. Per esempio, in uno studio ad agente singolo di sorafenib, la sopravvivenza mediana libera da progressione per i pazienti con melanoma era di 11 settimane. Sei pazienti (16%) avevano una malattia stabile a 6 mesi che persisteva per più di 12 mesi in alcuni casi. Tuttavia, solo uno dei 37 pazienti nello studio ha avuto una risposta effettiva dei criteri di valutazione della risposta nel tumore solido (RECIST-) definito tumore.
Questo studio è stato seguito da diverse prove di sorafenib in combinazione con vari agenti citotossici, anche se la combinazione che è stata meglio studiata era sorafenib, carboplatino e paclitaxel. La promessa iniziale con questo regime è stata descritta in uno studio di fase I di sorafenib in combinazione con carboplatino e paclitaxel in pazienti con tumori solidi, dove sono stati arruolati 24 pazienti con melanoma avanzato. Dieci pazienti con melanoma (42%) hanno ottenuto una risposta obiettiva, e altri 11 pazienti (46%) hanno avuto una malattia stabile in base al RECIST. La sopravvivenza mediana libera da progressione è stata di 43,7 settimane. Questi risultati promettenti hanno portato a uno studio di fase III che confrontava carboplatino/paclitaxel ± sorafenib in pazienti con melanoma che era progredito dopo la terapia con temozolomide o DTIC. Questo studio (lo studio PRISM) ha arruolato 270 pazienti e non ha mostrato alcun beneficio per l’aggiunta di sorafenib al carboplatino/paclitaxel in questa popolazione di pazienti di seconda linea. La combinazione di carboplatino/paclitaxel e sorafenib è stata anche confrontata con carboplatino/paclitaxel in una popolazione naïve al trattamento di pazienti con melanoma avanzato in uno studio randomizzato di fase III controllato con placebo eseguito nell’ambito dell’Intergruppo Stati Uniti (E2603). Questo studio ha arruolato 800 pazienti e non ha trovato alcun beneficio per l’aggiunta di sorafenib su PFS mediana o OS. Inibitori BRAF più potenti (PLX4032, GSK2118436)
Una delle principali spiegazioni proposte per l’inefficacia di sorafenib come agente singolo nei pazienti con melanoma è la sua incapacità di inibire completamente BRAF, e in particolare, BRAF contenente la mutazione V600E. Altri inibitori di BRAF, come PLX-4032 e GSK2118436, sono stati sviluppati e sono inibitori più potenti e selettivi di BRAF mutante rispetto a sorafenib. Questa maggiore inibizione di BRAFV600E ha prevedibilmente portato a una migliore attività clinica di questi agenti rispetto a sorafenib.
5.3. Vemurafenib
Vemurafenib è stato il primo inibitore BRAF di maggiore potenza a completare la sperimentazione di fase I e a mostrare un significativo beneficio clinico. Nello studio di fase I di PLX4032, 11 dei 16 pazienti con tumori recanti la mutazione BRAFV600E che hanno ricevuto una dose ≥240 mg due volte al giorno nella fase di escalation della dose hanno sperimentato risposte tumorali, mentre nessuna risposta clinica è stata vista nei cinque pazienti con tumore contenente BRAF wild-type. Inoltre, 26 dei 32 (81%) pazienti con melanomi mutanti BRAFV600E trattati in una coorte di espansione alla dose raccomandata di fase II di 960 mg due volte al giorno hanno avuto una risposta clinica, compresi due pazienti che hanno ottenuto una risposta completa (CR). La PFS mediana stimata è stata di sette mesi, che si confronta favorevolmente con le terapie precedentemente disponibili per il melanoma metastatico. Inoltre, il trattamento con vemurafenib porta ad una riduzione dei livelli di ERK fosforilato (pERK) nei tumori contenenti la mutazione BRAFV600E che è associata alla risposta clinica. Probabilmente, questa inibizione di pERK aumenta lo splicing del membro proapoptotico della famiglia BCL-2 BIM promuovendo così l’apoptosi delle cellule BRAFV600E.
Questi risultati hanno rapidamente portato al rapido reclutamento di uno studio di fase II a singolo agente (BRIM2) e di uno studio randomizzato controllato di fase III (BRIM3). Lo studio di fase II ha arruolato 132 pazienti con melanoma avanzato che avevano ricevuto una terapia precedente. Il tasso di risposta obiettiva (ORR) era del 53% con un tasso di CR del 5%, e la sopravvivenza libera da progressione era di 6,7 mesi. Nello studio di fase III, 675 pazienti con melanoma avanzato sono stati randomizzati al vemurafenib o alla dacarbazina come terapia di prima linea. Alla prima analisi ad interim, il trattamento con vemurafenib è stato associato ad una significativa riduzione del rischio di morte e del rischio di morte (riduzione del 63%) o di progressione della malattia (riduzione del 74%), così come un ORR molto più alto (48% contro 5%). Questi risultati sono serviti come base per l’approvazione di vemurafenib da parte della FDA nell’agosto 2011.
5.4. GSK2118436
GSK2118436 è un secondo inibitore BRAF più potente che ha mostrato una sostanziale attività clinica. In uno studio di fase I/II, simile a PLX4032, i pazienti con la mutazione BRAFV600E trattati ai due livelli di dose più alti (150 mg due volte al giorno e 200 mg due volte al giorno) hanno avuto un alto tasso di risposta (10/16 pazienti, 63%). Negli otto pazienti con mutazioni non BRAFV600E (V600K, V600G e K601E) trattati con una dose ≥100 mg due volte al giorno, tre hanno avuto una risposta parziale. Entrambi i pazienti con BRAFK601E sono progrediti dopo la prima ristadiazione, suggerendo che solo i pazienti con mutazioni BRAF in posizione 600 risponderanno alla terapia.
6. Inibitori MEK
Gli inibitori di MEK, il mediatore a valle dell’attivazione di RAF, e l’unico substrato noto di BRAF hanno mostrato promesse in studi preclinici nel melanoma e hanno iniziato a essere studiati nella clinica con alcuni risultati incoraggianti. Gli inibitori MEK possono anche essere più utili nei pazienti con mutazione BRAFV600E; poiché lo stato mutazionale correla fortemente con la risposta all’inibizione MEK nei modelli xenograft di melanoma murino. AZD6244
Due studi di fase I di AZD6244 che hanno coinvolto pazienti con tumori solidi avanzati hanno dimostrato che questo agente è ben tollerato e possiede una certa attività antitumorale in pazienti con melanoma. Nel primo studio, tre degli otto pazienti con melanoma avanzato trattati con AZD6244 hanno ottenuto una risposta parziale; lo stato mutazionale di BRAF e NRAS non era disponibile. Mentre nel secondo studio di fase I, solo una risposta è stata vista in quattordici pazienti con melanoma, anche se questo soggetto aveva una mutazione BRAF documentata e una risposta completa in corso da oltre due anni al momento della pubblicazione.
Inoltre, AZD6244 ha mostrato risultati promettenti in modelli murini, in particolare in combinazione con la chemioterapia, ponendo le basi per studi di combinazione. Basandosi su questo, è stato eseguito uno studio pilota di AZD6244 in combinazione con dacarbazina, docetaxel o temsirolimus in pazienti con melanoma avanzato. Sono stati trattati diciotto pazienti in cui lo stato mutazionale di BRAF e NRAS era noto. La risposta clinica è stata osservata in cinque dei nove pazienti (55%) con una mutazione BRAF, mentre nessuna risposta è stata osservata in nessuno dei nove pazienti senza una mutazione BRAF, che includeva quattro pazienti con una mutazione NRAS. Inoltre, il tempo alla progressione è stato significativamente migliorato nei pazienti con una mutazione BRAF rispetto ai pazienti senza (31 settimane mediane contro 8 settimane).
6.2. GSK1120212
GSK1120212 è un inibitore reversibile e selettivo di MEK1/MEK2 che ha dimostrato, in uno studio di fase I, di avere un’efficacia come singolo agente in pazienti con melanoma avanzato mutante BRAFV600E. In particolare, otto dei 20 pazienti con melanoma mutante BRAF trattati con GSK2110212 hanno avuto una risposta confermata con due pazienti che hanno raggiunto una CR. È interessante notare che due dei 22 pazienti con BRAF wild-type hanno avuto un PR con il trattamento, suggerendo che alcuni tumori del melanoma sono dipendenti dalla segnalazione di ERK/MAP kinase nonostante l’assenza di una mutazione BRAF.
6.3. PD-0325901
Una sperimentazione di fase I di PD-0325901 ha arruolato 48 pazienti con melanoma avanzato, di cui 3 (6%) hanno avuto una PR confermata, 10 (21%) hanno avuto una malattia stabile per ≥4 mesi, e un totale di 15 (31%) pazienti hanno mostrato una riduzione della colorazione tumorale Ki-67. I dati dell’analisi mutazionale di questi pazienti non sono stati forniti.
6.4. AS703026
Risultati simili sono stati recentemente riportati con AS703026, che è un potente inibitore MEK1/2. Nello studio di fase I, tre degli otto pazienti hanno avuto una risposta parziale con il trattamento in uno dei due schemi di trattamento. Lo stato mutazionale dei pazienti con melanoma non è stato riportato.
Mentre i dati clinici sugli inibitori MEK sono incoraggianti, sono abbastanza preliminari. Il vero valore di questi agenti deve attendere gli studi di fase II e III nei pazienti con melanoma BRAF mutante. Uno di questi studi, attualmente in corso, è uno studio randomizzato di fase III di GSK1220212 rispetto alla chemioterapia (dacarbazina o paclitaxel) in pazienti con melanoma con mutazioni BRAF (NCIT01245062).
7. Meccanismi emergenti di resistenza all’inibizione di BRAF
Importante, sembra che la grande maggioranza dei pazienti trattati con un singolo agente PLX-4032 alla fine mostrerà una progressione della malattia nonostante il successo dell’inibizione di BRAFV600E e un alto tasso di risposta obiettiva all’inizio del corso della terapia. Gli studi preliminari suggeriscono che la resistenza a PLX-4032 non è legata allo sviluppo di una seconda mutazione che compromette il legame del farmaco di trattamento a BRAF, un meccanismo di resistenza notato per la terapia mirata in altri tumori maligni come il cancro del polmone non a piccole cellule, la leucemia mieloide cronica e il tumore stromale gastrointestinale. Invece, la resistenza è mediata dalla riattivazione della via MAPK nella maggior parte dei tumori attraverso mezzi alternativi.
È dagli studi in vitro delle cellule BRAFV600E-mutate che sono state generate per mostrare la resistenza acquisita agli inibitori BRAF, che ha portato ai primi indizi su come le cellule BRAF-mutate sono in grado di sopravvivere all’inibizione BRAF. Sembra chiaro che il ristabilimento della segnalazione MAPK è la variabile chiave nella resistenza acquisita all’inibizione di BRAF. Questo può essere ottenuto attraverso l’upregolazione delle tirosin-chinasi recettoriali (cioè, PDGFRB, ERBB2), l’attivazione di RAS, l’upregolazione di CRAF, l’attivazione delle chinasi Ser/Thr MAPK (COT) e lo sviluppo di una mutazione secondaria attivante in MEK. Inoltre, la segnalazione attraverso la via PI3K avviata dal recettore 1 del fattore di crescita dell’insulina (IGF-1R) è un meccanismo alternativo di resistenza acquisita che è stato anche descritto. Da notare che ognuno di questi meccanismi è stato studiato e corroborato in un piccolo numero di campioni tumorali di pazienti che avevano biopsie eseguite al momento della resistenza, e la dipendenza da questi mediatori di segnalazione upregolati o mutati non è stata dimostrata.
La resistenza primaria all’inibizione di BRAF è vista in meno del 10% dei pazienti con melanoma BRAF mutante trattati con vemurafenib. Sebbene non vi siano dati provenienti da campioni clinici che aiutino a identificare i pazienti che probabilmente non trarranno beneficio dagli inibitori BRAF, gli studi preclinici suggeriscono che elevati livelli pretrattamento di CRAF, così come l’amplificazione CCND1 al basale nei tumori, che porta alla sovraespressione a valle della ciclina D1 e all’espressione CDK4 potenziata, sono promettenti biomarcatori pretrattamento che meritano ulteriori indagini.
Nelle cellule di melanoma BRAF wild-type (BRAFWT), la via della chinasi MAPK viene attivata da vemurafenib (e l’analogo PLX4720), portando all’upregolazione di MEK ed ERK e ad una maggiore proliferazione. Questo sembra essere secondario all’attivazione di CRAF con successiva segnalazione a valle attraverso MEK e ERK con conseguenze oncogene attese nelle cellule BRAFWT. Inoltre, questa attivazione CRAF sembra essere mediata attraverso la formazione di un eterodimero con la proteina BRAFWT e/o l’omodimero CRAF che è più evidente nelle cellule RAS-mutate. Inoltre, PLX4720 aumenta i livelli della proteina antiapoptotica MCL-1, membro della famiglia BCL-2, nelle cellule di melanoma mutanti NRAS attraverso una maggiore segnalazione attraverso la via MAPK. Mentre è chiaro che l’attivazione di CRAF e la segnalazione potenziata del percorso MAPK si verificano nelle cellule di melanoma BRAFWT (in particolare quelle che ospitano una mutazione NRAS) trattate con inibitori BRAF come vemurafenib e PLX4720, la rilevanza clinica di questo è incerta. In particolare, non si pensa che la resistenza clinicamente acquisita a vemurafenib, per esempio, si verifichi solo a causa della crescita di un sottoinsieme di cellule di melanoma BRAFWT, poiché la persistenza della mutazione BRAFV600E è stata identificata in tutti i tumori analizzati e riportati finora. Infatti, sembra che i cambiamenti specifici nelle cellule BRAFV600E-mutate permettano adattamenti che portano ad una nuova crescita nonostante la continua inibizione di BRAF.
8. Direzioni future
L’affermazione dell’efficacia come singolo agente degli inibitori selettivi di BRAF, e in misura minore degli inibitori MEK, è un importante passo avanti per il trattamento dei pazienti con melanoma positivo alla mutazione BRAF. Anche se la maggior parte dei pazienti trattati con questi agenti sono destinati a progredire nel trattamento, l’elucidazione dei meccanismi di resistenza sopra descritti aiuta a guidare la futura terapia sequenziale e combinatoria. Sulla base della scoperta che l’attività del percorso MAPK è riattivata nel melanoma dopo l’inibizione selettiva di BRAF, il primo studio di combinazione di un inibitore selettivo di BRAF (GSK2118436) con un inibitore MEK (GSK1120212) è in corso e sembra tollerabile con entrambi gli agenti somministrati alle loro dosi standard a singolo agente. Oltre a questa combinazione, le prove con inibitori BRAF selettivi in combinazione con o seguiti da antagonisti IGF-R1 e altri inibitori della tirosin-chinasi del recettore potrebbero essere anticipate dai risultati dei modelli preclinici di resistenza.
Un altro approccio per migliorare l’efficacia degli inibitori selettivi di BRAF e degli inibitori MEK è l’aggiunta di agenti che potrebbero aumentare l’apoptosi. Uno di questi agenti è ABT-263 che è un BH3-mimetico attualmente in sviluppo clinico. In studi preclinici, l’omologo BH3-mimetico ABT-737, meno biodisponibile, in combinazione con un inibitore MEK ha portato a una maggiore letalità rispetto a entrambi gli agenti da soli. Se ABT-263 in combinazione con MEK o inibitori selettivi di BRAF migliorerà i risultati clinici non è noto, anche se forse vale la pena esplorare in uno studio clinico in fase iniziale.
Oltre alla terapia di combinazione con agenti a bersaglio molecolare che inibiscono la segnalazione indotta dall’inibizione selettiva di BRAF o promuovono l’apoptosi, un altro approccio promettente per massimizzare il beneficio degli inibitori BRAF o MEK è quello di combinare questi agenti con l’immunoterapia. Recentemente, gli inibitori del checkpoint immunitario, tra cui l’anticorpo monoclonale anti-CTLA-4 ipilimumab e l’anticorpo monoclonale anti-PD MDX-1106, hanno mostrato un’efficacia come singolo agente in pazienti con melanoma metastatico. È importante notare che PLX4032 non influisce negativamente sulla funzione dei linfociti T umani (cellule T), mentre gli inibitori MEK lo fanno. Inoltre, vemurafenib ha dimostrato di migliorare il riconoscimento immunitario da parte delle cellule T antigene-specifiche nel melanoma. Questi risultati forniscono un razionale per uno studio che valuta la sicurezza e l’efficacia dell’inibizione selettiva di BRAF in combinazione con l’immunoterapia, tra cui ipilimumab, MDX1106 e possibilmente IL2 ad alte dosi.
9. Conclusioni
Si è sperato per molti anni che la crescente comprensione delle vie molecolari coinvolte nello sviluppo del melanoma e la crescente disponibilità di inibitori specifici di queste vie avrebbe permesso lo sviluppo razionale di terapie future. Con l’emergere di vemurafenib e GSK2118436, i primi agenti a bersaglio molecolare a portare a risposte tumorali in una grande percentuale di pazienti, è iniziato un nuovo approccio al trattamento del melanoma. Di conseguenza, tutti i pazienti con melanoma avanzato dovrebbero avere un’analisi mutazionale BRAF prima di iniziare la terapia sistemica. In quei pazienti i cui tumori ospitano una mutazione in BRAF, ogni tentativo dovrebbe essere fatto per trattare questi pazienti con uno dei due inibitori BRAF altamente potenti. Inoltre, man mano che si impara di più sui meccanismi di resistenza agli inibitori di BRAF, ci si può aspettare lo sviluppo di studi di combinazione di nuove terapie a bersaglio molecolare; ulteriori miglioramenti clinici possono essere risolti solo da studi preclinici e clinici accuratamente condotti che includono biopsie pretrattamento e su trattamento. Avendo stabilito che BRAF è il primo punto di vulnerabilità nel melanoma, si spera che una comprensione molecolare dei limiti dell’inibizione di BRAF possa portare a ulteriori benefici clinici.